閆　興， 向夢(mèng)雄， 王常高，杜　馨， 林建國(guó)， 蔡　俊

(1 湖北工業(yè)大學(xué)發(fā)酵工程教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 湖北 武漢 430068；

2 工業(yè)發(fā)酵湖北省協(xié)同創(chuàng)新中心， 湖北 武漢 430068)

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代謝調(diào)節(jié)劑對(duì)三孢布拉氏霉菌發(fā)酵的影響

閆興1,2， 向夢(mèng)雄1,2， 王常高1,2，杜馨1,2， 林建國(guó)1,2， 蔡俊1,2

(1 湖北工業(yè)大學(xué)發(fā)酵工程教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 湖北 武漢 430068；

2 工業(yè)發(fā)酵湖北省協(xié)同創(chuàng)新中心， 湖北 武漢 430068)

[摘要]三孢布拉氏霉菌發(fā)酵生產(chǎn)β-胡蘿卜素仍存在產(chǎn)物含量低、代謝調(diào)控方法單一等問(wèn)題。為了進(jìn)一步提高三孢布拉氏霉菌菌絲體中β-胡蘿卜素的含量，通過(guò)向初始發(fā)酵培養(yǎng)基中添加不同的代謝調(diào)節(jié)劑，探究其對(duì)三孢布拉氏霉菌產(chǎn)β-胡蘿卜素的影響。研究發(fā)現(xiàn)，發(fā)酵培養(yǎng)基中添加0.5%的丙酮酸鈉、0.1%的Span-20、0.1%的2,6-二叔丁基對(duì)甲酚(BHT)、3%的甘油均能提高β-胡蘿卜素含量，其中抗氧化劑BHT的促進(jìn)作用最大，β-胡蘿卜素含量達(dá)到4.25 mg/g，相比空白組提高了72.1%。不同濃度的液體石蠟對(duì)β-胡蘿卜素含量沒(méi)有促進(jìn)作用，但其促進(jìn)生物量的增大,使β-胡蘿卜素的產(chǎn)量得到提升。

[關(guān)鍵詞]代謝調(diào)節(jié)劑； 三孢布拉氏霉菌； β-胡蘿卜素

β-胡蘿卜素(β-carotene)是一種天然的類胡蘿卜素，其含有2個(gè)β-紫羅酮環(huán)和4個(gè)異戊二烯側(cè)鏈，分子式為C40H56[1]。理論上1分子β-胡蘿卜素可轉(zhuǎn)化為2分子維生素A，故稱為維生素A原，其具有抗氧化、抗癌、免疫等多種生物活性，主要應(yīng)用于食品、保健品、化妝品、醫(yī)藥、飼料以及化工等領(lǐng)域[2-3]。目前，β-胡蘿卜素的生產(chǎn)方法主要有化學(xué)合成法、天然提取法、生物合成法[4]。其中生物合成法由于不受環(huán)境因素以及原料、產(chǎn)地等的限制而受到廣泛關(guān)注[5]。三孢布拉氏霉菌是β-胡蘿卜素工業(yè)化生產(chǎn)的優(yōu)良菌株，具有生物量大、單位菌體β-胡蘿卜素含量高等優(yōu)點(diǎn)[6]。但在工業(yè)化生產(chǎn)過(guò)程中仍存在著諸多問(wèn)題，三孢布拉氏霉菌在液體培養(yǎng)基中易于結(jié)團(tuán)，導(dǎo)致發(fā)酵液變得粘稠，影響傳質(zhì)和傳熱[7]。此外，反應(yīng)器中溶氧濃度亦對(duì)其發(fā)酵生產(chǎn)β-胡蘿卜素有影響。因此，對(duì)β-胡蘿卜素的發(fā)酵工藝條件仍需進(jìn)一步研究。本文根據(jù)三孢布拉氏霉菌的異化作用類型、β-胡蘿卜素合成的代謝途徑、發(fā)酵液的流體性質(zhì)以及β-胡蘿卜素的理化性質(zhì)等特點(diǎn)，研究了氧載體、代謝前體物、表面活性劑、抗氧化劑等對(duì)三孢布拉氏霉產(chǎn)β-胡蘿卜素的影響。

1材料與方法

1.1材料與試劑

1.1.1實(shí)驗(yàn)菌株三孢布拉氏霉菌(Blakesleatrispora)，包括正菌ATCC 14271，負(fù)菌ATCC 14272，湖北工業(yè)大學(xué)輕工學(xué)部209實(shí)驗(yàn)室保藏。

1.1.2實(shí)驗(yàn)試劑馬鈴薯、大豆粉、玉米粉、大豆油，均為市售；玉米漿，山東濰坊盛泰藥業(yè)有限公司；2,6-二叔丁基對(duì)甲酚(BHT)，阿拉丁生物試劑公司；丙酮酸鈉，BIOSHARP生物試劑公司；葡萄糖、甘油、液體石蠟、KH2PO4、MgSO4、VB1、Span-20，均為分析純并購(gòu)于上海國(guó)藥集團(tuán)。

1.1.3培養(yǎng)基斜面培養(yǎng)基：新鮮去皮馬鈴薯(煮沸取浸出液)，100 g/L；葡萄糖，20 g/L；瓊脂粉，20 g/L；pH，自然。

種子培養(yǎng)基：大豆粉，30 g/L；玉米粉，30 g/L；KH2PO4，1 g/L；MgSO4，0.2 g/L；pH 6.5。

發(fā)酵培養(yǎng)基：葡萄糖，85.9 g/L；玉米漿，30 mL；，大豆油10 mL；KH2PO4，5.3 g/L；MgSO4，0.5 g/L。VB1，0.01 g/L；pH, 7.0。

1.2儀器與設(shè)備

ZSD-1270型全自動(dòng)新型生化培養(yǎng)箱，上海智城分析儀器制造有限公司； TG16-Ⅱ型高速離心機(jī)，長(zhǎng)沙平凡儀器儀表有限公司； ZHWY系列雙層恒溫培養(yǎng)振蕩器，上海智城分析儀器制造有限公司；DZF-6020型真空干燥箱，上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；GW-2000型可見分光光度計(jì)，上海精密科學(xué)儀器有限公司。

1.3方法

1.3.1斜面培養(yǎng)三孢布拉氏霉正負(fù)菌分別接種至斜面培養(yǎng)基，置于28 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)5 d，待孢子長(zhǎng)滿整個(gè)斜面。

1.3.2種子培養(yǎng)正負(fù)菌各取一環(huán)孢子接種至種子培養(yǎng)基，種子培養(yǎng)基裝于250 mL三角瓶中，裝液量為50 mL。培養(yǎng)溫度28 ℃，搖床轉(zhuǎn)速200 r/min，正負(fù)菌培養(yǎng)時(shí)間分別為20 h和25 h。

1.3.3發(fā)酵培養(yǎng)將生長(zhǎng)至對(duì)數(shù)期的正負(fù)菌株以1:9的比例按體積分?jǐn)?shù)為6%的接種量接種至發(fā)酵培養(yǎng)基中，發(fā)酵培養(yǎng)基裝于250 mL三角瓶中，裝液量為50 mL。培養(yǎng)溫度28 ℃，搖床轉(zhuǎn)速180 r/min，震蕩培養(yǎng)6 d。

1.3.4生物量(biomass)的測(cè)定搖瓶發(fā)酵結(jié)束后，將發(fā)酵液用雙層紗布過(guò)濾，清水沖洗2次后，置于50℃真空干燥箱中烘干至恒重后稱量。

w=(M2-M1)×20

式中：w為生物量，g/L；M1為紗布的質(zhì)量，g；M2為烘干后紗布和干菌體的質(zhì)量，g；20即將生物量單位由g/50 mL換算成g/L。

1.3.5β-胡蘿卜素含量(β-carotene content)的測(cè)定將真空干燥后所得干菌體，用研缽研磨后準(zhǔn)確稱取0.01 g的菌絲體粉末，將稱取的粉末加入50 mL石油醚避光萃取至無(wú)色。運(yùn)用分光光度法在波長(zhǎng)450 nm下測(cè)定其吸光度值，并依據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程計(jì)算出菌絲體中β-胡蘿卜素含量[8]

式中：φ為β-胡蘿卜素含量；C為由標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸方程算得的樣品濃度，μg/mL；m為萃取所用的干菌體質(zhì)量，g；V為萃取所用的石油醚體積，50 mL；1000即將β-胡蘿卜素含量單位由μg/g換算成mg/g。

1.4試驗(yàn)設(shè)計(jì)

1.4.1液體石蠟對(duì)三孢布拉氏霉產(chǎn)β-胡蘿卜素的影響發(fā)酵培養(yǎng)基配制過(guò)程中依次添加液體石蠟0、10、20、30、40 mL，發(fā)酵6 d后分別測(cè)定生物量及β-胡蘿卜素含量。

1.4.2丙酮酸鈉對(duì)三孢布拉氏霉產(chǎn)β-胡蘿卜素的影響發(fā)酵培養(yǎng)基配制過(guò)程中依次添加丙酮酸鈉0.25、0.5、0.75、1 g/L，發(fā)酵6 d后分別測(cè)定生物量及β-胡蘿卜素含量。

1.4.3Span-20對(duì)三孢布拉氏霉產(chǎn)β-胡蘿卜素的影響發(fā)酵培養(yǎng)基配制過(guò)程中依次添加0、0.025、0.05、0.075、0.1 mL，發(fā)酵6 d后分別測(cè)定生物量及β-胡蘿卜素含量。

1.4.4BHT對(duì)三孢布拉氏霉產(chǎn)β-胡蘿卜素的影響發(fā)酵培養(yǎng)基配制過(guò)程中依次添加0、0.025、0.05、0.075、0.1 g/L，發(fā)酵6 d后分別測(cè)定生物量及β-胡蘿卜素含量。

1.4.5甘油對(duì)三孢布拉氏霉產(chǎn)β-胡蘿卜素的影響發(fā)酵培養(yǎng)基配制過(guò)程中依次添加甘油0、0.5、1、1.5、2 mL，發(fā)酵6 d后分別測(cè)定生物量及β-胡蘿卜素含量。

2結(jié)果與討論

2.1液體石蠟對(duì)三孢布拉氏霉產(chǎn)β-胡蘿卜素的影響

三孢布拉氏霉菌的異化作用類型為需氧型，菌體生長(zhǎng)過(guò)程中需要消耗大量氧氣。液體石蠟作為一種新的液相添加到發(fā)酵培養(yǎng)基中，一方面增加氧氣在其中的溶解度，另一方面減小氣液傳氧阻力，從而提高傳氧效率，同時(shí)可以引起三孢布拉氏霉菌體中的氧化應(yīng)激反應(yīng)，從而提高SOD酶和CAT酶酶活，有利于β-胡蘿卜素的合成[9-11]。

圖 1　液體石蠟添加量對(duì)生物量和β-胡蘿卜素含量的影響

從圖1可以看出，添加不同濃度的液體石蠟可以促進(jìn)生物量的增加，液體石蠟的添加量為2%時(shí)，生物量達(dá)到最大。但是液體石蠟對(duì)三孢布拉氏霉合成β-胡蘿卜素并沒(méi)有促進(jìn)作用，反而抑制了β-胡蘿卜素含量。可能由于其對(duì)微生物細(xì)胞有一定的毒性，導(dǎo)致了β-胡蘿卜素含量下降，但β-胡蘿卜素的產(chǎn)量仍有所提高。

2.2丙酮酸鈉對(duì)三孢布拉氏霉產(chǎn)β-胡蘿卜素的影響

通過(guò)向發(fā)酵培養(yǎng)基中添加一定濃度的代謝前體物質(zhì)，可以控制生產(chǎn)菌的合成方向和增加目標(biāo)產(chǎn)物產(chǎn)量。當(dāng)代謝前體物是合成過(guò)程中的限制因素時(shí)，前體物質(zhì)加入量越多，目標(biāo)產(chǎn)物產(chǎn)量越高。但前體物質(zhì)的濃度越大，利用率越低，甚至對(duì)產(chǎn)物產(chǎn)生抑制作用。丙酮酸是EMP途徑和TCA循環(huán)結(jié)點(diǎn)，一定濃度的丙酮酸能夠促進(jìn)產(chǎn)能的增多。同時(shí)其能夠增加β-胡蘿卜素合成過(guò)程中IPP途徑通量，促進(jìn)β-胡蘿卜素的合成[12]。向發(fā)酵培養(yǎng)基中添加丙酮酸鈉，其與丙酮酸具有相似的作用。

圖 2　丙酮酸鈉添加量對(duì)生物量和β-胡蘿卜素含量的影響

從圖2可以看出，當(dāng)丙酮酸鈉的濃度為0.5%時(shí)，生物量和β-胡蘿卜素含量都達(dá)到最大。其添加量大于0.5%時(shí)，生物量呈下降趨勢(shì)，β-胡蘿卜素含量也降低但維持在一定水平。可能出現(xiàn)中間產(chǎn)物抑制作用，使代謝供能途徑受阻，造成生物量下降。β-胡蘿卜素代謝支路也受到一定的影響，使β-胡蘿卜素含量降低至一定水平。

2.3Span-20對(duì)三孢布拉氏霉產(chǎn)β-胡蘿卜素的影響

表面活性劑不僅能夠改變發(fā)酵液的流體性質(zhì)，有助于三孢布拉氏霉菌菌絲體的分散，而且能夠改變細(xì)胞膜的通透性，促進(jìn)三孢布拉氏霉菌對(duì)培養(yǎng)基中營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的吸收及代謝物的分泌。Span-20具有特殊的疏水基團(tuán)，并且比Span-60、Tween-80更易溶于水，具有獨(dú)特的理化性質(zhì)[13]。

圖 3　Span-20添加量對(duì)生物量和β-胡蘿卜素含量的影響

從圖3可以看出，當(dāng)Span-20的添加量為0.1%時(shí)，生物量和β-胡蘿卜素含量都達(dá)到最大。繼續(xù)增加Span-20的濃度，生物量和β-胡蘿卜素含量減小，三孢布拉氏霉生長(zhǎng)和代謝均受到抑制作用?？赡苡捎诟哂?.1%濃度的Span-20對(duì)細(xì)胞膜的通透性進(jìn)一步增大，導(dǎo)致部分細(xì)胞破裂，或吸附于細(xì)胞周圍對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生毒性，從而造成生物量的減少和β-胡蘿卜素的流失。

2.4BHT對(duì)三孢布拉氏霉產(chǎn)β-胡蘿卜素的影響

β-胡蘿卜素具有較強(qiáng)的還原性，發(fā)酵過(guò)程中易被空氣中的氧氣氧化。BHT作為抗氧化劑被添加到發(fā)酵培養(yǎng)基中，可以在一定程度上保護(hù)生成的β-胡蘿卜素不被氧化，從而使β-胡蘿卜素含量提高[14]。

圖 4　BHT添加量對(duì)生物量和β-胡蘿卜素含量的影響

從圖4可以看出，添加不同濃度的BHT均對(duì)生物量和β-胡蘿卜素含量有促進(jìn)作用?？赡苡捎贐HT對(duì)菌體生長(zhǎng)所需的還原性酶類有保護(hù)作用，另一方面對(duì)合成的β-胡蘿卜素亦有保護(hù)作用。BHT的添加量為0.1%時(shí)，生物量和β-胡蘿卜素含量達(dá)到最大。當(dāng)添加量大于0.1%時(shí)，生物量和β-胡蘿卜素含量均有不同程度的下降。可能由于高濃度BHT對(duì)細(xì)胞有一定的毒性，抑制了生物量和β-胡蘿卜素含量。

2.5甘油對(duì)三孢布拉氏霉產(chǎn)β-胡蘿卜素的影響

甘油可以作為許多微生物利用的碳源，同時(shí)其還具有助表面活性劑作用。甘油被菌體代謝后產(chǎn)生丙酮酸，作為代謝中間物促進(jìn)β-胡蘿卜素的合成。另外，其促進(jìn)菌絲分散，細(xì)胞膜通透性增加，使傳質(zhì)和傳氧得到加強(qiáng)[15]。

圖 5　甘油添加量對(duì)生物量和β-胡蘿卜素含量的影響

從圖5可以看出，培養(yǎng)基中添加3%的甘油，β-胡蘿卜素含量達(dá)到最大。甘油濃度繼續(xù)增大，β-胡蘿卜素含量降低，但生物量仍舊呈上升趨勢(shì)?？赡苡捎谶^(guò)多的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)被用于前期合成菌體，對(duì)后期產(chǎn)物的合成供能不足。過(guò)量的甘油可能進(jìn)一步增大細(xì)胞膜通透性，造成菌絲體中β-胡蘿卜素含量減少。

3結(jié)論

1)通過(guò)研究多種代謝調(diào)節(jié)劑對(duì)三孢布拉氏霉菌產(chǎn)β-胡蘿卜素的影響，找到了不同代謝調(diào)節(jié)劑的最適添加量。研究發(fā)現(xiàn)，抗氧化劑BHT對(duì)提高三孢布拉氏霉菌菌絲體中β-胡蘿卜素含量的促進(jìn)作用最大，說(shuō)明發(fā)酵過(guò)程中β-胡蘿卜素的氧化是阻礙β-胡蘿卜素含量提高的主要限制性因素。2)研究了雙功能試劑甘油對(duì)三孢布拉氏霉產(chǎn)β-胡蘿卜素的影響，當(dāng)其添加量為3%時(shí)，β-胡蘿卜素含量達(dá)到4.14 mg/g，較空白組提高了78.7%。可見其比單一效應(yīng)的代謝調(diào)節(jié)劑有更好的促進(jìn)作用。

[參考文獻(xiàn)]

[1]顏?zhàn)魑? 利用三孢布拉霉菌發(fā)酵產(chǎn)β-胡蘿卜素的研究[D]. 武漢：湖北工業(yè)大學(xué)，2013.

[2]Sommerburg O,De Spirts,Mattern A. Supplementation with red palm oil increases β-carotene and vitamin a blood levels in patients with cystic fibrosis[J]. Mediators of inflammation,2015,2015(2015):1-7.

[3]Vereshchagina O A, Tereshina V M. Trisporoids and carotenogenesis inBlakesleatrispora[J].Microbiology,2014,83(5):438-449.

[4]惠伯棣. 胡蘿卜素化學(xué)及生物化學(xué)[M]. 北京：中國(guó)輕工業(yè)出版社，2005.

[5]王雪. β-胡蘿卜素的研究進(jìn)展[J]. 中國(guó)化工貿(mào)易,2013，5(5):193-193.

[6]吳品芳，陸茂林. 三孢布拉氏霉合成輔酶Q10及其代謝調(diào)控[J]. 食品與生物技術(shù)學(xué)報(bào)，2006，25(5):61-65.

[7]尹金鳳，王志軒，吳欣森, 等. 三孢布拉氏霉發(fā)酵產(chǎn)β-胡蘿卜素的研究進(jìn)展[J]. 食品科學(xué), 2014，35(13): 316-325.

[8]Zuowen Yan, Changgao Wang, Jianguo Lin, et al. Medium optimization using mathematical statistics for production of β-Carotene byBlakesleatrisporaand fermenting process regulation[J]. Food Science and Biotechnology, 2013, 22(6): 1667-1673.

[9]Nanou K, Roukas T. Oxidative stress response ofBlakesleatrisporainduced by iron ions during carotene production in shake flask culture[J]. Applied biochemistry and biotechnology,2013,169(8):2281-2289.

[10]Hu X, Ma X, Tang P. Improved β-Carotene production by oxidative stress inBlakesleatrisporainduced by liquid paraffin[J]. Biotechnology letters,2013,35(4):559-563.

[11]Wang H B, Luo J, Huang X Y, et al. Oxidative stress response ofBlakesleatrisporainduced by H2O2 during β-carotene biosynthesis[J]. J Ind Microbiol Biotechnol,2014,41:555-561.

[12]師艷秋，辛秀蘭，袁其朋, 等. 發(fā)酵促進(jìn)劑在三孢布拉氏霉生產(chǎn)番茄紅素中的應(yīng)用[J]. 食品與發(fā)酵工業(yè)，2012，38(1)：133-137.

[13]向夢(mèng)雄，閆興,蔡俊, 等. 發(fā)酵促進(jìn)劑對(duì)三孢布拉氏霉菌發(fā)酵產(chǎn)β-胡蘿卜素的影響[J]. 氨基酸與生物資源，2015，37(1):56-60.

[14]秦敬改. 發(fā)酵法生產(chǎn)β-胡蘿卜素[D]. 北京：北京化工大學(xué),2003.

[15]王春玲. 靈菌紅素生物合成與分離純化研究[D]. 合肥：合肥工業(yè)大學(xué)，2007.

[責(zé)任編校： 張眾]

Effect of Metabolic Regulator on β- Carotene Production by Blakeslea Trispora

YAN Xing, XIANG Mengxiong, WANG Changgao, DU Xin, LIN Jianguo, CAI Jun

(KeyLaboratoryofFermentationEngin.(MinistryofEducation),CollegeofBioengineering,HubeiUniv.ofTech.,Wuhan430068,China)

Abstract：Currently, problems such as low content of products, single metabolic regulation and so on exist in the fermentation production of β-carotene by Blakeslea trispora. In order to further improve the content of Blakeslea trispora’ s mycelium β-carotene, the present study added different metabolic regulators in the initial fermentation medium, exploring its impact on the β- carotene produced by Blakeslea trispora. The study found that fermentation medium added to 0.5% of pyruvic acid sodium, 0.1% of Span-20, 0.1% of butylated hydroxytoluene(BHT), 3% of glycerol can improve β- carotene content, which promote the greatest is antioxidant BHT, β- carotene content approach to 4.25mg/g, compared to the control group improved 72.1%. And different concentration of liquid paraffin could not increase β- carotene content, but the promotion of biomass production increases, so the production of β-carotene may be raised.

Keywords：Metabolic regulator; Blakeslea trispora; β- carotene

[中圖分類號(hào)]Q815

[文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼]：A

[文章編號(hào)]1003-4684(2016)01-0085-04

[作者簡(jiǎn)介]閆興(1993-)， 男， 湖北洪湖人，湖北工業(yè)大學(xué)本科生，研究方向?yàn)樯锕こ?蔡俊(1968-)，男，湖北孝感人，湖北工業(yè)大學(xué)教授，研究方向?yàn)槲⑸锇l(fā)酵工程

[基金項(xiàng)目]國(guó)家自然科學(xué)基金(31401807)

[收稿日期]2015-07-24