潘　文，韓　偉，姜國華，郝霖雨（.中牧實(shí)業(yè)股份有限公司中牧研究院農(nóng)業(yè)部獸用生物制品與化學(xué)藥品重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京海淀00070；.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究所，北京海淀0008）

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豬乙腦傳代細(xì)胞活疫苗（SAl4-14-2株）對(duì)仔豬的安全性試驗(yàn)

潘文1，韓偉1，姜國華2，郝霖雨1
（1.中牧實(shí)業(yè)股份有限公司中牧研究院農(nóng)業(yè)部獸用生物制品與化學(xué)藥品重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京海淀100070；2.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究所，北京海淀100081）

摘要：評(píng)價(jià)以Vero細(xì)胞為基質(zhì)的豬乙腦傳代細(xì)胞活疫苗（SA14-14-2株）對(duì)仔豬的安全性，將豬乙腦傳代細(xì)胞活疫苗，通過1次超劑量（10倍劑量）免疫40～45日齡的仔豬，同時(shí)設(shè)立病毒液組、凍干保護(hù)劑組、空白對(duì)照組，監(jiān)測(cè)仔豬體溫和臨床癥狀，采集免疫前和免疫后第1、2、3、5、7天血漿，仔豬于免疫后第14天無菌取腦組織。對(duì)采集的血樣及腦組織進(jìn)行蝕斑檢測(cè)，并對(duì)血樣及腦組織盲傳3代的細(xì)胞培養(yǎng)液進(jìn)行RT-PCR檢測(cè)。結(jié)果，試驗(yàn)豬免疫前后臨床觀察、體溫，免疫后接種部位均未見異常。蝕斑法和RT-PCR法檢測(cè)各試驗(yàn)組仔豬血漿和腦組織提取液均未檢出乙腦病毒。表明以Vero細(xì)胞為基質(zhì)的豬乙腦傳代細(xì)胞活疫苗（SA14-14-2株）對(duì)仔豬是安全的。

關(guān)鍵詞：流行性乙型腦炎；SA14-14-2減毒株；Vero細(xì)胞；疫苗；安全性

流行性乙型腦炎（乙腦）是由乙型腦炎病毒（JEV）引起的一種蚊媒性人獸共患的傳染病。豬群感染最為普遍，懷孕母豬可表現(xiàn)為高熱、流產(chǎn)、死胎和木乃伊胎，公豬則出現(xiàn)睪丸炎。乙腦病毒主要存在于中樞神經(jīng)系統(tǒng)、腦脊液、血液和死胎仔豬的腦組織中。

目前，我國用于預(yù)防豬乙腦感染的疫苗主要是豬乙型腦炎減毒活疫苗（SA14-14-2株）。該疫苗采用原代地鼠腎細(xì)胞作為病毒培養(yǎng)基質(zhì)，生產(chǎn)中存在地鼠來源緊張、生產(chǎn)成本高、產(chǎn)量低、外源因子多、批次差異大等缺點(diǎn)。

1995年，世界衛(wèi)生組織（WHO）推薦Vero細(xì)胞可作為生產(chǎn)疫苗的細(xì)胞基質(zhì)。以Vero細(xì)胞為基質(zhì)生產(chǎn)的疫苗均顯示出了良好的安全性和免疫原性，1998年，Vero細(xì)胞乙型腦炎滅活疫苗（P3株）被批準(zhǔn)上市，用于人類乙腦的免疫接種，研究以Vero細(xì)胞為基質(zhì)的豬乙腦活疫苗（SA14-14-2株）也將具有較好的應(yīng)用前景。

本試驗(yàn)通過一次超劑量免疫40～45日齡的仔豬評(píng)價(jià)以Vero細(xì)胞為基質(zhì)的豬乙腦傳代細(xì)胞活疫苗（SA14-14-2株）的安全性，為SA14-14-2株豬乙腦傳代細(xì)胞活疫苗的研制提供了試驗(yàn)基礎(chǔ)。

1　材料

1.1細(xì)胞、病毒、血清BHK-21細(xì)胞、Vero細(xì)胞株，均購自于中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所。

乙腦病毒液，是用Vero細(xì)胞將乙腦SA14-14-2株傳至F10代的病毒液，病毒含量為6.20 log PFU/mL。陽性對(duì)照，是用BHK-21細(xì)胞將乙腦SA14-14-2株培養(yǎng)至F7代的病毒液。豬傳染性胃腸炎病毒（TGEV）、豬瘟病毒（CSFV）、豬繁殖與呼吸綜合征病毒（PRRSV）和豬偽狂犬病病毒（PRV），均由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究所姜國華老師提供。

1.2主要試劑及培養(yǎng)基DMEM、MEM為Gibco公司產(chǎn)品；胎牛血清為Hyclone公司產(chǎn)品；水解乳蛋白、胰酶、甲基纖維素、肝素納、結(jié)晶紫，均為Sigma公司產(chǎn)品。Qiagen onestep RT-PCR Kit、DNA Ladder Marker、Nuclease Inhibitor、Trizol試劑為Qiagen公司產(chǎn)品。豬乙型腦炎病毒ELISA抗體檢測(cè)試劑盒為武漢科前動(dòng)物生物制品有限責(zé)任公司產(chǎn)品。

1.3試驗(yàn)動(dòng)物40～45日齡乙腦抗體陰性健康易感仔豬。

2　方法

2.1試驗(yàn)豬的篩選及分組對(duì)140只30日齡的仔豬分別進(jìn)行乙腦ELISA抗體檢測(cè)試劑盒檢測(cè)和血凝抑制試驗(yàn)，篩選乙腦抗體雙陰性健康仔豬。試劑盒檢測(cè)按照試劑盒說明書操作，血凝抑制試驗(yàn)按照“SNT1445-2004動(dòng)物流行性乙型腦炎微量血凝抑制試驗(yàn)”操作。

取篩選獲得的乙腦抗體雙陰性健康仔豬分為4組，耳后肌肉注射，每組5頭。第1組每頭豬注射10倍劑量豬乙腦傳代細(xì)胞活疫苗；第2組每頭豬注射10倍劑乙腦病毒液；第3組每頭豬注射10倍劑量（10 mL）凍干保護(hù)劑；第4組為空白對(duì)照組，不免疫。

2.2臨床觀察與樣品采集免疫前，觀察仔豬5 d，每天飼喂前測(cè)量體溫。免疫后觀察14 d，每天飼喂前測(cè)量體溫；采集免疫前和免疫后第1、2、3、5、7天血漿，仔豬于免疫后第14天剖殺，無菌取腦組織。

2.3血漿和腦組織的蝕斑檢測(cè)將各試驗(yàn)組仔豬的血漿樣本和腦組織提取液分別接種BHK-21細(xì)胞單層，并用DMEM甲基纖維素半固體培養(yǎng)基于37℃覆蓋培養(yǎng)3～4 d，經(jīng)固定及染色后，若出現(xiàn)病毒蝕斑，且經(jīng)乙腦病毒特異性鑒定（標(biāo)準(zhǔn)血清中和培養(yǎng)法）為陽性，即判定血漿樣本和腦組織提取液乙腦病毒檢測(cè)為陽性，否則為陰性。

2.4血漿和腦組織盲傳3代的細(xì)胞培養(yǎng)液的RTPCR檢測(cè)

2.4.1JEV-RNA模板的制備按照RNA提取方法[1]提取血漿和腦組織盲傳3代細(xì)胞培養(yǎng)液中的乙腦病毒RNA。

2.4.2引物合成根據(jù)“GB/T 22333-2008日本乙型腦炎病毒反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)試驗(yàn)”方法中公布的引物基因序列，由北京三博遠(yuǎn)志生物科學(xué)技術(shù)有限公司合成引物。

2.4.3RT-PCR反應(yīng)用Qiagen一步RT-PCR試劑盒配套緩沖液及酶體系，反應(yīng)液體系（25 μL）為：5×PCR Buffer 5 μL，10 mmol/L dNTP 1 μL，10 μmol/L上下游引物3 μL，混合酶液1 μL，5-Q solution 5 μL，RNAse inhibitor 0.3 μL，RNA模板9.7 μL。反應(yīng)程序?yàn)?0℃30 min，95℃預(yù)變性15 min；94℃0.5 min，50℃0.8 min，72℃1 min，40個(gè)循環(huán)，最后72℃延伸10 min。

2.4.4特異性檢測(cè)用RT-PCR方法擴(kuò)增JEV、PRRSV、CSFV、PRV、TGEV等病毒，檢測(cè)該方法的特異性。

2.4.5敏感性檢測(cè)將乙腦病毒液進(jìn)行10倍倍比稀釋后，提取RNA，進(jìn)行RT-PCR檢測(cè)擴(kuò)增，評(píng)價(jià)該方法的敏感性。

2.5RT-PCR檢測(cè)血漿和腦組織盲傳3代的細(xì)胞培養(yǎng)液血漿和腦組織提取液檢測(cè)為乙腦陰性的樣本，用含2%小牛血清DMEM培養(yǎng)基于BHK-21細(xì)胞單層中，35℃條件下連續(xù)盲傳3代后用RT-PCR方法進(jìn)行檢測(cè)。

3　結(jié)果與分析

3.1試驗(yàn)豬的篩選結(jié)果對(duì)140只30日齡的仔豬分別進(jìn)行乙腦ELISA抗體試劑盒檢測(cè)和血凝抑制試驗(yàn)，篩選出25頭乙腦抗體雙陰性健康仔豬，乙腦抗體雙陰性檢測(cè)率為17.86%，取其中20頭仔豬用于試驗(yàn)。

3.2試驗(yàn)豬體溫、臨床觀察結(jié)果試驗(yàn)期間，試驗(yàn)豬體溫均保持在37.0℃～39.5℃之間，免疫后未見試驗(yàn)豬體溫升高至40℃以上，且接種部位均未見異常，臨床狀態(tài)觀察，采食、精神狀態(tài)均正常。

3.3血漿和腦組織的蝕斑檢測(cè)蝕斑法檢測(cè)各試驗(yàn)組仔豬血樣均未檢出病毒血癥，仔豬腦組織提取液病毒檢測(cè)均為陰性（表1）。

表1　血漿和腦組織的蝕斑檢測(cè)結(jié)果

圖1　RT- PCR檢測(cè)J EV的特異性結(jié)果M：600 bp DNA ladder Marker；1：豬傳染性胃腸炎病毒；2：豬瘟病毒；3：豬繁殖與呼吸綜合征病毒；4：豬偽狂犬病病毒；5：豬乙型腦炎病毒；6：空白對(duì)照

3.4RT-PCR檢測(cè)JEV的特異性檢測(cè)JEV，可擴(kuò)增到與預(yù)期大小相符的375 bp的特異性目的片段，而對(duì)PRRSV、CSFV、PRV、TGEV等病毒進(jìn)行檢測(cè)，均未檢出特異性條帶（見圖1）。3.5 RT-PCR檢測(cè)JEV的敏感性將已知病毒含量的乙腦病毒液，進(jìn)行10倍倍比稀釋，RT-PCR可檢出的最高稀釋滴度為10-4。經(jīng)計(jì)算本試驗(yàn)采用RT-PCR法檢測(cè)的最低JEV病毒粒子約為55個(gè)，如圖2所示。

圖2　RT- PCR檢測(cè)J EV的敏感性結(jié)果M：600 bp DNA ladder Marker；1：10-5稀釋度；2：10-4稀釋度；3：10-3稀釋度；4：10-2稀釋度；5：10-1稀釋度；7：毒價(jià)為6.2 log PFU/mL的乙腦毒液

3.6RT-PCR檢測(cè)血漿和腦組織盲傳3代的細(xì)胞培養(yǎng)液RT-PCR檢測(cè)血漿和腦組織盲傳3代的細(xì)胞培養(yǎng)液結(jié)果均為陰性，與上述3.3結(jié)果一致。圖3為RT-PCR檢測(cè)乙腦疫苗免疫組5頭仔豬腦組織盲傳3代的細(xì)胞培養(yǎng)液的結(jié)果。

圖3　RT- PCR檢測(cè)乙腦疫苗免疫組5頭仔豬腦組織盲傳3代的細(xì)胞培養(yǎng)液結(jié)果M：600 bp DNA ladder Marker；1-5：分別為乙腦疫苗免疫組5頭仔豬腦組織盲傳3代的細(xì)胞培養(yǎng)液；6：陽性對(duì)照BHK-21培養(yǎng)的SA14-14-2 F7代毒液；7：空白對(duì)照

4　討論

SA14-14-2株原代地鼠腎細(xì)胞乙腦減毒活疫苗能誘導(dǎo)產(chǎn)生體液和細(xì)胞雙重免疫應(yīng)答[2]，注射針次少，副反應(yīng)低，效果明顯優(yōu)于滅活疫苗，已在國內(nèi)外廣泛應(yīng)用并證明十分安全[3-5]，但考慮實(shí)際疫苗生產(chǎn)過程中培養(yǎng)基質(zhì)的均一性和疫苗質(zhì)量的可控性、安全性等問題，選擇Vero細(xì)胞進(jìn)行疫苗生產(chǎn)具有更大的優(yōu)勢(shì)，目前國內(nèi)獸醫(yī)領(lǐng)域還未見以Vero細(xì)胞為基質(zhì)制備豬乙腦活疫苗（SA14-14-2株）的報(bào)道，本試驗(yàn)以Vero細(xì)胞為基質(zhì)制備了豬乙腦傳代細(xì)胞活疫苗（SA14-14-2株），并在40～45日齡仔豬上進(jìn)行了該疫苗的安全性研究。

仔豬接種后，免疫組、病毒液組均未形成由豬乙腦SA14-14-2株引起的病毒血癥，仔豬腦組織中也未檢測(cè)出乙腦病毒，免疫組、病毒液組、耐熱保護(hù)劑組的仔豬注射部位及臨床癥狀均未見異常反應(yīng)，說明SA14-14-2株乙腦病毒進(jìn)入豬體后未引發(fā)豬乙腦相關(guān)的病癥，且活疫苗中的細(xì)胞基質(zhì)、保護(hù)劑配方等成分對(duì)仔豬是安全的。

本試驗(yàn)除了使用傳統(tǒng)的“蝕斑法”對(duì)血漿和

腦組織進(jìn)行乙腦病毒檢測(cè)外，還對(duì)血樣及腦組織盲傳3代的細(xì)胞培養(yǎng)液進(jìn)行了RT-PCR檢測(cè)，RT-PCR方法不僅簡(jiǎn)便、快捷，還具備敏感性高，特異性強(qiáng)的優(yōu)點(diǎn)，可以大大提高檢樣的效率。

本試驗(yàn)后續(xù)開展的豬乙腦傳代細(xì)胞活疫苗（SA14-14-2株）的免疫原性等其他相關(guān)試驗(yàn)必將為豬乙腦的防控帶來積極的影響。

參考文獻(xiàn)：

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Thesafety test of the J E live SA14- 14- 2 vaccinegrown on VERO cells in piglets

PAN Wen1，HAN Wei1，JIANG Guo-hua2，HAO Lin-yu1
（1.Zhongmu Institute，China Animal Husbandry Industry CO.LTD，Beijing 100070，China；2.Biotechnology Research Institute，Chinese Academy of Agricultural Sciences，Beijing 100081，China）

Abstract：To evaluate the safety of the epidemic encephalitis（JE）live（SA14-14-2）vaccine prepared using VERO cells in piglets.Ten time doses of JE live SA14-14-2 vaccine，JE virus，and protectant were inoculated in five 40-45-day-old piglets，respectively.Meanwhile blank control was set up.The piglets body temperature was measured and clinical status was observed everyday.Blood plasma samples were collected before immunization and after immunization at day 1，2，3，5，and 7.The whole brain tissue was sterilely separated at day 14 post-immune challenge.JE virus in plasma and brain tissue was detected by plaque-forming test. JE virus in three blind passages of plasma and brain cultivated on BHK-21 cells were detected by RT-PCR test.The clinical observation and body temperature of piglets before and after immunization，and vaccination site after immunization showed no abnormalities. JE virus in plasma and brain tissue was not detected by plaque-forming test and RT-PCR test.JE live SA14-14-2 vaccine cultivated on VERO cells is safe for piglets.

Key words：J E；SA-14-14-2 attenuated virus strain；VERO cells；vaccine；safety Corresponding author：HAO Lin-yu

通訊作者：郝霖雨，E-mail：hly29@sohu.com

作者簡(jiǎn)介：潘文（1985-），女，碩士，主要從事動(dòng)物疫苗研發(fā)工作，E-mail：Pstone1985@163.com

收稿日期：2014-03-21

中圖分類號(hào)：S852.65+1

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號(hào)：0529- 6005（2016）01- 0031- 03