范陽華，祝新根，葉敏華，廖長春，肖 兵，汲乾坤，郭 華，吳 雷

(南昌大學(xué)第二附屬醫(yī)院神經(jīng)外科，江西南昌 330006)

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靶向RWDD3基因shRNA慢病毒載體的構(gòu)建及功能鑒定

范陽華，祝新根，葉敏華，廖長春，肖 兵，汲乾坤，郭 華，吳 雷

(南昌大學(xué)第二附屬醫(yī)院神經(jīng)外科，江西南昌 330006)

目的 構(gòu)建RWD結(jié)構(gòu)小泛素化增強子(RWDD3)shRNA慢病毒表達載體，為探討RNA干擾技術(shù)抑制人腦膠質(zhì)瘤細胞RWDD3基因的相關(guān)研究奠定基礎(chǔ)。方法 設(shè)計RWDD3的3條siRNA的靶點序列，合成含干擾序列的雙鏈DNA發(fā)卡結(jié)構(gòu)shRNA，分別與雙酶切后的載體連接，構(gòu)建3種重組質(zhì)粒pGC-LV-shRNA1、pGC-LV-shRNA2和pGC-LV-shRNA3，并轉(zhuǎn)化于DH5α感受態(tài)細胞，提取陽性克隆質(zhì)粒測序，轉(zhuǎn)染293T細胞，生產(chǎn)慢病毒顆粒，并檢測病毒滴度。將3種重組慢病毒及陰性對照病毒分別感染人腦膠質(zhì)瘤細胞U251，實時定量PCR和Western blot分別檢測RWDD3 mRNA和蛋白的沉默效果。結(jié)果 測序結(jié)果證實3種慢病毒載體均包裝成功，滴度分別為5×1011TU/L、4×1011TU/L、5×1011TU/L。感染U251后，RWDD3 mRNA及蛋白的表達量均較陰性對照組和未感染組明顯降低(P<0.05)；其中以LV-RWDD3-shRNA-1作用顯著，mRNA表達下調(diào)79.2%，蛋白表達下調(diào)68.2%(P<0.05)；而陰性感染對照組和未感染組相比差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。結(jié)論 成功構(gòu)建3種RWDD3 shRNA慢病毒表達，可有效下調(diào)U251細胞RWDD3 mRNA和蛋白的表達，其為進一步研究以RWDD3為靶點的腦膠質(zhì)瘤基因治療提供穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細胞的載體奠定基礎(chǔ)。

腦膠質(zhì)瘤；RWDD3；慢病毒；shRNA

腦膠質(zhì)瘤是中樞神經(jīng)系統(tǒng)最常見的原發(fā)性腫瘤，具有無控性增殖、侵襲性生長、易復(fù)發(fā)、預(yù)后極差的特點[1-2]。其本質(zhì)上是一種多基因異常疾病，由于原癌基因的過表達，同時伴隨抑癌基因的突變?nèi)笔?，從而使腫瘤細胞逃避了正常生長的調(diào)控機制。傳統(tǒng)治療方法(包括手術(shù)、化療和放療)并沒有完全解決膠質(zhì)瘤侵襲性生長所導(dǎo)致的高復(fù)發(fā)率和低治愈率難題。針對與膠質(zhì)瘤發(fā)生、發(fā)展相關(guān)的基因異常的治療已成為研究熱點[3]。

RWD結(jié)構(gòu)小泛素化增強子(RWD containing sumoylation enhancer, RWDD3或RSUME)是一種最初在垂體腺瘤中發(fā)現(xiàn)的具有促進腫瘤生成、血管新生能力的基因片段[4]。本課題的前期研究[5]發(fā)現(xiàn)RWDD3在腦膠質(zhì)瘤組織中較正常腦組織表達上調(diào)，其表達水平與膠質(zhì)瘤病理級別相關(guān)。據(jù)此推測RWDD3與腦膠質(zhì)瘤的惡性程度密切相關(guān)，但其在腦膠質(zhì)瘤中的具體作用機制仍不清楚。本文探討構(gòu)建RWD結(jié)構(gòu)小泛素化增強子RWDD3的慢病毒shRNA表達載體，研究轉(zhuǎn)染人腦膠質(zhì)瘤U251細胞后對RWDD3表達的影響，為后續(xù)在細胞水平研究RWDD3參與人腦膠質(zhì)瘤發(fā)生、發(fā)展的機制及RWDD3靶向基因治療提供實驗基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 主要材料與試劑

人膠質(zhì)瘤細胞株U251細胞為本實驗室保存；慢病毒載體GV248及慢病毒包裝系統(tǒng)Lentivector Packaging Kit購自上海吉凱基因化學(xué)公司；限制性內(nèi)切酶AgeⅠ、EcoRⅠ和連接試劑盒購自NEB公司；質(zhì)粒提取試劑盒、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購自Qiagen公司；轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine 2000、RNA抽提試劑Trizol購自Invitrogen公司；cDNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、Real-time PCR試劑盒購自Fermentas公司；BCA蛋白質(zhì)定量試劑盒、細胞總蛋白抽提試劑盒、兔抗人RWDD3多抗購自Abcam公司；鼠抗B-Actin抗體、羊抗兔、羊抗鼠IgG二抗購自北京全式金生物公司。

1.2 主要方法

1.2.1 RWDD3-shRNA慢病毒干擾載體的構(gòu)建 根據(jù)GenBank中人RWDD3基因mRNA序列(Gene ID：25950)，運用https://maidesigner.invitrogen.com/maiexpress/在線軟件設(shè)計3個siRNA靶點序列及3對shRNA序列引物，所設(shè)計的siRNA全部針對靶基因的ORF區(qū)域(開放閱讀框區(qū)域)，GC含量在30%～50%之間，通過GenBank驗證該陰性對照序列對任何基因均無干擾效應(yīng)。在5′端添加CCGG，3′端添加終止信號TTTTTG，中間加入Loop環(huán)(CTCGAG)，兩端分別帶有AgeⅠ(ACCGGT)和EcoRⅠ(GAATTC)酶切位點。將這些單鏈DNA送至上海吉凱基因化學(xué)司，合成RWDD3純化的shRNA Oligo片段。陰性對照(TTCTCCGAACGTGTCACGT)shRNA表達重組質(zhì)粒標準品由上海吉凱提供并設(shè)計合成(表1)。

表1 RWDD3的siRNA干擾靶點序列及shRNA引物序列

1.2.2 將合成的RWDD3-shRNA片段插入到GV248慢病毒載體中 將合成好的DNA Oligo溶解并稀釋成終濃度100 μmol/L。應(yīng)用PCR儀使正義鏈、反義鏈退火形成雙鏈，退火條件為：95 ℃，5 min；85 ℃，5 min；75 ℃，5 min；70 ℃，5 min。將得到的shRNA片段稀釋成終濃度20 nmol/L。用限制性內(nèi)切酶AgeⅠ和EcoRⅠ，對慢病毒載體GV248進行雙酶切，得到的產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖電泳分離、割膠回收和純化后稀釋成50m g/L，并與shRNA片段在22 ℃水浴中進行連接反應(yīng)。

1.2.3 轉(zhuǎn)染感受態(tài)細胞 ①取一支感受態(tài)細胞(每管50 μL，-80 ℃保存)于冰上，待解凍后加入10 μL連接產(chǎn)物，輕輕旋轉(zhuǎn)以混勻內(nèi)容物，在冰中放置30 min后將管放到預(yù)加溫到42 ℃的恒溫水浴鍋中熱激90 s；快速將管轉(zhuǎn)移到冰浴中，使細胞冷卻1～2 min。②每管加800 μL SOC培養(yǎng)基(無抗)，然后將管轉(zhuǎn)移到37 ℃搖床上，溫育45 min使細菌復(fù)蘇。取150 μL的轉(zhuǎn)化菌液涂布于LB瓊脂平板上抗性培養(yǎng)。

1.2.4 DNA測序 挑選轉(zhuǎn)化子重懸于10 μL LB溶液，混勻取1 μL作為模板；使用上海吉凱公司GV248作為通用引物，進行菌落PCR鑒定實驗。95 ℃ 3 min；30個循環(huán)94 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，72 ℃延伸6 min。將PCR陽性克隆進行測序(Invitrogen公司)，測序引物與鑒定引物中的上游引物相同。

1.2.5 慢病毒的包裝 慢病毒包裝系統(tǒng)為三質(zhì)粒系統(tǒng)，有效序列載體質(zhì)粒pGC-LV-RWDD3 shRNA、包裝質(zhì)粒pLV-Packaging(pHelper 1.0)和包膜質(zhì)粒pLV-Envelope(pHelper 2.0)三質(zhì)粒組成。pGC-LV 能表達綠色熒光蛋白(GFP)；pGC-LV，pHelper 1.0，pHelper 2.0含有病毒包裝所必須的元件，根據(jù)Qiagen質(zhì)粒抽提試劑盒說明書提取三種質(zhì)粒DNA，質(zhì)粒DNA溶于除菌得TE中，以紫外光吸收法測定其濃度及純度，保證所提質(zhì)粒DNA的A260/A280在1.8～2.0之間。

轉(zhuǎn)染前24 h用胰蛋白酶消化對數(shù)生長期的293T細胞，調(diào)整細胞密度為0.6×109/L，取pGC-LV-RWDD3 20 μg、pHelper 1.0載體15 μg、pHelper 2.0載體10 μg于一無菌離心管中，與相應(yīng)體積的Opti-MEM混勻，調(diào)整總體積為2.5 mL，室溫溫育5 min。取100 μL Lipofectamine 2000試劑于另一無菌離心管與2.4 mL Opti-MEM混勻，室溫溫育5 min。把稀釋后的DNA與稀釋后的Lipo 2000進行混勻后形成轉(zhuǎn)染復(fù)合物；當(dāng)293 T細胞密度達70%～80%時，將轉(zhuǎn)染復(fù)合物轉(zhuǎn)移至含單層細胞的培養(yǎng)液中，培養(yǎng)8 h后棄去培養(yǎng)液，PBS 15 mL反復(fù)洗2次，最后加入細胞培養(yǎng)液15 mL 培養(yǎng)48 h；收集上清液，4 ℃、4 000 r/min離心10 min，0.45 μm濾器過濾上清液，分裝至1.5 mL離心管，-80 ℃保存病毒液。

1.2.6 慢病毒滴度測定 根據(jù)病毒的預(yù)期滴度，對其進行倍比稀釋。293 T細胞鋪板，在96孔板每孔中加100 μL重懸細胞4×104個。根據(jù)病毒的預(yù)期滴度，準備8個無菌的Ep管，每管中加入90 μL的無血清培養(yǎng)基。取待測定的病毒原液10 μL加入到第1個管中，混勻后，取10 μL加入到第2個管中，繼續(xù)相同的操作直到最后一管。(即第1管中加入10 μL病毒原液，第2管加入病毒原液為第1管的1/10，為1 μL，第3管加入病毒原液為第2管的1/10，為0.1 μL。)吸出細胞孔中培養(yǎng)基90 μL，加90 μL病毒稀釋液，37 ℃溫育24 h后加入新鮮培養(yǎng)基100 μL繼續(xù)培養(yǎng)96 h，檢測GFP表達量，數(shù)出熒光細胞比例在10%左右的孔中的熒光細胞數(shù)。滴度計算公式：熒光細胞數(shù)÷相應(yīng)稀釋倍數(shù)，即為病毒原液的滴度值[轉(zhuǎn)導(dǎo)單位，transducing unit(TU)/mL]。

1.2.7 慢病毒載體感染人腦膠質(zhì)瘤U251細胞 感染前取對數(shù)生長期的U251細胞每孔5×104接種于6孔板中，當(dāng)細胞密度為30%轉(zhuǎn)染細胞，按未感染空白對照組、LV-NC-shRNA陰性對照感染組、LV-RWDD3 shRNA-1感染組、LV-RWDD3 shRNA-2感染組及LV-RWDD3 shRNA-3感染組5組加入不同感染復(fù)數(shù)，培養(yǎng)24 h后更換培養(yǎng)基，培養(yǎng)24 h后觀察熒光及細胞狀態(tài)。

1.2.8 實時定量PCR檢測各組RWDD3 mRNA的表達量 常規(guī)提取慢病毒感染96 h后的人腦膠質(zhì)瘤U251細胞的RWDD3總RNA，TaKaRa公司試劑盒合成cDNA。以qPCR檢測各組RWDD3 mRNA的表達量。RWDD3上、下游引物分別為：5′-TACCTGGTATCTCGATTAACTCTGAAC-3′，5′-TCAGTA-TTATTTTACCCATGAACATCA-3′，產(chǎn)物348 bp。GAPDH上、下游引物分別為：5′-GTTGGAGGTCGGAGTCAACGG-3′，5′-GAGGGATCTCGCTCCTGGAGGA-3′，產(chǎn)物240 bp。PCR反應(yīng)條件：95 ℃ 2 min，95 ℃ 30 s、58.8 ℃ 30 s、72 ℃ 30 s，共40個循環(huán)，72 ℃ 5 min延伸。整個反應(yīng)過程中熒光信號的變化由qPCR儀監(jiān)測。反應(yīng)結(jié)束后，電腦自動分析并顯示計算結(jié)果，2-△△CT為RWDD3的相對表達量。

1.2.9 Western blot檢測各組RWDD3蛋白的表達量 常規(guī)提取慢病毒感染96 h后的人腦膠質(zhì)瘤U251細胞的RWDD3總蛋白，80 mV電壓下在100 g/L SDS-PAGE電泳2 h。PVDF膜在250 mA下轉(zhuǎn)膜70 min。50 g/L脫脂奶粉封閉液中室溫下封閉2 h或4 ℃過夜封閉，TBST洗膜3次。加入RWDD3(1∶800稀釋)、β-actin(1∶5 000稀釋)一抗，4 ℃過夜孵育；洗膜3次后加入二抗(1∶5 000稀釋)室溫孵育2 h，TBST洗膜10 min 3次，置增強化學(xué)發(fā)光試劑ECL底物中反應(yīng)5 min，暗室曝光顯示特異的蛋白信號，依據(jù)ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒操作說明進行顯影、定影。利用凝膠圖像分析系統(tǒng)對膠片進行灰度掃描和凈吸光度值分析。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理

使用SPSS 20.0軟件進行數(shù)據(jù)的統(tǒng)計學(xué)處理，實驗數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差表示，多組間均數(shù)比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用SNK-q檢驗，P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 pGC-LV-RWDD3 shRNA重組質(zhì)粒的DNA測序結(jié)果

將PCR陽性克隆進行DNA測序，結(jié)果與預(yù)DNA序列相符(圖1)，表明合成的RWDD3 shRNA 寡核苷酸鏈序列插入正確，說明DNA重組成功。

圖1 pGC-LV-RWDD3 shRNA重組質(zhì)粒陽性克隆的DNA測序結(jié)果

Fig.1 The sequence analysis of pGC-LV-RWDD3 shRNA positive recombinant plasmid clones
A: pGC-LV-RWDD3 shRNA-1(gatgatggattgtggataa); B: pGC-LV-RWDD3 shRNA-2(agtcaattatccttcatgt); C: pGC-LV-RWDD3 shRNA-3 (tatcctcagccaaccagaa)。

2.2 RWDD3 shRNA慢病毒成功包裝及鑒定

慢病毒包裝系統(tǒng)共轉(zhuǎn)染293T細胞后24 h，熒光顯微鏡下可見強綠色熒光，細胞生長狀態(tài)良好，表明慢病毒包裝成功。轉(zhuǎn)染48 h后收集表達載體的滴度分別為：5×1011TU/L(pGC-LV-RWDD3 shRNA-1)，4×1011TU/L(pGC-LV-RWDD3 shRNA-2)，5×1011TU/L(pGC-LV-RWDD3 shRNA-3)，熒光表達情況如圖2～圖4。

2.3 慢病毒載體成功轉(zhuǎn)染人腦膠質(zhì)瘤U251細胞

根據(jù)各組重組慢病毒顆粒滴度，pGC-LV-RWDD3 shRNA-1，2，3組病毒用量分別為2.0 μL、2.5 μL、2.0 μL，感染人腦膠質(zhì)瘤U251細胞后，如圖5可見絕大多數(shù)細胞都熒光著色，與背景反差明顯，熒光著色細胞有明顯的細胞輪廓。

2.4 shRNA重組慢病毒表達載體感染人腦膠質(zhì)瘤U251細胞后RWDD3 mRNA的表達量

各組重組慢病毒顆粒感染人腦膠質(zhì)瘤U251細胞后發(fā)現(xiàn)，RWDD3-shRNA-1，2，3感染組RWDD3 mRNA的表達水平均較未感染組和NC-shRNA陰性對照感染組顯著降低(P<0.05)； RWDD3-shRNA-1，2，3感染組較陰性對照RWDD3 mRNA下調(diào)分別為79.2%、51.5%和76.4%，以RWDD3-shRNA-1組下調(diào)最為明顯；未感染組和NC-shRNA陰性對照感染組中RWDD3 mRNA的表達差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05，圖6)。

2.5 shRNA重組慢病毒表達載體感染人腦膠質(zhì)瘤U251細胞后RWDD3蛋白的表達量

結(jié)果與qPCR結(jié)果基本一致。各組重組慢病毒顆粒感染人腦膠質(zhì)瘤U251細胞后發(fā)現(xiàn)RWDD3-shRNA-1，2，3感染組RWDD3蛋白的表達水平均較未感染組和NC-shRNA陰性對照感染組顯著降低(P<0.05)；RWDD3-shRNA-1，2，3感染組較陰性對照RWDD3蛋白下調(diào)分別為68.2%、44.3%和38.5%，以RWDD3-shRNA-1組下調(diào)最為明顯；未感染組和NC-shRNA陰性對照感染組中RWDD3蛋白的表達差異無顯著性(P>0.05，圖7)。

圖2 RWDD3 shRNA-1慢病毒轉(zhuǎn)染293T細胞48 h后的熒光表達情況

Fig.2 The green fluorescence in 293T cells transfeced with RWDD3 shRNA-1 observed under a fluorescence microscope after 48 hours (×200)
1：光學(xué)顯微鏡；2：螢光顯微鏡。

圖3 RWDD3 shRNA-2慢病毒轉(zhuǎn)染293T細胞48 h后的熒光表達情況

Fig.3 The green fluorescence in 293T cells transfeced with RWDD3 shRNA-2 observed under a fluorescence microscope after 48 hours (×200)
1：光學(xué)顯微鏡；2：螢光顯微鏡。

3 討 論

RWD結(jié)構(gòu)小泛素化增強子(RWD containing sumoylation enhancer, RWDD3或RWDD3)是一種最初發(fā)現(xiàn)在垂體腺瘤中的基因片段。已有文獻[6]證明，RWDD3可通過SUMO化促進腫瘤血管新生。低氧、CoCl2誘導(dǎo)缺氧及熱休克環(huán)境下可誘導(dǎo)RWDD3的表達，poly-A RNA斑點膜的實驗中發(fā)現(xiàn)，RWDD3可在多個組織中表達，但在腦組織、心臟、腎臟、肝臟、胃、胰腺、前列腺和脾臟中表達較高[4]。

圖4 RWDD3 shRNA-3慢病毒轉(zhuǎn)染293T細胞48 h后的熒光表達情況

Fig.4 The green fluorescence in 293T cells transfeced with RWDD3 shRNA-3 observed under a fluorescence microscope after 48 hours (×200)
1：光學(xué)顯微鏡；2：螢光顯微鏡。

圖5 慢病毒載體轉(zhuǎn)染人腦膠質(zhì)瘤U251細胞后的熒光表達情況

Fig.5 The green fluorescence in U251cells transfeced with RWDD3 shRNA (×100)
1：光學(xué)顯微鏡；2：螢光顯微鏡。

圖6 LV-RWDD3-shRNA感染U251細胞對RWDD3 mRNA表達的影響

Fig.6 The expression levels of RWDD3 mRNAs in U251 cells after transfection with LV-RWDD3-shRNA were detected by Real-time fluorescence quantitative-PCR
與空白組比較，*P<0.05。

SHAN等[7]在垂體瘤細胞中證實，在缺氧環(huán)境下敲低RWDD3的表達，能夠明顯抑制HIF-1α的生成，證明HIF-1α的生成需要RWDD3的調(diào)控，且RWDD3是一種可促進蛋白小泛素化作用的基因片段[8]；RWDD3不僅可促進SUMO化中Ubc9和SUMO-1相互的作用，并且還可以編碼RWD結(jié)構(gòu)域蛋白與SUMO化的底物HIF-1α結(jié)合形成二聚體，進一步促進底物SUMO化[9]，可與HIF-1α序列中的泛素化位點Lys391和Lys477結(jié)合阻斷蛋白質(zhì)的泛素化-蛋白酶體降解途徑，抑制HIF-1α的降解[10]。RWDD3可能作為新發(fā)現(xiàn)的致癌基因。最近研究發(fā)現(xiàn)，RWDD3可能通過小泛素化穩(wěn)定HIF-1α、IκB的活性，調(diào)節(jié)HIF-1α/VEGF通路及IκB/NF-κB通路[11]。由此推斷RWDD3在腫瘤的惡性生物學(xué)表型中發(fā)揮重要作用，但其具體機制尚不明確。

圖7 LV-RWDD3-shRNA感染U251細胞對RWDD3蛋白表達的影響

Fig.7 The expression levels of RWDD3 protein inU251 cells after transfection with LV-RWDD3-shRNA were detected by Western blot
與空白組比較，*P<0.05。

RWDD3對腫瘤發(fā)生發(fā)展是一個新的與腫瘤發(fā)生進展相關(guān)的領(lǐng)域，值得進一步研究。前期實驗發(fā)現(xiàn)RWDD3蛋白在人腦膠質(zhì)瘤組織中高表達，其表達水平與膠質(zhì)瘤病理級別密切相關(guān)[5]，推測RWDD3可能參與調(diào)節(jié)人腦膠質(zhì)瘤的惡性進展。如能對構(gòu)建穩(wěn)定基因沉默表達平臺，有望明確RWDD3分子作用機制及為腦膠質(zhì)瘤治療帶來新的希望。

研究表明[11-12]，因慢病毒載體優(yōu)勢較大，相對于一般載體最大特點就是可感染分裂期及非分裂期的細胞，包括神經(jīng)細胞、肝細胞、造血干細胞等。此外慢病毒整合到基因組中實現(xiàn)長時間的基因表達，滴度比原逆轉(zhuǎn)錄病毒體系更好，免疫反應(yīng)也更小，具有轉(zhuǎn)移的基因片段容量較大(9 kb)；同時它是一個缺陷病毒，不會導(dǎo)致細胞死亡，而被感染的細胞卻可以連續(xù)傳代。因此，本實驗選擇構(gòu)建慢病毒載體沉默RWDD3基因的表達。

本實驗方法主要是利用RNA干擾(RNAi)，其是指生物體內(nèi)利用雙鏈RNA誘導(dǎo)同源靶基因的mRNA特異性降解，從而導(dǎo)致轉(zhuǎn)錄后基因沉默的現(xiàn)象，短發(fā)夾狀RNA(short hairpin RNA, shRNA)是采用質(zhì)粒或病毒載體表達的siRNA。各種慢病毒載體的結(jié)構(gòu)和作用機制基本相同。主要包括轉(zhuǎn)移質(zhì)粒、輔助質(zhì)粒、包膜糖蛋白表達質(zhì)粒三種不同的質(zhì)粒組成。本實驗采用的慢病毒載體系統(tǒng)由pLV穿梭載體、pHelper 1.0載體和pHelper 2.0載體三質(zhì)粒組成。以上元件為慢病毒載體的成功構(gòu)建提供基礎(chǔ)，但慢病毒載體的缺點在于目前人們對它潛在的感染風(fēng)險仍有顧慮，因此必須遵守嚴格的實驗操作規(guī)程。

目前，國內(nèi)外對于RWDD3的研究仍較少。本實驗設(shè)計并合成了3條靶向干擾RWDD3基因的siRNA序列，通過質(zhì)粒介導(dǎo)，在國內(nèi)外第一次成功構(gòu)建了含有GFP報告基因的RWDD3 shRNA慢病毒表達載體，能有效沉默人腦膠質(zhì)瘤U251細胞RWDD3 mRNA及蛋白的表達，為進一步研究RWDD3相關(guān)調(diào)控機制、對腦膠質(zhì)瘤細胞等腫瘤細胞的生物學(xué)表型的作用及相應(yīng)基因治療提供方法學(xué)依據(jù)。

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(編輯 韓維棟)

Construction and function identification of short hairpin RNA lentiviral vector targeting RWDD3 gene

FAN Yang-hua, ZHU Xin-gen, YE Min-hua, LIAO Chang-chun,XIAO Bing, JI Qian-kun, GUO Hua, WU Lei

(Department of Neurosurgery, the Second Affiliated Hospital of Nanchang University, Nanchang 330006, China)

Objective To construct an RWDD3 shRNA lentiviral vector and provide evidence for research on restraining glioma cells RWDD3 genes by RNAi. Methods Three siRNA interference sequences targeting RWDD3 gene were designed．Double-stranded shRNA hairpins were synthetized and cloned separately into GV248 vector digested by double-enzyme so as to reconstruct 3 shuttle-plasmids of pGC-LV-shRNA1, pGC-LV-shRNA2 and pGC-LV-shRNA3. Then these recombinant plasmids were transformed into DH5αcompetent cells. After Amp screening positive clones, plasmid was taken from line for subsequent identification by enzyme-digestion and DNA sequencing analysis. The titer of lentivirus was determined after 293T cells were cotransfected with shRNA and lentiviral packaging plasmids. The 3 kinds of recombinant lentiviruses and negative control lentiviruses were used to infect U251 cells and then RWDD3 mRNA and protein were detected by Real-time PCR and Western blotting, respectively. Results DNA sequencing analysis confirmed that the 3 RWDD3-shRNA sequences were successfully inserted into the lentiviral vectors with the titers of concentrated virus 5×1011TU/L, 4×1011TU/L and 5×1011TU/L, respectively. RWDD3 expression in U251 cells was significantly decreased at both mRNA and protein levels compared with those of the non-transfected and negative control vectors (P<0.05). The LV-RWDD3-shRNA-1 played a significant role in reducing mRNA by 79.2% and protein by 68.2%(P<0.05), respectively. The silencing effect did not significantly differ between the non-transfected and negative control vectors (P>0.05). ConclusionThe 3 lentiviral shRNA expression vectors targeting RWDD3 gene were successfully constructed. They can effectively downregulate the expression of RWDD3 in U251 cells, thus providing stable cell transfection vector for further study on U251 gene-targeted gene therapy on human brain gliomas.

glioma; RWDD3; lentivirus; shRNA

2015-03-27

2015-07-20

江西省自然科學(xué)基金計劃項目(No.20132BAB205043)、江西省教育廳科學(xué)技術(shù)研究項目(No.GJJ14066) Supported by the Natural Science Foundation Project of Jiangxi Province (20132BAB205043) and the Science and Technology Research Project of Department of Education of Jiangxi Province (GJJ14066)

吳雷. E-mail: robertcarose@163.com

R739.41

A

10.7652/jdyxb201601003

優(yōu)先出版：http://www.cnki.net/kcms/detail/61.1399.R.20151209.1632.014.html(2015-12-09)