張西云，范玉霞，李生慶，胡國元，李志寧，李秀萍，王亭亭，黃　榮，劉懷新（青海省畜牧獸醫(yī)科學院，青海西寧810016）

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綿羊腸毒血癥的診斷與防治

張西云，范玉霞，李生慶，胡國元，李志寧，李秀萍，王亭亭，黃榮，劉懷新
（青海省畜牧獸醫(yī)科學院，青海西寧810016）

青海省祁連縣默勒鎮(zhèn)外日溝鄉(xiāng)從2006年7月轉入夏季草場開始發(fā)生綿羊死亡，死亡的綿羊多為當年的羔羊和2歲以內的羊，從夏季草場轉入秋季草場放牧時（9月份）綿羊死亡數(shù)進入高峰期。從2007年開始，該鎮(zhèn)另外兩個村多隆、老日當村也相繼發(fā)生綿羊大量死亡，至今累計死亡3 358只，據(jù)當?shù)啬撩窠榻B每天每家至少死亡5～7只，有的牧戶家已死亡80余只，給他們帶來了巨大的經濟損失。發(fā)病羊群均已進行了藥物驅蟲工作，并正常接種過羊四聯(lián)疫苗（猝疽、羔羊痢疾、快疫、腸毒血癥）。

2008年8月，我們在發(fā)病地區(qū)采集了4份病死羊臟器及腸內容物，進行了病原診斷和菌苗研制，報告如下。

1　病原診斷

1.1臨床癥狀病程約1～3 d，多數(shù)病羊晚上入圈時看不出癥狀，早晨放牧時發(fā)現(xiàn)死于圈中，主要癥狀為食欲廢絕，跌倒后四肢劃動呈游泳狀，頭向一側仰，抽搐，很快死亡。

1.2剖檢變化死亡羊只除腎臟軟化外，心、肝、脾、肺等臟器均未見到明顯病理變化。少數(shù)羊只心包液增量呈淡黃色，心臟擴張，心肌松軟，肺臟充血、水腫，腎臟實質柔軟松馳，肝臟腫脹、質脆，淋巴結切面濕潤，小腸黏膜充血，死羊腹部膨脹。

1.3細菌分離和鑒定

1.3.1細菌分離取腸內容物，分別接種于厭氣肝湯和鮮血瓊脂平板，37℃培養(yǎng)24 h，涂片見到產氣莢膜梭菌，然后接種該培養(yǎng)物于鮮血瓊脂平板上，挑取溶血菌落，得到純培養(yǎng)物。

1.3.2細菌的特性：

1.3.2.1生長特性本菌在厭氣肝湯中3～4 h即開始產氣，24 h生長停止，并開始沉降，在鮮血瓊脂平板上厭氣培養(yǎng)，24 h開始生長，48 h可見圓形略隆起、灰白色半透明的菌落，菌落周圍有溶血環(huán)。

1.3.2.2毒素測定分自4只羊的四株菌對小鼠的最小致死量分別為400、400、1 600 MLD/mL及400 MLD/mL。

1.3.2.3細菌的型別分離到的4株細菌的毒素都能被D型產氣莢膜梭菌抗血清中和。

2　腸毒血癥菌苗的研制

2.1制苗用培養(yǎng)基牛肉胃酶消化液培養(yǎng)基：牛肉胃酶消化液10 000 mL（常規(guī)方法制造），蛋白胨50 g，示胨50 g，Na2HPO4·12H2O 100 g，糊精100 g，pH值8.5，10磅40分。

2.2菌苗制造方法

2.2.1菌液制備培養(yǎng)基經高壓后，涼至38℃左右時立即接種，種子量為1%，放37℃溫室培養(yǎng)24 h。

2.2.2毒價測定逐瓶吸取2 mL菌液，與等量的含0.25%胰酶（效價1∶250）的1%碳酸鈉液混合，置37℃作用40～60 min，4 000 r/min離心10 min、稀釋、測毒。

2.2.3菌苗制造在純檢合格的菌液中加1%甲醛溶液，置于37℃殺菌、脫毒，21 d，過濾后加入無菌的20%氫氧化鋁膠溶液，使菌苗中氫氧化鋁含量達7 mg/mL，分裝、檢驗、備用。

2.3菌苗效力：

2.3.1家兔效力檢驗0901、1001、1002及1101四批菌苗分別用體重1.5～2 kg的健康家兔，隨機分成4組（1002批2組），免疫組皮下注苗0.1、0.5、1 mL，每組4只，對照組2只，均為皮下注射。飼養(yǎng)至21 d，靜脈攻毒。

2.3.2綿羊效力檢驗0901、1002、1101及1201四批菌苗分別用體重30～40 kg的健康綿羊，隨機分為11組，每批菌苗按0.5 mL、1.0 mL、2.0 mL分別免疫3組（1201批2組），每組4只，均為肌肉注射，免疫18 d后連同對照2只靜脈攻毒，觀察記錄死亡情況。

3　結果

3.1診斷根據(jù)流行病學、臨床癥狀，剖檢變化，細菌分離、毒素測定及中和試驗診斷為D型產氣莢膜梭菌引起的腸毒血癥。

3.2菌株產毒情況經過4年試驗，用牛肉消化培養(yǎng)基，其產毒素的能力最高可達4萬MLD/mL，少數(shù)為5 000 MLD/mL（制苗時廢棄），多數(shù)為2～1 萬MLD/mL。

表1　2009- 2012年菌株產毒情況

表2　2009- 2012年各批菌苗毒價情況

3.3效檢結果

3.3.1家兔效檢結果3批菌苗以0.1 mL免疫，3批均3/4保護，攻毒量1～2個家兔MLD，效果良好。4批菌苗以0.5 mL免疫，3批4/4保護，1批3/4保護，攻毒量1～3個家兔MLD，效果良好。3批菌苗以1 mL免疫，2批3/4保護，1批2/4保護，攻毒量1～5個家兔MLD，效果良好。

3.3.2綿羊效檢結果4批菌苗以0.5 mL免疫，2 批4/4保護，2批3/4保護，而且攻毒量均較大，多數(shù)攻6～8個綿羊MLD，效果良好。4批菌苗以1.0 mL免疫，3批4/4保護，1批3/4保護，攻毒量更大，多數(shù)攻8～10個綿羊MLD，效果更好。3批菌苗以2.0 mL免疫，全部4/4保護，攻毒量更大，多數(shù)攻12～15個綿羊MLD，效果很好。

4　菌苗使用情況

2009-2012年用新研制的羊腸毒血癥菌苗在祁連縣默勒鄉(xiāng)共免疫羊30.5萬只，其中2009年免疫6.5萬只，2010年免疫5萬只，2011年免疫6萬只，2012年免疫5萬只，2013年免疫8萬只，免疫羊未發(fā)現(xiàn)腸毒血癥病例，有效的控制了該病的發(fā)生和流行。

表3　腸毒血癥菌苗家兔效力檢驗情況

表4　腸毒血癥菌苗綿羊效力檢驗情況

5　討論

5.1通過改進培養(yǎng)基和培養(yǎng)方法，使D型產氣莢膜梭菌產毒素的能力最高達4萬MLD/mL，高出規(guī)程的20倍。

5.2菌株產毒較高的原因雖然與培養(yǎng)基有關，但主要是培養(yǎng)基中加入了緩沖劑，國外有報道，D型產氣莢膜梭菌在pH值較高時產毒較好，我們的試驗證明了這點。

5.3根據(jù)農業(yè)部獸醫(yī)生物制品規(guī)程規(guī)定，腸毒血癥單價苗，以3 mL劑量免疫綿羊，攻致死量毒素，3/4保護即為合格。我們制成的4批菌苗，最小免疫量0.5 mL即可抗6～8個綿羊最小致死量的攻擊，1 mL免疫量可抵抗10 MLD綿羊最小致死量的攻擊，說明效果良好。

5.4本菌苗免疫性好的主要原因是提高了菌液的含毒量，制苗時以10 000 MLD/mL為最低標準（規(guī)程定為2 000 MLD/mL），所以最小免疫量0.5 mL，仍有較好的效果。

作者簡介：張西云（1965-），女，研究員，本科，研究方向為傳染病學，E-mail：zhangxiyun65@126.com

收稿日期：2014-05-23

中圖分類號：S858.26

文獻標志碼：B

文章編號：0529- 6005（2016）01- 0060- 02