張　輝，楊　歡，高云航，楊　倩，楊　亮，尹　劍，常曉博，崔煥忠（吉林農(nóng)業(yè)大學動物科技學院，吉林長春130118）

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豬繁殖與呼吸綜合征和豬瘟混合感染的診斷

張輝，楊歡，高云航，楊倩，楊亮，尹劍，常曉博，崔煥忠
（吉林農(nóng)業(yè)大學動物科技學院，吉林長春130118）

豬繁殖與呼吸綜合征（PRRS）俗稱豬藍耳病，是由豬繁殖與呼吸綜合征病毒（PRRSV）引起的以母豬發(fā)熱、厭食、流產(chǎn)、產(chǎn)死胎、弱胎和木乃伊胎等繁殖障礙以及仔豬的呼吸道癥狀和高死亡率為特征的一種疾病，且易引起免疫抑制，造成混合感染。該病于1987年在美國的北卡羅那、伊阿華、明尼蘇達等州的豬群首次暴發(fā)，1996年我國首次分離出PRRSV，PRRS給全世界的養(yǎng)豬業(yè)帶來了極大的經(jīng)濟損失。豬瘟（CSF）是由豬瘟病毒（CSFV）引起的嚴重危害全球養(yǎng)豬業(yè)的一種高度接觸性傳染病，發(fā)病率和死亡率高，造成的損失大。我國很多豬場都存在這2種傳染病，而且PRRSV和CSFV常呈混合感染給養(yǎng)豬業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟損失。

1　發(fā)病情況

2013年11月吉林公主嶺某養(yǎng)豬場仔豬與育成豬陸續(xù)發(fā)病，病豬精神不振，食欲不佳，便秘或腹瀉，糞便淡黃，呼吸困難，皮膚發(fā)紺，后期出現(xiàn)神經(jīng)癥狀，病程4～7 d，病情逐步惡化，并相繼死亡。部分母豬出現(xiàn)采食量下降，分娩母豬產(chǎn)死胎數(shù)上升。送檢5只死亡仔豬，其中哺乳仔豬2只，斷奶仔豬1只，木乃伊死胎2只。

2　臨床癥狀

病豬體溫升高至39.6℃～41.3℃之間，精神沉郁，采食減少或不食，病豬皮膚發(fā)紺，仔豬有不同程度的呼吸困難，呈腹式呼吸，頸下、腹部和后肢側皮膚出現(xiàn)淤血和水腫，部分病例皮下有出血斑，個別仔豬出現(xiàn)神經(jīng)癥狀。懷孕母豬出現(xiàn)流產(chǎn)、木乃伊胎和死胎。

3　病理剖檢

對送檢死亡豬只剖檢，病死豬耳朵發(fā)紺，豬鼻發(fā)紫，全身、四肢出現(xiàn)大小不等紫黑色圓形的斑點，肺臟腫大，肺間隔增寬，呈間質性肺炎（見前插彩版圖1），胸腔有大量黃色積液。全身淋巴結腫大（見前插彩版圖2），特別是肺門淋巴結。肝臟腫大，表面有灰白色壞死灶（見前插彩版圖3）。脾臟稍腫大、質地稍硬、邊緣梗死（見前插彩版圖4）。腎腫大、表面有針尖大出血點，心外膜出血，心包積液，腸系膜淋巴結中大出血，腸黏膜脫落，潰瘍?；孛ぐ暧屑~扣狀潰瘍。膀胱有潰瘍、出血。木乃伊胎臍帶出血明顯，腎大量出血，肝呈黃紅色，心包積液，肺肉樣變，淋巴結腫大。

4　實驗室診斷

4.1細菌檢測無菌采集病豬的心血、淋巴結、脾臟、肝臟和肺臟等組織，進行涂片鏡檢，未見致病菌；同時進行細菌常規(guī)培養(yǎng)，37℃培養(yǎng)48 h觀察，亦未見可疑菌落。

4.2RT-PCR檢測

4.2.1RNA提取無菌采集病豬的血液、肺臟、肝臟、淋巴結和脾臟等組織，加入無菌生理鹽水，冰浴中勻漿5 min（無組織殘留），將勻漿液轉移至無核酸酶離心管中，-75℃反復凍融3次。按照RNA Lyzol試劑盒，購自上海依科賽生物制品有限公司，操作說明提取總RNA。

4.2.2引物設計合成PRRSV引物根據(jù)GenBank上發(fā)表的豬繁殖與呼吸綜合征病毒ATCC VR-2332株（GenBank：U87392.3）的ORF7基因序列，設計一對特異性引物，上游引物：5′- AAC GGC AAG CAG CAG AAG-3′，下游引物：5′-TGC GTA GGC AAA CTA AAC TC-3′。CSFV引物引用羅廷榮等設計引物[2]，上游引物：5′-GCTCCTGGTTGGTAAC-CTCGG-3′，下游引物5′-TGATGCT GTCACACAGGTGAA-3′，引物由上海生工生物工程技術服務有限公司合成，PRRSV預計擴增片段大小為629 bp，CSFV預計擴增產(chǎn)物為508 bp。

4.2.3cDNA合成利用M-MLV第一鏈合成系統(tǒng)，購自Invitrogen公司，合成cDNA，反應體積為20 μL。將滅菌蒸餾水9 μL、總RNA 2 μL、10 mmol/ L dNTP混合物1 μL和Oligo（dT）201 μL加入到無核酸酶的微量離心管中，混合物在65℃加熱5 min后，迅速置于冰上冷卻。短暫離心后再加入5×第一鏈合成緩沖液4 μL、0.1 mol/L DTT 2 μL，輕輕混合后，在37℃下孵育2 min。加入M-MLV逆轉錄酶1 μL（200 U），混勻后，37℃孵育50 min。最后70℃加熱15 min終止反應，利用反應產(chǎn)物進行PCR。4.2.4 PCR反應利用2x Taq Master Mix（購自北京康為世紀生物科技有限公司）進行PCR反應，反應體積為20 μL，反應組成為：2×Taq Master Mix 10 μL、RNase-Free Water 8.0μL、上游引物和下游引物各0.5 μL、cDNA 1.0 μL。同時設陽性對照和陰性對照，陽性對照以PRRSV和CSFV標準株的cDNA為模板，陰性對照以滅菌蒸餾水為模板。PRRSV PCR反應循環(huán)參數(shù)為94℃預變性5 min；94℃變性30 s，50℃退火30 s，72℃延伸35 s，35個循環(huán)，最后72℃延伸8 min；CSFV PCR反應循環(huán)參數(shù)為94℃預變性2 min，94℃變性50 s，56℃退火30 s，72℃延伸1 min，共35個循環(huán)，最后72℃延伸5 min。4.2.5 PCR結果分別取兩個PCR產(chǎn)物5 μL進行1%瓊脂糖凝膠電泳，電泳結果顯示，采取病豬的血液、肝臟、肺臟、淋巴結和脾臟樣品，進行RT-PCR均擴增出629 bp（PRRSV）、508 bp（CSFV）大小的特異性條帶，與陽性對照相符，陰性對照則沒有出現(xiàn)目的條帶（圖5、圖6），表明所檢測病料PRRSV和CSFV陽性，結合臨床癥狀和病理剖檢變化等，可診斷為PRRS與CSF混合感染。

圖5　病料組織PRRSV RT- PCR檢測電泳M：DL-2 000 DNA Marker；1：陽性對照；2：血液樣品；3：肺臟組織；4：肝臟組織；5：淋巴結；6：脾臟；7：陰性對照

圖6　病料組織CSFV RT- PCR檢測電泳M：DL-2 000 DNA Marker；1：陽性對照；2：血液樣品；3：淋巴結；4：脾臟；5：陰性對照

5　討論

PRRS是一種免疫缺陷病，破壞感染豬免疫系統(tǒng)，導致豬免疫力下降，進而造成混合感染，特別是PRRS和SCSF經(jīng)?；旌细腥?，在臨床上二者感染后引起的臨床表現(xiàn)相似，給臨床診斷造成很大困難。因此早期診斷并及時了解發(fā)病狀況，對控制PRRS和SCSF的流行顯得尤其重要。

PRRSV的ORF7基因都具有高度的遺傳穩(wěn)定性，保守性極高[2]，以ORF7基因為檢測目標的RT-PCR方法已廣泛用于PRRSV的實驗室檢驗，該方法可用于血清、組織和肺泡巨噬細胞等樣品的檢驗，檢測速度快，具有高度的敏感性和特異性，可以檢測到組織培養(yǎng)物中30個PRRSV單位，敏感性也要比病毒分離方法高10倍左右，且可以避免病毒的播散[3]。

目前針對PRRSV和CSFV的血清學檢測方法還包括血清病毒中和法（SVN）、免疫過氧化物酶單層試驗（IPMA）、間接熒光抗體試驗（IFN）和間接ELISA[4-5]，但這些方法不能判斷出抗體的產(chǎn)生是由病毒感染還是注射滅活疫苗引起的[6]，且檢測時間較長。本研究建立了快速檢測PRRSV和CSFV的RT-PCR方法，具有敏感性強的特點，大大縮短了檢測時間，為臨床治療贏得了時間。

由于試驗條件與時間關系，本試驗監(jiān)測結果未做對比試驗。

參考文獻：

[1]羅廷榮，莫揚，吳文德，等.RT－PCR技術診斷豬瘟的應用研究[J].中國預防獸醫(yī)學報，2003，25（3）：219 -222.

[2]魯韋韋，姜平，唐泰山，等.豬繁殖與呼吸綜合征病毒ORF7基因的遺傳變異分析[J].物醫(yī)學進展，2007，28（11）：26-30.

[3]郎廣平，郭敏，韓盈盈，等.豬繁殖與呼吸綜合征診斷方法與疫苗研究進展[J].中國畜牧獸醫(yī)，2013，40（6）：195-197.

[4]洪猛，周碧君，王開功，等.豬繁殖與呼吸綜合征疑似病例實驗室診斷[J].動物醫(yī)學進展，2013，34（10）：122-127.

[5]朱佳毅，任曉峰.豬繁殖與呼吸綜合征病毒檢測方法的研究進展[J].中國預防獸醫(yī)學報，2014，36（1）：77-79.

[6] Janková J，Celer V.Expression and serological reactivity of Nsp7 protein of PRRS genotypeⅠvirus[J] . Research in Veterinary Science，93（2012）：1537-1542.

通訊作者：崔煥忠，E-mail：huanzhongcui@163.com

作者簡介：張輝（1973-），女，高級實驗師，博士，研究方向為臨床獸醫(yī)學，E-mail：huizhang01525@163.com

基金項目：吉林省教育廳“十二五”科學技術研究項目（吉教科合字[2015]第26號）；吉林省科技廳自然科學基金項目（20150101107JC）；吉林省科技廳基礎研究項目（20140101028JC）；吉林省現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術體系建設專項

收稿日期：2014-08-05

中圖分類號：S852.65+1

文獻標志碼：B

文章編號：0529- 6005（2016）01- 0068- 02