田　夢，黃　勇，瞿俊勇，歐陽芬，鄧　梁，張　玲，潘　多，張明軍

（1.湖南農(nóng)業(yè)大學動物醫(yī)學院，湖南長沙410128；2.湖南省獸藥飼料監(jiān)察所，湖南長沙410006）

?

仔豬小腸平滑肌細胞體外培養(yǎng)方法的建立

田夢1，黃勇2，瞿俊勇1，歐陽芬1，鄧梁1，張玲1，潘多1，張明軍1

（1.湖南農(nóng)業(yè)大學動物醫(yī)學院，湖南長沙410128；2.湖南省獸藥飼料監(jiān)察所，湖南長沙410006）

摘要：為了建立簡便、高效的仔豬小腸平滑肌細胞體外培養(yǎng)方法，為相關(guān)研究提供試驗材料，采用組織貼塊法和酶消化法進行原代培養(yǎng)，胰酶消化傳代，并應(yīng)用倒置顯微鏡和SABC試劑盒對細胞進行形態(tài)學和免疫組化鑒定。結(jié)果采用組織塊貼塊法培養(yǎng)的仔豬腸平滑肌細胞有90%的組織塊接種存活，初次傳代后的平滑肌細胞純度達95%以上。免疫組化染色顯示胞漿內(nèi)α平滑肌肌動蛋白陽性表達。而酶消化法培養(yǎng)的仔豬腸平滑肌細胞，生長緩慢甚至死亡。表明組織塊貼塊法是為簡便、可靠，短期內(nèi)可獲大量高純度的仔豬小腸平滑肌細胞的原代培養(yǎng)方法。

關(guān)鍵詞：仔豬；小腸平滑肌細胞；組織貼塊法；酶消化法；細胞培養(yǎng)

腸平滑肌細胞（Intestinal smooth muscle cells，ISMC）是腸道的重要功能細胞，腸平滑肌細胞的收縮、舒張等活動受到神經(jīng)遞質(zhì)、胃腸激素和藥物等因素的調(diào)節(jié)[1]。體外培養(yǎng)細胞，由于影響因素單一，是研究細胞功能以及相應(yīng)的細胞信號轉(zhuǎn)導機制的基礎(chǔ)。相關(guān)文獻報導的平滑肌細胞的培養(yǎng)多是關(guān)于大鼠的研究，而對于仔豬胃腸道平滑肌培養(yǎng)的研究，基本處于空白。為了探索一套簡易實用的仔豬腸道平滑肌細胞的分離、培養(yǎng)方法，參照有關(guān)文獻[2-3]，我們分別采用貼塊法和酶消化法進行了仔豬小腸平滑肌細胞的體外培養(yǎng)，現(xiàn)將試驗情況，報告如下。

1　材料與方法

1.1試驗材料DMEM培養(yǎng)基（Hyclone公司）；胎牛血清（杭州四季青生物工程材料研究所）；胰蛋白酶（Trypsin，Sigma公司）；青、鏈霉素；Ⅱ型膠原酶（MP公司）；胰蛋白酶抑制劑（Amersco公司）；二甲基亞砜（DMSO）（Sigma公司）；Trypan（北京鼎國昌盛生物技術(shù)有限責任公司）；鼠抗α-action克隆抗體、SABC免疫組化試劑盒和DAB顯色試劑盒（武漢博士德公司）。PBS緩沖液的配置：NaCl 7.9 g/L，KCl 0.2 g/L，NaH2PO40.24 g/L，K2HPO41.8 g/L，用NaOH調(diào)pH值到7.4。

1.2儀器MCO-18AC型二氧化碳培養(yǎng)箱；VS-840K-U型潔凈工作臺；Z323K型低溫冷凍高速離心機；LDZX-30FB型高溫滅菌器；DHG-9240A型電熱恒溫鼓風干燥箱；倒置相差顯微鏡和常用移液器具等。

1.3試驗動物剛出生未進食未喝水的仔豬，由永州佳和農(nóng)牧有限公司提供。

2　試驗方法

2.1仔豬小腸平滑肌細胞的體外培養(yǎng)方法

2.1.1組織貼塊法分離仔豬小腸平滑肌細胞參考Bitar方法加以改進[4]。將剛出生且未進食未吃奶的仔豬放血處死，立即無菌剖開腹腔，取十二指腸10 cm左右，生理鹽水中反復(fù)灌腸沖洗，剪開后移入含300 IU/mL青霉素、300 μg/mL鏈霉素的PBS緩沖液中浸泡15 min后，取出，移入含PBS緩沖液的玻璃培養(yǎng)皿中，在解剖顯微鏡下用皮內(nèi)針固定好四角，仔細剝離黏膜層，翻轉(zhuǎn)至外側(cè)，小心地撕去腸系膜，再仔細刮去漿膜層，反復(fù)用攝子側(cè)腳刮腸段的內(nèi)外層，直至在顯微鏡下觀察到腸段呈透明的一層為止。將組織層剪碎成l～2 mm3的小肌塊，用PBS沖洗3次后，將剪碎的小肌塊放入60 mm培養(yǎng)皿中（培養(yǎng)皿底部先用含20%胎牛血清的DMEM濕潤），間距約為0.4 cm左右，用吸管均勻擺放瓶內(nèi)組織塊，輕輕翻轉(zhuǎn)培養(yǎng)皿，使培養(yǎng)皿底部朝上，放入37℃CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)2～3 h后，待組織塊干涸并與皿底貼附后，翻轉(zhuǎn)培養(yǎng)皿，輕柔地加入3 mL DMEM培養(yǎng)基，使組織塊完全浸入培養(yǎng)液中，繼續(xù)靜止培養(yǎng)，2 d后換液，期間不要動培養(yǎng)皿，以免組織塊浮起，以后每2～3天換液1次。當組織塊周圍有細胞游出并達到1定密度時，將小肌塊取出，繼續(xù)培養(yǎng)，只到形成單層致密細胞。

2.1.2酶消化法小腸段的前處理同組織貼塊法，將組織塊剪碎后放入10 mL離心管內(nèi)，加入含0.1 %Ⅱ型膠原酶和0.01%胰蛋白酶抑制劑的PBS 10 mL，37℃下消化15 min，每2 min搖動離心管，使組織充分與酶反應(yīng)。當組織塊變白松軟，且液體渾濁后，加培養(yǎng)液終止消化，l 000 r/min離心5 min，棄去上清液，用含20%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基重新懸浮，60目篩網(wǎng)過篩，即得到游離的仔豬腸平滑肌細胞。放入37℃CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，每天觀察細胞生長情況，每2～3天換液1次。

2.2傳代培養(yǎng)與細胞鑒定細胞培養(yǎng)14 d后，倒置顯微鏡下觀察細胞長成致密單層時，即可用胰酶消化傳代；取原代長至融合的仔豬腸平滑肌細胞接種于預(yù)置有多聚賴氨酸涂布的蓋玻片的六孔培養(yǎng)板，培養(yǎng)5 d后進行α-actin免疫組織化學染色。同時設(shè)陰性對照組。采用免疫組織化學ABC法對傳代細胞進行鑒定。

3　結(jié)果

3.1細胞形態(tài)學觀察

3.1.1組織貼塊法組織貼塊5 d后，在組織塊邊緣幵始有細胞游出，呈長梭狀，比較稀疏。在第l0天時，組織塊周圍長滿細胞，不均勻排列，呈簇狀，細胞形態(tài)不一，有梭狀、橢圓狀、圓形等（圖1-A）。第12天時，細胞均勻密集的從組織塊周圍長出，且鋪滿皿底（圖1-B）。傳代培養(yǎng)24 h后，細胞開始貼壁，以后幾天細胞生長較慢，第11天在培養(yǎng)皿內(nèi)才長出稀疏平滑肌細胞，細胞呈長梭狀，有的呈放射狀或漩渦狀。存活率達90%以上。

圖1　貼塊法原代培養(yǎng)仔豬腸平滑肌細胞（40×）A：組織塊周圍長滿仔豬腸平滑肌細胞；B：鋪滿皿底的仔豬腸平滑肌細胞

3.1.2酶消化法剛分離出來時，在倒置顯微鏡下可以看到有單個的圓形的細胞，也伴有部分雜質(zhì)，見圖2A。經(jīng)過10 d的培養(yǎng)后，仍不見細胞貼壁，且原本能清楚看到的圓形細胞也不見了，只剩下一些類似雜質(zhì)的黑點，見圖2B。

3.2免疫組化鑒定應(yīng)用（α-actin單克隆抗體免疫組化染色，可見細胞被染成棕色或淺棕色，核不著色，呈淺藍色陽性反應(yīng)；陰性對照組，細胞不被染色。見圖3（A、B）。經(jīng)免疫組化鑒定，組織貼塊法原代培養(yǎng)仔豬腸平滑肌細胞可獲得高純度（免疫組化鑒定α-actin的陽性率達95%以上）的細胞，且生長良好。為研究藥物對細胞的作用及信號傳導提供基礎(chǔ)。

圖2　酶消化法原代培養(yǎng)仔豬腸平滑肌細胞A：酶消化法分離仔豬腸平滑肌細胞（40×）；B：仔豬腸平滑肌細胞培養(yǎng)10 d后（40×）

圖3　仔豬腸平滑肌細胞免疫組化鑒定A：組織塊培養(yǎng)法的仔豬腸平滑肌細胞免疫組化（40×）；B：組織塊培養(yǎng)法的仔豬腸平滑肌細胞免疫組化陰性對照（40×）

4　討論

關(guān)于平滑肌細胞培養(yǎng)的研究有不少報道，但大多都是關(guān)于血管平滑肌細胞。一方面因為腸道屬于消化器官，與細菌的接觸機會較大，容易污染；另一方面，仔豬不似一般試驗動物，成本較高。此外，腸道的結(jié)構(gòu)不同于血管。腸道分為黏膜層、黏膜下層、肌層和漿膜層，而血管分為外膜、中膜和內(nèi)膜，中膜較厚，主要由大量環(huán)形排列的平滑肌纖維組成。在分離肌層時，腸道與血管比較，操作更加復(fù)雜。所以，在分離結(jié)腸平滑肌層時應(yīng)盡可能仔細、反復(fù)地刮除黏膜、黏膜下層及漿膜層，在體視顯微鏡下操作更能確保分離、得到的組織是較純的平滑肌組織。

筆者嘗試的酶消化法，雖然其培養(yǎng)周期短，但酶作用時間不易掌握，且消化酶本身對細胞有一定的損傷作用，導致培養(yǎng)失??；雖然組織塊法培養(yǎng)周期較長，但操作相對簡便，污染機會小，培養(yǎng)效率高[5-6]。根據(jù)本試驗結(jié)果，我們更推薦用組織塊培養(yǎng)法進行仔豬平滑肌細胞的原代培養(yǎng)。

筆者將試驗中的一些體會及需注意的要點總結(jié)如下：首先必須在無菌條件下取材，取材后小腸立即置入含300 IU/mL青霉素、3000 μg/mL鏈霉素的PBS中，腸段從離體到完成原代培養(yǎng)的時間要盡量短（本試驗時間均控制在1 h以內(nèi)），以保證細胞能在最快的時間獲得營養(yǎng)，植塊體積以0.5～1 mm3/塊為宜，如果植塊過大，貼壁后植塊內(nèi)部的平滑肌細胞因營養(yǎng)攝取不足，而不易遷出向外生長，剪切植塊的邊緣要盡量整齊，有利于細胞的游出。植塊貼壁干涸3～4 h后再加培養(yǎng)基，這既可使植塊貼壁較緊，又不會因干涸貼壁時間太長使細胞缺乏營養(yǎng)而影響生長。在原代培養(yǎng)初期，培養(yǎng)液用量不應(yīng)超過1 mL（以60 mm培養(yǎng)皿為例），以0.5～1 mL為佳，僅夠保持植塊濕潤即可。培養(yǎng)液量太多，會使植塊漂浮而貼壁失敗。培養(yǎng)開始時必須絕對靜置3 d，培養(yǎng)瓶不能震動和移動，以防剛貼壁的細胞重新漂浮而死亡，影響存活率。

參考文獻：

[1]梁寧霞，衣蘭娟，田琳，等.鼠結(jié)腸平滑肌細胞的分離、培養(yǎng)與鑒定[J].江蘇醫(yī)藥，2005，6（31）：6.

[2]王慧.血根堿對大鼠小腸平滑肌收縮的抑制作用及信號傳導通路研究[D].長沙：湖南農(nóng)業(yè)大學，2012：28-29.

[3]周曉莉，雷寒，柳青，等.血管平滑肌細胞的培養(yǎng)及鑒定[J].重慶醫(yī)學，2005，6（34）：6.

[4] Bitar K N，Makltlouf G M . Receptors on smooth muscle cells：charactarization by contraction and specific antagonists[J] . Am J Physiol，1982，242：400-407.

[5]周昕，耿紅全，吳湘如，等.尿路平滑肌細胞的培養(yǎng)和鑒定[J].中華泌尿外科雜志，2003，24（5）：348.

[6]梁若斯，陳德.成人動脈平滑肌細胞體外培養(yǎng)模型的建立[J].中國現(xiàn)代醫(yī)學雜志，2002，12（10）：31.

Establishment of methods on culturing And Identificating Piglet′s intestinal smooth musclecells in vitro

TIAN Meng1，HUANG Yong2，QU Jun-yong1，OUYANG Fen1，DENG Liang1，ZHANG Ling1，PAN Duo1，ZHANG Ming-jun1
（1.College of Veterinary Medicine，Hunan Agricultural University，Changsha 410128，China；2.Hunan Provincial Institute of Veterinary Drug and Feed Control，Changsha 410006，China）

Abstract：In order to establish a simple and effective method of culturing piglet′s intestinal smooth muscle cells in vitro，and to provide test material for the related studies，tissue-piece inoculation and collagenase digestion were adopted to culture the primary piglet′s intestinal smooth muscle cells，respectively，and then rypsin digestion was used to transfer them.The cultured cells were identified by morphology and immunohistochemistry with inverted microscope and SABC kit.The result showed that about 90%inoculated tissue pieces survived through tissue-piece inoculation and the purity of the piglet′s intestinal smooth muscle cells by the first passage was more than 95%.And these cells were positive with the immunohistochemically staining against mouse SM-α-actindemonstrated by specific mAb.At the same time，the cells cultured by collagenase digestion grew very slowly，or even died.Our results indicate that tissue-piece inoculation is a simple and reliable method to obtain highly purified pigler’s intestinal smooth muscle cells in short term.

Key words：Piglet；intestinal smooth cells；tissue-piece inoculation；collagenase digestion；cell culture

Corresponding author：ZHANG Ming-jun

通訊作者：張明軍，E-mail：zhmj6997@163.com

作者簡介：田夢（1990-），女，碩士生，從事獸醫(yī)臨床藥學研究，E-mail：554231628@qq.com

收稿日期：2014-04-03

中圖分類號：S828.9

文獻標志碼：A

文章編號：0529- 6005（2016）01- 0038- 03