范克偉，戴愛玲，李曉華，吳德峰，閆娜娜，江丹丹，楊小燕（.龍巖學院生命科學學院，福建龍巖6402；2.福建省預防獸醫(yī)學與獸醫(yī)生物技術重點實驗室，福建龍巖6402；.福建農(nóng)林大學動物科學學院，福建福州50002）

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閩西地區(qū)豬偽狂犬病病毒變異株gC基因克隆與序列分析

范克偉1，2，戴愛玲1，2，李曉華1，2，吳德峰3，閆娜娜1，江丹丹1，楊小燕1，2
（1.龍巖學院生命科學學院，福建龍巖364012；2.福建省預防獸醫(yī)學與獸醫(yī)生物技術重點實驗室，福建龍巖364012；3.福建農(nóng)林大學動物科學學院，福建福州350002）

摘要：為了解閩西地區(qū)2013年以來豬偽狂犬病病毒（PRV）流行株的現(xiàn)狀、分子生物學特征和遺傳演化規(guī)律，收集了閩西不同地區(qū)的14株PRV分離株，并對其gC基因進行遺傳變異分析。結果表明，14株PRV分離株與2012年以來國內不同省份分離的PRV變異株的核苷酸序列同源性為98.8%～99.7%，而與Bartha疫苗株核苷酸序列同源性為93.6%～93.8%。氨基酸多序列比對發(fā)現(xiàn)，14株PRV分離株和近年來國內分離的PRV毒株gC基因氨基酸序列同源性較高，有很多相同的特征性氨基酸替換，其中最有特征性的是aa52～aa61，aa63～aa69位和aa186～aa194位氨基酸的替換和插入。遺傳進化樹分析表明，14株PRV分離株與2012年以來國內不同省份分離的PRV株位于一個相對獨立的大分支中，且形成了一個獨立的亞分支，而與Bartha疫苗株存在很大差異，親緣關系較遠?？乖砦活A測分析表明，PRV閩西分離株與Bartha疫苗株相比發(fā)生了抗原漂移，該差異是否預示閩西地區(qū)流行株正在向遠離疫苗株的方向變異尚有待進一步研究。

關鍵詞：豬偽狂犬病病毒；gC基因；序列分析

豬偽狂犬病是由偽狂犬病病毒（Pseudorabies virus，PRV）引起的一種急性傳染病，以新生仔豬的腹瀉及神經(jīng)癥狀，妊娠母豬繁殖障礙、流產(chǎn)、死胎及呼吸道癥狀，成年豬隱形感染，長期帶毒排毒為特征。在我國豬偽狂犬病的流行范圍很廣，給養(yǎng)豬業(yè)造成的經(jīng)濟損失僅次于豬瘟。PRV屬于皰疹病毒科、α-皰疹病毒亞科，基因組為雙鏈DNA，全長約150 kb，基因組GC含量最高達73%，至少含有70個基因，編碼約100種蛋白質，成熟的病毒粒子約含有50種蛋白質[1]。gC是PRV的一種重要的糖蛋白，雖然gC不是PRV復制所必需的，但作為PRV最主要的保護性抗原之一，它不僅能誘導細胞免疫，產(chǎn)生中和抗體，還能與豬的補體C3結合，激活補體系統(tǒng)，從而在防御系統(tǒng)中起作用。另一方面，gC在病毒對靶細胞的吸附，傳播中的釋放，以及影響病毒毒力方面也起著十分重要的作用[2-3]。2012年以來，在我國河北、河南、山東等多個省份的豬偽狂犬基因缺失疫苗免疫豬場發(fā)生豬偽狂犬病的流行，發(fā)病率和死亡率明顯上升，且出現(xiàn)了新的發(fā)病特征，給我國養(yǎng)豬業(yè)造成了重大的經(jīng)濟損失[4-6]。已有研究表明，與以前的流行株相比，新流行株的抗原性已發(fā)生變異，從而導致現(xiàn)有疫苗不足以提供完全保護，同時發(fā)現(xiàn)PRV變異株gC基因存在抗原漂移現(xiàn)象，并且在從不同地區(qū)獲得的PRV分離株之間更明顯[3、7]。因此，為進一步了解閩西地區(qū)PRV流行毒株之間gC基因的變異情況，本研究對2013-2014年閩西地區(qū)PRV分離株gC基因進行序列分析，以期分析闡明該地區(qū)PRV流行株的分子特征，為豬偽狂犬病的有效防控提供科學依據(jù)。

1　材料與方法

1.1細胞和病毒樣品Vero細胞由本實驗室保存；2013-2014年采集龍巖學院動物醫(yī)學研究所接診病例中臨床癥狀疑似為PRV感染豬的腦組織。將經(jīng)PCR鑒定為PRV陽性的腦組織研磨、離心、過濾后，接種于Vero細胞培養(yǎng)，觀察有無細胞病變。將引起細胞病變的病毒株傳2-3代后用于PRV gC全基因擴增。

1.2主要試劑DMEM，購自Gbico公司；胎牛血清，購自杭州四季青生物有限公司；DL-2 000 DNA Marker、LA Taq DNA聚合酶、2×GC Buffer I、dNTP、Universal Genomic DNA Extraction Kit、pMD18-T克隆載體，均購自寶生物工程（大連）有限公司。

1.3引物設計根據(jù)GenBank中登錄的PRV全基因組序列（NC_006151）設計并合成了用于gC全基因擴增和序列分析的引物，gC-F：5′-ATGGCCTCGCTCGCGCGTGCGATGCTC-3′，gC-R：5′-TCACGGCCCCGCCCGGCGGTAGTAGACG-3′，擴增片段大小1 440 bp。引物由上海英駿生物技術有限公司合成。

1.4病毒DNA的提取及PCR鑒定根據(jù)TaKaRa公司Universal Genomic DNA Extraction Kit試劑盒說明書提取PRV DNA，利用上述引物擴增PRV gC基因全序列。PCR反應體系總體積25 μL：DNA模板2 μL，2×GC Buffer I 12.5 μL，dNTP 4 μL，上、下游引物各1 μL，LA Taq酶0.25 μL，用ddH2O補至25 μL。PCR程序：94℃5 min；94℃1 min，53℃50 s，72℃2 min，35個循環(huán)；72℃10 min。PCR產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.5gC基因的克隆與序列分析將目的基因經(jīng)膠回收后克隆至pMD18-T載體中，送Invitrogen公司進行序列測定，每個樣品選擇3個克隆，每個克隆測序3次。利用生物信息軟件對14株PRV分離毒株與GenBank中登錄的其他PRV毒株的gC基因序列進行比對，分析分離毒株的序列特征。

2　結果

2.1gC基因PCR擴增結果14株PRV分離株通過PCR擴增后，凝膠電泳結果顯示，獲得了與預期大小相一致的約1 440 bp的擴增條帶（圖1）。

圖1　PRV閩西分離株gC基因全序列PCR擴增結果M：DNA分子質量標準；1～14：FJLY01～14 gC基因PCR產(chǎn)物

2.2gC基因序列分析將回收的PCR產(chǎn)物連接于pMD18-T載體中送Invitrogen公司測序，將測序結果與GenBank中登錄的其他21株PRV gC基因核苷酸序列及推導的氨基酸序列進行比對，結果表明，14株PRV分離株的gC基因核苷酸序列與2012年以來國內不同省份陸續(xù)分離的TJ、SDWF1、LGX等PRV變異株的核苷酸和氨基酸序列同源性分別為98.8%～99.7%和97.7%～99.4%；而與Bartha、Becker、Ea等經(jīng)典株的核苷酸和氨基酸序列同源性分別為93.6%～99.4%和91.2%～98.8%，說明它們與2012年以來國內不同省份陸續(xù)分離的PRV變異株核苷酸及氨基酸同源性較高，與Bartha、Ea等經(jīng)典株的同源性相對較低，其中與Bartha疫苗株的核苷酸和氨基酸同源性最低分別為93.6%～93.8%和91.2%～91.7%。

核苷酸多序列比對結果顯示，14株PRV分離株和國內不同時期分離的PRV株gC基因核苷酸序列中有很多點突變一致，尤其是與2012年以來國內不同省份分離的PRV變異株核苷酸突變位點的一致性最高，且分布比較集中，主要為30～111 bp，128～181 bp，210～227 bp，250～352 bp，558～581 bp，699～728 bp，1 381～1 407 bp及1 451～1 460 bp。此外，gC基因區(qū)域還存在一個高變區(qū)，位于210～227 bp，此部位存在大量的G-C堿基替換。最具有特征性的是在175～179 bp的堿基序列CCCGA突變?yōu)镚GGAC以及186～206 bp國內近幾年分離的PRV分離株均存在一段21個堿基的連續(xù)插入。雖然部分經(jīng)典株（Fa、Ea、P-Prv）在這個位置也有21個堿基的連續(xù)插入，但2012年以來國內不同省份分離的PRV變異株在此位點卻高度一致。另外，值得注意的是在gC基因核苷酸序列150 bp處，14株PRV分離株出現(xiàn)了一致性的堿基突變（G→A），而21株參考毒株中只有2013年分離的BJRD株（KF017273）在此位點發(fā)生了一致性堿基突變。氨基酸多序列比對發(fā)現(xiàn)，14株PRV分離株和11株PRV國內分離株gC基因氨基酸序列同源性較高，有很多相同的特征性氨基酸替換，其中最有特征性的是第aa52～aa 61，aa 63～aa 69和aa 186～aa 194位氨基酸的替換和插入。這些特征性的變異可能會導致PRV分離株和Bartha疫苗株之間的抗原性發(fā)生一定的改變。

2.3gC基因的遺傳進化樹分析為了進一步了解閩西地區(qū)PRV分離株的遺傳學特性及相互的親緣關系，將14株PRV分離株與GenBank中登錄的其他21株國內外PRV分離株的gC氨基酸序列進行遺傳進化樹分析，結果顯示，14株PRV分離株與2012年以來國內不同省份陸續(xù)分離的PRV變異株位于一個相對獨立的大分支中，但14株分離株又形成了一個獨立的亞分支，表明14株PRV分離株雖然屬于近年來流行的PRV變異毒株，但與國內其他地區(qū)分離的PRV毒株之間仍存在一定的差異（圖2）。此外，國內經(jīng)典毒株Ea、Fa及馬來西亞P-Prv株也處于近年來流行的PRV變異毒株形成的同一個大分支中，其中Ea株與2012年以來國內不同省份陸續(xù)分離的PRV變異株處于一個獨立的亞分支中，說明近年來流行的PRV變異毒株與Ea株的親緣關系最近。而與Bartha疫苗株位于不同的大分支中親緣關系較遠，表明現(xiàn)行的Bartha疫苗株已不能對PRV變異毒株提供完全的免疫保護。

2.4PRV閩西地區(qū)分離株與Bartha株gC蛋白抗原性及表面抗原位點的差異分析選擇14株分離株中與Bartha株氨基酸同源性最低的PRV FJLY11株為閩西地區(qū)PRV分離株的代表毒株，應用DNAStar軟件對FJLY11株和Bartha疫苗株進行gC蛋白抗原性及表面抗原位點對比分析，結果表明，F(xiàn)JLY11株與Bartha疫苗株gC蛋白抗原指數(shù)之間存在差異，主要體現(xiàn)在氨基酸50～130位，180～190位，320～330位，如前插彩版圖3箭頭所示。FJLY11株gC蛋白的抗原表位與Bartha疫苗株相比發(fā)生了漂移，這可能是近年來導致福建省豬偽狂犬疫苗免疫失敗的主要原因之一。

圖2　PRV閩西分離株與參考毒株gC氨基酸序列系統(tǒng)進化分析

3　討論

gC是PRV最主要的保護性抗原之一，它不僅能誘導細胞免疫，產(chǎn)生中和抗體，還能與豬的補體C3結合，激活補體系統(tǒng)，從而在防御系統(tǒng)中起作用。另一方面，gC在病毒對靶細胞的吸附，傳播中的釋放，以及影響病毒毒力方面也起著十分重要的作用[2-3]。因此，分析流行毒株的gC基因，了解其抗原變異性，對于研究PRV多樣性及其分子進化具有重要意義，有助于在分子水平上揭示規(guī)?；i場偽狂犬病的存在和發(fā)生原因。

本研究對閩西地區(qū)PRV分離株gC基因序列分析結果表明，14株PRV分離株與參考毒株的gC基因序列核苷酸和氨基酸同源性分別為93.6%～99.7%和91.2%～99.4%，同源性較高，具有較高的保守性。但核苷酸多序列比對結果發(fā)現(xiàn)，不同PRV毒株間gC基因核苷酸序列中仍存在一些差異。其中14株PRV分離株在核苷酸150位均出現(xiàn)了一致性的堿基突變（G→A，未引起氨基酸變化），表明該突變可能是當前閩西地區(qū)PRV流行株特有的分子特征。此外，14株PRV分離株與參考毒株gC基因核苷酸序列中有很多點突變一致，尤其是與2012年以來國內不同省份分離的PRV變異株gC基因核苷酸突變位點的一致性最高，且分布比較集中。主要表現(xiàn)在高突變區(qū)堿基變化、175～179位堿基序列突變以及186～206位21個堿基的連續(xù)插入，這些突變造成相應區(qū)域氨基酸的變化，進而致使不同地區(qū)分離的PRV毒株gC基因氨基酸序列存在較大差異。另外，本研究發(fā)現(xiàn)，不同PRV毒株gC蛋白氨基酸的38處突變都發(fā)生在第162位氨基酸前的區(qū)段內，占總變異數(shù)的50%，與前人研究結果一致[2]。有研究表明，gC基因的前1/3段是主要的功能區(qū)[8]，這些突變是否會影響PRV的功能，是否會造成抗原漂移呢？

遺傳進化樹分析結果顯示，14株PRV分離株與2012年以來國內不同省份分離的PRV變異株處于一個相對獨立的大分支中親緣關系最近，屬于近年來流行的PRV變異毒株，表明PRV變異毒株已成為閩西地區(qū)主要的流行毒株。與Bartha疫苗株親緣關系較遠處于不同的遺傳分支中。gC蛋白抗原性分析表明，F(xiàn)JLY11株與Bartha株的gC蛋白抗原指數(shù)之間存在差異，發(fā)生了漂移。這些結果都表明閩西地區(qū)PRV分離株正在向遠離疫苗株的方向變異，現(xiàn)行的豬偽狂犬疫苗株Bartha株雖然能起到一定的保護作用，但不能提供完全的免疫保護，這可能是導致閩西地區(qū)部分豬場豬偽狂犬病暴發(fā)的原因之一。

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通訊作者：楊小燕，E-mail：lyyxy1988@126.com

作者簡介：范克偉（1983-），男，講師，博士，主要從事分子病原學與免疫學研究，E-mail：fankewei8399@163.com

基金項目：福建省農(nóng)業(yè)科技重大專項項目（2014NZ01060015）；福建省教育廳資助省屬高校項目（JK2013052）

收稿日期：2015-04-09

中圖分類號：S852.65+1

文獻標志碼：A

文章編號：0529- 6005（2016）01- 0047- 03