張金璐，陳新林，呂海俠，劉 勇，羅國(guó)剛

(西安交通大學(xué)：1. 第一附屬醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，陜西西安 710061；2. 醫(yī)學(xué)部神經(jīng)生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室，陜西西安 710061)

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c-Jun氨基末端激酶信號(hào)通路參與電刺激大鼠三叉神經(jīng)節(jié)偏頭痛模型降鈣素基因相關(guān)肽表達(dá)調(diào)控

張金璐1，陳新林2，呂海俠2，劉 勇2，羅國(guó)剛1

(西安交通大學(xué)：1. 第一附屬醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，陜西西安 710061；2. 醫(yī)學(xué)部神經(jīng)生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室，陜西西安 710061)

目的 探究c-Jun氨基末端激酶(c-Jun N-Terminal Kinase, JNK)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路對(duì)電刺激大鼠三叉神經(jīng)節(jié)(TG)偏頭痛模型中降鈣素基因相關(guān)肽(CGRP)表達(dá)調(diào)控的作用。方法 成年雄性SD大鼠隨機(jī)分為空白對(duì)照組、假手術(shù)組、模型組、DMSO+模型組、SP50+模型組、SP25+模型組。采用電刺激大鼠單側(cè)TG制作偏頭痛模型，選擇JNK信號(hào)通路特異性阻滯劑SP600125為干預(yù)藥物。觀察偏頭痛造模前后的行為學(xué)變化。各組大鼠處理后24 h，Western blot檢測(cè)TG中磷酸化JNK蛋白(p-JNK)和JNK蛋白表達(dá)量并計(jì)算磷酸化比率，免疫組織化學(xué)染色檢測(cè)CGRP表達(dá)量。結(jié)果 大鼠造模后前肢撓頭次數(shù)增加、爬籠次數(shù)減少(P<0.05)。模型組、假手術(shù)組、DMSO+模型組、SP25+模型組大鼠TG內(nèi)p-JNK比率較空白對(duì)照組明顯升高(P<0.05)；SP50+模型組TG內(nèi)p-JNK比率較模型組、SP25+模型組明顯降低(P<0.05)；模型組TG內(nèi)CGRP表達(dá)量較空白對(duì)照組、SP50+模型組明顯升高(P<0.05)；模型組刺激側(cè)TG內(nèi)CGRP表達(dá)量明顯高于未刺激側(cè)。結(jié)論 電刺激大鼠單側(cè)TG可使偏頭痛急性發(fā)作過(guò)程中關(guān)鍵的神經(jīng)血管活性肽CGRP表達(dá)升高，引發(fā)大鼠行為學(xué)變化，且JNK信號(hào)通路參與了TG內(nèi)CGRP的表達(dá)調(diào)控過(guò)程。

偏頭痛；三叉神經(jīng)節(jié)；降鈣素基因相關(guān)肽(CGRP)；JNK；SP600125

偏頭痛是神經(jīng)科一種常見(jiàn)的慢性復(fù)發(fā)性疾病，給患者、家庭和社會(huì)帶來(lái)沉重負(fù)擔(dān)。偏頭痛的發(fā)病機(jī)制尚未完全闡明。較為廣泛接受的是三叉神經(jīng)-血管學(xué)說(shuō)[1]，電刺激大鼠三叉神經(jīng)節(jié)(trigeminal ganglion, TG)可以誘發(fā)三叉神經(jīng)支配區(qū)血漿蛋白外滲[2]、以降鈣素基因相關(guān)肽(calcitonin gene-related peptide, CGRP)為代表的血管活性肽類(lèi)物質(zhì)釋放增加，局部腦膜血流變化等非特異性炎癥反應(yīng)[3-4]。偏頭痛發(fā)作與血清內(nèi)CGRP水平變化的顯著相關(guān)性是三叉神經(jīng)-血管學(xué)說(shuō)的核心[5]。本研究前期實(shí)驗(yàn)證實(shí)細(xì)胞內(nèi)有絲分裂型細(xì)胞內(nèi)絲裂原激活的蛋白激酶(MAPK)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中的ERK1/2和C-Jun氨基末端激酶(JNK)通路均參與了TG離體培養(yǎng)后CGRP表達(dá)上調(diào)[6]。本研究旨在探究JNK信號(hào)通路對(duì)電刺激大鼠TG偏頭痛模型中CGRP表達(dá)的調(diào)控作用。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與器材

同心圓電極(Microprobes公司)；CGRP特異性抗體(Abcam公司，1∶400)；c-Jun氨基末端激酶(JNK)、磷酸化c-Jun氨基末端激酶(p-JNK)特異性抗體(CST公司，1∶10 000)；JNK信號(hào)通路特異性抑制劑SP600125(CST公司)10 mg，溶于二甲基亞砜(DMSO)中制成母液，濃度為25 mmol/L，-20 ℃保存，工作液仍使用DMSO稀釋?zhuān)扑]濃度為20～50 μmol/L。

1.2 動(dòng)物分組及電刺激TG偏頭痛模型制作

選擇SPF級(jí)SD雄性大鼠54只，體質(zhì)量300～400 g，由西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)部實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，并獲得西安交通大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)管理委員會(huì)批準(zhǔn)。

造模電刺激TG偏頭痛模型方法為：100 g/L水合氯醛全身麻醉大鼠并固定，頭頂正中剪毛、“十”字切開(kāi)皮膚，刮除軟組織暴露顱骨表面，標(biāo)記前囟；利用立體定位儀定位右側(cè)(刺激側(cè))前囟后3.2 mm、旁開(kāi)3.0 mm位置，牙科鉆鉆孔，緩慢將電極插入，深度約9.5～10 mm；連接同心圓電極-導(dǎo)線-電流輸出裝置，調(diào)整恒定輸出電流1 mA，周期200 ms，波寬5 ms，持續(xù)時(shí)間5 min[3-4,7]；刺激結(jié)束后，將電極緩慢垂直提拉拔出電極，縫合頭皮切口并擦涂紅霉素軟膏。大鼠側(cè)臥至麻醉復(fù)蘇。觀察大鼠的行為學(xué)變化。

將大鼠隨機(jī)分為對(duì)照組、假手術(shù)組、模型組、DMSO+模型組、SP50+模型組、SP25+模型組。對(duì)照組不做任何手術(shù)處理或者藥物干預(yù)；假手術(shù)組僅在電刺激部位使用牙科鉆打孔，電極插入5 min但不進(jìn)行電刺激；其余各組均造模，其中模型組僅進(jìn)行電刺激TG偏頭痛造模；DMSO+模型組同時(shí)進(jìn)行干預(yù)藥物SP600125的溶劑DMSO側(cè)腦室注射；SP50+模型組、SP25+模型組同時(shí)分別進(jìn)行干預(yù)藥物50、25 μmol/L SP600125側(cè)腦室注射。

1.3 免疫組織化學(xué)法檢測(cè)CGRP表達(dá)

將大鼠用40 g/L多聚甲醛灌注固定，解剖TG進(jìn)行冰凍切片，晾干于4 ℃保存。濕盒中復(fù)溫、PBS溶液浸泡后，用3 mL/L Triton X-100浸泡30 min、PBS沖洗后使用30 mL/L H2O2溶液浸泡10 min并沖洗。用100 mL/L山羊血清室溫封閉1 h，棄去擦干，滴加1∶400兔抗大鼠CGRP抗體，室溫孵育2 h后4 ℃過(guò)夜。次日滴加羊抗兔二抗試劑、辣根過(guò)氧化物酶試劑，室溫分別孵育2 h后沖洗、擦干。配制DAB顯色，脫水、透明、封片。每組選擇>6張10倍鏡圖片，使用Image-Pro Plus 5.0進(jìn)行平均吸光度值(AA)和累積吸光度值(IA)分析。

1.4 Western blot檢測(cè)p-JNK和JNK表達(dá)

將大鼠使用冰生理鹽水灌注固定，解剖TG，提取蛋白并煮樣，進(jìn)行電泳，設(shè)置參數(shù)80 V，30 min；120 V，2 h。轉(zhuǎn)膜后，將PVDF膜置于牛奶中室溫封閉2 h。使用PBST稀釋一抗(1∶10 000)，封膜后室溫孵育2 h、4 ℃搖床過(guò)夜。次日加二抗(1∶5 000)室溫孵育2 h。結(jié)束后PBST洗膜，暗室內(nèi)顯影。對(duì)膠片使用Image J 2X軟件進(jìn)行灰度值(DPI)分析，并利用獲得數(shù)據(jù)計(jì)算每組p-JNK比率。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié) 果

2.1 偏頭痛模型對(duì)大鼠行為學(xué)的影響

圖1 電刺激大鼠三叉神經(jīng)節(jié)模型塑造前后的大鼠行為學(xué)變化

Fig.1 Rats’ behavioral changes before and after the model surgery
A：平均前肢撓頭次數(shù)；B：平均爬籠次數(shù)；C：平均過(guò)度理毛次數(shù)。與造模前比較，*P<0.05。

2.2 偏頭痛模型及SP600125對(duì)JNK磷酸化的影響

各組大鼠分別干預(yù)24 h后，用Western blot檢測(cè)TG內(nèi)JNK與p-JNK，并進(jìn)行灰度值(DPI)分析，進(jìn)一步計(jì)算p-JNK/JNK比率，并進(jìn)行單因素方差分析。結(jié)果顯示，與空白對(duì)照組相比，假手術(shù)組、模型組、DMSO+模型組大鼠TG內(nèi)p-JNK比率明顯升高(P值分別為0.049、0.017、0.009)；假手術(shù)組較對(duì)照組p-JNK比率明顯升高(P=0.049)，而與模型組之間無(wú)明顯差異(P=0.628)，但無(wú)超過(guò)模型組趨勢(shì)；SP50+模型組TG內(nèi)p-JNK比率較模型組明顯降低(P=0.047)，而SP25+模型組無(wú)此趨勢(shì)(P=0.325，圖2)。

2.3 偏頭痛模型及SP600125對(duì)TG內(nèi)CGRP表達(dá)的影響

取空白對(duì)照組、模型組以及SP50+模型組各6只大鼠TG進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色，并進(jìn)行AA和IA分析顯示，模型組TG內(nèi)CGRP IA明顯高于對(duì)照組(P=0.000)和SP50+模型組(P=0.000)，而SP50+模型組與空白對(duì)照組無(wú)明顯差異(P=0.807)。3組之間比較AA差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(圖3、4)。另外，對(duì)于模型組大鼠右(刺激側(cè))、左(未刺激側(cè))TG內(nèi)CGRP表達(dá)情況進(jìn)行檢測(cè)，右側(cè)(刺激側(cè))CGRP表達(dá)情況明顯高于左側(cè)(未刺激側(cè))，P=0.002(圖4)。

圖2 各組大鼠TG內(nèi)JNK和p-JNK表達(dá)及p-JNK/JNK比率變化

Fig.2 The expressions of p-JNK and JNK and the ratio of p-JNK/JNK in each group
A：1～6分別為對(duì)照組、假手術(shù)組、模型組、DMSO+模型組、SP50+模型組、SP25+模型組；B：各組p-JNK/JNK比率：與對(duì)照組比較，*P<0.05；與模型組比較，**P<0.05。

圖3 三叉神經(jīng)節(jié)內(nèi)降鈣素基因相關(guān)肽(CGRP)免疫組織化學(xué)染色

Fig.3 The expression of CGRP in TG detected by immunohistochemistry (×10)
A：空白對(duì)照組；B：SP50+模型組(50 μmol/L SP600125)刺激側(cè)；C：模型組刺激側(cè)；D：模型組未刺激側(cè)(C中黑色箭頭所指為典型CGRP陽(yáng)性細(xì)胞)。

圖4 三叉神經(jīng)節(jié)內(nèi)降鈣素基因相關(guān)肽(CGRP)免疫組織化學(xué)染色結(jié)果的統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

Fig.4 The expression of CGRP in TG detected by immunohistochemistry
A：CGRP陽(yáng)性染色AA比較；B：CGRP陽(yáng)性染色I(xiàn)A比較，3組總體P=0.000，模型組明顯高于對(duì)照組(*P=0.000)和SP50+模型組(**P=0.000)，而對(duì)照組和SP50+模型組間無(wú)明顯差異(P=0.807)。C：模型組CGRP染色I(xiàn)A比較，刺激側(cè)明顯高于未刺激側(cè)，**P=0.002。

3 討 論

根據(jù)解釋偏頭痛發(fā)病機(jī)制的血管源性學(xué)說(shuō)[8]、皮層擴(kuò)散抑制學(xué)說(shuō)[9]、三叉神經(jīng)血管學(xué)說(shuō)，研究人員分別構(gòu)建出了多種偏頭痛動(dòng)物模型。綜合考慮通路激活的特異性、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物復(fù)制難易程度等因素，最終選擇以三叉神經(jīng)血管學(xué)說(shuō)為基礎(chǔ)的電刺激大鼠TG作為本研究的模型。

在三叉神經(jīng)-血管學(xué)說(shuō)中，偏頭痛發(fā)作時(shí)存在無(wú)菌性炎癥、TVS激活及血管舒縮異常等核心過(guò)程[10]，其中起到重要作用的是CGRP。實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果顯示，受到有效刺激后，三叉神經(jīng)的反射活動(dòng)引起CGRP釋放量增多可以導(dǎo)致偏頭痛發(fā)生[11]。CGRP在TG內(nèi)含量最為豐富，其合成表達(dá)量可以作為判斷TG激活程度的標(biāo)志，而在本研究相關(guān)的前期研究也證實(shí)，TG體外培養(yǎng)模型中，存在CGRP釋放增高[6,12-13]。在電刺激大鼠TG時(shí)，可以明顯看到刺激側(cè)的口鼻分泌物增多和咀嚼肌及眼肌收縮，提示電極對(duì)于TG形成了有效刺激。在后續(xù)的蛋白檢測(cè)中發(fā)現(xiàn)，刺激側(cè)的TG內(nèi)CGRP表達(dá)明顯升高，與其他研究學(xué)者進(jìn)行的研究結(jié)果一致[5,14]，證明了該模型科學(xué)有效模擬了TVS的激活過(guò)程。另外，模型組大鼠刺激側(cè)CGRP表達(dá)明顯高于未刺激側(cè)，說(shuō)明起源于一側(cè)的TVS激活所導(dǎo)致的CGRP表達(dá)升高主要限于該側(cè)，這可能是偏頭痛呈現(xiàn)偏側(cè)發(fā)作的機(jī)制之一。

研究表明，多種大鼠偏頭痛模型會(huì)引起其行為學(xué)改變[15-17]，行為學(xué)結(jié)果顯示，電刺激后24 h，大鼠前肢撓頭次數(shù)明顯增加，爬籠次數(shù)明顯減少，過(guò)度理毛次數(shù)前后無(wú)明顯差異。分析該結(jié)果的原因可能為：為了完全消除麻藥對(duì)于行為學(xué)的影響，選擇了手術(shù)后24 h進(jìn)行觀察。在這一過(guò)程中，TG損傷導(dǎo)致的TVS激活態(tài)而引起的生理不適持續(xù)存在，故前肢撓頭次數(shù)增加，而由于時(shí)間過(guò)久大鼠已經(jīng)由躁狂多動(dòng)狀態(tài)轉(zhuǎn)為抑郁，逃跑欲望不強(qiáng)烈，因而導(dǎo)致爬籠次數(shù)的減少。后期需進(jìn)一步擴(kuò)大樣本量、規(guī)范行為學(xué)觀察環(huán)境，完善該模型對(duì)于大鼠行為學(xué)影響的數(shù)據(jù)資料。

JNK系統(tǒng)是MAPK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)的3條信號(hào)通路之一。本研究所在項(xiàng)目的前期實(shí)驗(yàn)進(jìn)行了以體外培養(yǎng)TG模型為基礎(chǔ)的研究，結(jié)果顯示離體TG內(nèi)CGRP水平升高，而MAPK通路中的ERK1/2通路和JNK通路均參與了該調(diào)節(jié)過(guò)程，其中JNK信號(hào)通路起到了更為關(guān)鍵的作用[6]。因此本研究將調(diào)節(jié)CGRP表達(dá)的焦點(diǎn)定位于JNK信號(hào)通路。本研究結(jié)果顯示，電刺激TG可以激活JNK通路，并可被濃度50 μmol/L的SP600125所阻斷；而25 μmol/L濃度組卻未見(jiàn)明顯阻斷，提示SP600125的阻斷作用可能存在劑量依賴(lài)性。本研究的假手術(shù)組大鼠TG也存在部分JNK信號(hào)蛋白激活，可能與電極插入所帶來(lái)的機(jī)械性損傷有關(guān)，說(shuō)明機(jī)械損傷可能也會(huì)激活JNK信號(hào)通路，機(jī)械刺激和電刺激可相互疊加，JNK信號(hào)通路的活化過(guò)程。

為了驗(yàn)證JNK信號(hào)通路是否參與了CGRP表達(dá)的調(diào)控，本研究對(duì)比了模型組和SP50+模型組大鼠TG內(nèi)CGRP的表達(dá)，結(jié)果顯示：模型組大鼠TG內(nèi)CGRP陽(yáng)性顆粒的累積吸光度值(IA)明顯高于SP50+模型組大鼠，提示JNK信號(hào)通路特異性阻斷劑SP600125可以阻斷CGRP的升高，提示JNK信號(hào)通路參與了電刺激大鼠TG所介導(dǎo)的CGRP的表達(dá)上調(diào)的調(diào)控過(guò)程。

綜合以上分析，認(rèn)為該模型可以模擬偏頭痛發(fā)作過(guò)程，過(guò)程中存在JNK信號(hào)通路的激活，并介導(dǎo)了刺激側(cè)CGRP表達(dá)升高。目前偏頭痛的治療已經(jīng)由單純干預(yù)血管舒張所引發(fā)的癥狀，發(fā)展為特異性阻斷CGRP受體來(lái)直接調(diào)節(jié)血管舒縮情況，其針對(duì)性、特異性、精細(xì)程度均有了長(zhǎng)足的進(jìn)步。本實(shí)驗(yàn)在前期研究的基礎(chǔ)上，在大鼠活體水平證實(shí)了JNK信號(hào)通路參與偏頭痛發(fā)病過(guò)程中重要分子CGRP的表達(dá)調(diào)控，為進(jìn)一步從分子水平研究安全有效的JNK抑制劑，從更上游水平阻斷甚至預(yù)防偏頭痛發(fā)病提供基礎(chǔ)研究數(shù)據(jù)。

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(編輯 國(guó) 榮)

The mechanism of c-Jun N-terminal kinase signaling transduction pathway in calcitonin gene-related peptide of rat migraine model via stimulating trigeminal ganglion by electrode

ZHANG Jin-lu1, CHEN Xin-lin2, Lü Hai-xia2, LIU Yong2, LUO Guo-gang1

(1. Department of Neurology, the First Affiliated Hospital of Xi’an Jiaotong University,Xi’an 710061; 2. Laboratory of Neurobiology, Xi’an Jiaotong University Health Science Center, Xi’an 710061, China)

Objective To explore the mechanism of c-Jun N-terminal kinase (JNK) signaling transduction pathway in calcitonin gene-related peptide (CGRP) of rat trigeminal ganglion (TG) migraine model. Methods We randomly divided adult male SD rats into control, sham-operation, model, DMSO+model, SP50+model, and SP25+model groups. We built the rat migraine model by stimulating TG with electrode and chose SP600125 as the intervention drug. We observed the behavior changes of rats before and after the surgery. The expressions of p-JNK and JNK protein were detected by Western blot, and the expression of CGRP in TG was detected by immunohistochemistry. Results After the stimulation, the number of times of head scratching was significantly higher than before (P<0.05) while the number of times of cage climbing was significantly lower than before (P<0.05). The ratio of p-JNK/JNK in TG was significantly higher in model, sham, DMSO+model, and SP50+model groups than in control group (P<0.05), while the ratio in SP50+model group was lower than that in model and SP25+model groups (P<0.05). The expression of CGRP in TG was significantly higher in model group than in control and SP50+model groups (P<0.05). Conclusion This rat migraine model can simulate the process of migraine attack, cause the model rats’ behavioral change and activate JNK signaling pathway. JNK signaling pathway participates in the regulation of the expression of CGRP in TG.

migraine; trigeminal ganglion (TG); calcitonin gene-related peptide (CGRP); Jun N-terminal kinase (JNK); SP600125

2015-05-19

2015-09-15

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(No.81271127) Supported by the National Natural Science Foundation of China (No.81271227)

羅國(guó)剛. E-mail: lguogang@163.com

R741

A

10.7652/jdyxb201601005

優(yōu)先出版：http://www.cnki.net/kcms/detail/61.1399.R.20151208.1739.010.html(2015-12-08)