周 瑩, 孫梨宗, 劉志紅, 臺(tái)培東, 李玥瑩

(1. 沈陽(yáng)師范大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院, 沈陽(yáng) 110034;2. 中國(guó)科學(xué)院 沈陽(yáng)應(yīng)用生態(tài)研究所, 沈陽(yáng) 110034)

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氨氮對(duì)斑馬魚3種酶活性和基因表達(dá)的影響

周 瑩1, 孫梨宗2, 劉志紅2, 臺(tái)培東2, 李玥瑩1

(1. 沈陽(yáng)師范大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院, 沈陽(yáng) 110034;2. 中國(guó)科學(xué)院 沈陽(yáng)應(yīng)用生態(tài)研究所, 沈陽(yáng) 110034)

目的:從酶活性測(cè)定和酶基因表達(dá)兩方面探討氨氮對(duì)斑馬魚的毒性效應(yīng),為快速準(zhǔn)確評(píng)價(jià)氨氮水環(huán)境質(zhì)量提供理論依據(jù)。方法:以斑馬魚為受試生物,研究氨氮對(duì)其毒性效應(yīng),分別在第3 d和第14 d測(cè)定斑馬魚肝臟組織SOD和AChE酶活性變化,進(jìn)一步運(yùn)用半定量RT-PCR測(cè)定AChE、SOD以及CYP450基因相對(duì)轉(zhuǎn)錄量。結(jié)論:氨氮對(duì)斑馬魚96 h-LC50為86.36 mg·L-1;SOD和AChE酶活性在暴露3 d時(shí)變化均不顯著,暴露14 d時(shí)前者表現(xiàn)為低濃度促進(jìn)高濃度抑制的趨勢(shì),后者始終處于抑制狀態(tài),且具明顯的劑量-效應(yīng)關(guān)系;與酶活性測(cè)定相比,相應(yīng)基因(SOD、CYP450和AChE)在轉(zhuǎn)錄水平上的變化出現(xiàn)更早,更靈敏,用于氨氮污染檢測(cè)更具有時(shí)效性。

氨氮; 斑馬魚; SOD; AChE; CYP450

0 引 言

《2014年中國(guó)環(huán)境狀況公報(bào)》顯示,我國(guó)廢水中氨氮排放總量達(dá)238.5萬噸,被列為廢水第2大污染物。水中氨氮嚴(yán)重超標(biāo)導(dǎo)致水質(zhì)惡化,對(duì)魚類等水生生物造成損傷[1],甚至還會(huì)給人體健康帶來威脅[2]。

生物體在面對(duì)環(huán)境污染物刺激時(shí)會(huì)做出相應(yīng)調(diào)控,這種調(diào)控首先體現(xiàn)在核酸水平。近年來,國(guó)內(nèi)外學(xué)者就氨氮對(duì)魚類的影響進(jìn)行了大量的報(bào)道[3-5],然這些研究主要集中在生長(zhǎng)和成活等一般綜合性指標(biāo),對(duì)短時(shí)間低濃度氨氮暴露下魚體內(nèi)一些重要酶的活性,尤其是在轉(zhuǎn)錄水平上的研究仍較少[6]。

斑馬魚(Danio rerio),鯉科短魚丹屬淡水魚,作為一種模式生物,其在基因、胚胎等研究領(lǐng)域得到了廣泛的應(yīng)用[7-8]。本研究以斑馬魚為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物,研究不同濃度氨氮暴露下斑馬魚肝臟組織SOD和AChE酶活性的變化,進(jìn)一步運(yùn)用半定量RT-PCR測(cè)定AChE、SOD以及CYP450基因的相對(duì)轉(zhuǎn)錄量,探討氨氮對(duì)斑馬魚的毒性效應(yīng),為制定氨氮水環(huán)境監(jiān)測(cè)標(biāo)準(zhǔn)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

斑馬魚(Danio rerio)購(gòu)于上海佳譽(yù)水族館,雌雄兼有,平均體長(zhǎng)(2.4±0.18)cm,平均體重(0.18±0.03)g,實(shí)驗(yàn)前在實(shí)驗(yàn)室馴養(yǎng)7 d,采用曝氣自來水,水溫(25±2)℃,水質(zhì)條件:pH=7.5±0.3,溶解氧高于7.0 mg·L-1,每日光照12～14 h,早晚定時(shí)投喂飼料,及時(shí)處理排泄物,自然死亡率<3%。實(shí)驗(yàn)前24 h停止喂食,挑選強(qiáng)壯個(gè)體用于毒性實(shí)驗(yàn)。

氨氮儲(chǔ)備液:稱取38.19 g氯化銨(分析純)用曝氣純凈水稀釋至1 L,制成10 g·L-1的儲(chǔ)備液。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 急性毒性實(shí)驗(yàn)

試驗(yàn)方法參照國(guó)標(biāo)GB/T 13267—91。

1.2.2 慢性毒性實(shí)驗(yàn)

以96 h-LC50為基準(zhǔn),設(shè)置0.1×LC50、0.4×LC50和0.8×LC50這3個(gè)處理組濃度,每個(gè)濃度3個(gè)平行,并設(shè)置空白對(duì)照(曝氣純凈水),進(jìn)行慢性毒性實(shí)驗(yàn)。在暴露初期(第3 d)和暴露后期(第14 d)分別從每個(gè)處理中取10條活魚冰凍處死、解剖,取其肝臟組織,提取RNA,通過RT-PCR后半定量測(cè)定。

1.2.3 超氧化物歧化酶、乙酰膽堿酯酶活性測(cè)定

蘇州科銘生物技術(shù)有限公司超氧化物歧化酶(Superoxide Dismutase, SOD)(GY1)和乙酰膽堿酯酶(Acetylcholine Esterase, AChE)(KW1)試劑盒。

1.2.4 半定量反轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)

使用RNA提取試劑盒(BS88133,生工生物)進(jìn)行RNA提取,蛋白核酸測(cè)定儀(Eppendorf)測(cè)定RNA的濃度和純度,cDNA合成試劑盒(6110A,TaKaRa)合成cDNA。PCR擴(kuò)增所用的基因序列來源于GeneBank,引物序列如下:β-actin(內(nèi)參基因):F-cctgatgaagatcctgaccg,R-atccagacggagtatttgcg;SOD:F-ggccttactccaggaaaac,R-gagatgtaattgtcagcgg;AChE:F-ttgctcttgcccactgtgctacta,R-cttcactcatcactctgttggggttc;CYP450:F-cgaaaatcccagacgggctac,R-ccctcattactgatgtgctcctct。PCR反應(yīng)程序:94 ℃變性5 min;94 ℃變性30 s,55 ℃退火1 min,72 ℃延伸2 min,32個(gè)循環(huán);72 ℃延伸10 min,4 ℃保存。取5 μL PCR產(chǎn)物電泳檢測(cè),Image Lab軟件分析條帶熒光強(qiáng)度。

1.3 統(tǒng)計(jì)分析

急性毒性數(shù)據(jù)采用Probit法分析,慢性毒性數(shù)據(jù)采用單因素方差分析(one-way ANOVA)。以上分析由統(tǒng)計(jì)軟件SPSS19.0完成(各圖中*:p<0.05、**:p<0.01)。

2 結(jié)果與分析

2.1 急性毒性實(shí)驗(yàn)

通過急性毒性實(shí)驗(yàn)得到氨氮對(duì)斑馬魚24,48,72和96 h的LC50分別為126.22、104.74、102.87和86.36 mg·L-1(見表1)。觀察發(fā)現(xiàn),高濃度氨氮脅迫下,斑馬魚個(gè)體行動(dòng)明顯遲緩,且排泄物較多。

表1 氨氮對(duì)斑馬魚的半致死濃度

2.2 氨氮暴露對(duì)斑馬魚SOD、AChE酶活性影響

氨氮對(duì)斑馬魚SOD和AChE酶活性的影響結(jié)果見圖1。由圖1(a),氨氮暴露初期(第3 d),各實(shí)驗(yàn)組SOD活性與對(duì)照組無顯著差異,暴露后期(第14 d),各濃度組差異顯著:與對(duì)照組相比,低(0.1LC50)和中濃度組(0.4LC50)SOD酶活性增加了12.23%和16.47%,而高濃度組(0.8LC50)SOD酶活性降低了19.30%;由圖1(b),氨氮暴露初期和暴露后期,AChE酶活性均受到抑制,隨暴露時(shí)間的增加,暴露濃度越高,AChE活性被抑制的效果越明顯,與對(duì)照組相比酶活降低分別達(dá)12.32%,22.45%和25.36%。

2.3 氨氮對(duì)斑馬魚基因相對(duì)轉(zhuǎn)錄量的影響

圖2(a)是β-actin(內(nèi)參基因)、SOD、CYP450和AChE基因RT-PCR電泳結(jié)果,可知,SOD和CYP450條帶亮度差異顯著。經(jīng)掃描分析,氨氮脅迫第3 d,SOD基因相對(duì)轉(zhuǎn)錄量隨氨氮濃度表現(xiàn)為先降低后升高的趨勢(shì),各處理間差異顯著,與酶活測(cè)定相比,氨氮對(duì)基因轉(zhuǎn)錄的影響更早;染毒第14 d,高濃度組(0.8LC50)表現(xiàn)出明顯的抑制作用,其整體變化趨勢(shì)為先升高后降低,與酶活測(cè)定結(jié)果基本一致。CYP450基因的轉(zhuǎn)錄在初期和后期均明顯受到抑制,各處理間基因相對(duì)表達(dá)量具有顯著差異。

圖1 氨氮對(duì)斑馬魚肝臟組織SOD(a)和AChE(b)酶活性影響

3 討 論

通過急性毒性實(shí)驗(yàn)得到氨氮對(duì)斑馬魚96 h-LC50為86.36 mg·L-1,與其他已有報(bào)道的魚類氨氮毒性值比較,如氨氮對(duì)白斑狗魚成魚、黃顙魚、麥穗魚的96 h-LC50分別為24.92、148.1、247.35 mg·L-1等[9],發(fā)現(xiàn)氨氮對(duì)斑馬魚的毒性與對(duì)其他不同魚類的毒性大小存在一定的差距,這說明不同生物對(duì)氨氮毒性的抵抗能力存在差異。

SOD作為魚體中重要的抗氧化性酶,當(dāng)受到外界污染環(huán)境刺激時(shí),其自身活性發(fā)生變化[10]。本研究中,斑馬魚肝臟組織中SOD酶活性在長(zhǎng)時(shí)間的氨氮脅迫下呈現(xiàn)先升高后降低的現(xiàn)象,這與其他一些報(bào)道類似[11-12]。乙酰膽堿酯酶(AChE)是目前研究的最廣泛、最成熟的生物標(biāo)志物(biomarker)之一,可用于對(duì)自然環(huán)境中極低濃度污染物的檢測(cè)[13]。本研究發(fā)現(xiàn),不同染毒時(shí)間和不同染毒濃度的處理下,AChE酶活性均受到抑制,然而處理之間差異卻不顯著,與AChE基因相對(duì)表達(dá)量測(cè)定結(jié)果不一致。細(xì)胞色素P450(CYP450)屬于誘導(dǎo)酶,其降解有毒物質(zhì)的能力受基因表達(dá)調(diào)控、翻譯后修飾等影響[14]。研究發(fā)現(xiàn)與酶活測(cè)定相比,氨氮對(duì)基因(SOD、CYP450)轉(zhuǎn)錄的影響更早,脅迫后期的變化趨勢(shì)與酶活測(cè)定結(jié)果基本一致。這充分說明斑馬魚酶活性以及相應(yīng)基因轉(zhuǎn)錄水平上的變化能夠作為生物標(biāo)記物有效的監(jiān)測(cè)氨氮對(duì)水體環(huán)境的污染,且后者更具時(shí)效性。

4 結(jié) 論

本研究檢測(cè)了氨氮對(duì)斑馬魚肝臟組織AChE和SOD酶活性的影響,并在基因轉(zhuǎn)錄水平分析了氨氮對(duì)相應(yīng)基因相對(duì)表達(dá)的效應(yīng)。結(jié)果顯示,與酶活性測(cè)定相比,相應(yīng)基因(SOD和CYP450)在轉(zhuǎn)錄水平上的變化出現(xiàn)更早,更靈敏。利用污染物濃度與酶蛋白基因表達(dá)水平的定量關(guān)系能夠快速有效的診斷環(huán)境污染變化對(duì)生物體造成的損傷,以便對(duì)環(huán)境污染做出早期預(yù)警。

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Effect of activity and gene expression of three enzymes on Zebrafish(Daniorerio) stressed by ammonia nitrogen

ZHOUYing1,SUNLizong2,LIUZhihong2,TAIPeidong2,LIYueying1

(1. College of Life Science, Shenyang Normal Unicersity, Shenyang 110034, China;2. Institute of Applied Ecology, Chinese Academy of Sciences, Shenyang 110034, China)

Objective: In order to provide a theoretical basis for the rapid and accurate evaluation of ammonia in water environment, the toxic effect of ammonia to zebra fish (Daniorerio) was discussed by two ways of enzyme activity determination and enzyme gene expression. Methods: The toxicity tests were conducted to determine the lethal toxic effect of ammonia to Daniorerio. Superoxide dismutase (SOD) and acetylcholinesterase (AChE) activities were measured after 3 d and 14 d. RNA from liver was extracted and transcription amounts of AChE,Cu/Zn-SOD, CYP450 were determined by semi-quantitative RT-PCR determination. Conclusion: The 96 h of half lethal concentration (LC50) value was 86.36 mg·L-1. The activity of SOD was without obvious change after 3 d, while a trend of “more active at low concentration and less active at high concentration” was shown after exposed by 14 days. The activity of AChE was inactive all the time and a significant “dose-response” relationship was observed. Compared with enzyme’s activity, the corresponding of gene expression was more sensitive, making it more time-sensitive in the detection of ammonia pollution.

ammonia nitrogen; Daniorerio; SOD; AChE; CYP450

2015-09-30。

國(guó)家重大專項(xiàng)資助項(xiàng)目(2012ZX07505-001); 沈陽(yáng)市科技局計(jì)劃項(xiàng)目(F15-199-1-22)。

周 瑩(1990-),女,河南南陽(yáng)人,沈陽(yáng)師范大學(xué)碩士研究生; 通信作者:李玥瑩(1966-),女,遼寧沈陽(yáng)人,沈陽(yáng)師范大學(xué)教授,博士。

1673-5862(2016)01-0088-04

X-1

A

10.3969/ j.issn.1673-5862.2016.01.020