高云航，趙是鈞，趙晗旭，王　開，婁玉杰，馬紅霞（.吉林農(nóng)業(yè)大學動物科學技術(shù)學院，吉林長春308；2.吉林農(nóng)業(yè)大學動物生產(chǎn)與產(chǎn)品質(zhì)量安全教育部重點實驗室，吉林長春308）

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不同方法提取的復方中藥提取物對小鼠乳腺上皮細胞增殖的影響

高云航1，2，趙是鈞1，趙晗旭1，王開1，婁玉杰1，馬紅霞1，2
（1.吉林農(nóng)業(yè)大學動物科學技術(shù)學院，吉林長春130118；2.吉林農(nóng)業(yè)大學動物生產(chǎn)與產(chǎn)品質(zhì)量安全教育部重點實驗室，吉林長春130118）

摘要：為了研究復方中藥提取物對小鼠乳腺上皮細胞增殖的影響，為開發(fā)提高母畜泌乳量的中草藥產(chǎn)品奠定基礎(chǔ)，使用混合酶消化法分離培養(yǎng)妊娠中期小鼠乳腺上皮細胞，通過SDS-PAGE對純化后細胞進行鑒定。使用水煎和醇提兩種方法提取的復方中藥提取液分別作用于對數(shù)期乳腺上皮細胞1、3、5 d，使用MTT法檢測細胞活力。結(jié)果使用混合酶消化法得到大量乳腺上皮細胞。不同方法提取的中藥復方提取液在高濃度時促進細胞增殖，在低濃度時抑制細胞增殖。促進作用隨作用時間增加而降低。表明醇提中藥復方促進細胞增殖的濃度范圍大于水煎中藥復方，且醇提的中藥復方作用效果優(yōu)于水煎中藥復方。

關(guān)鍵詞：中藥提取物；乳腺上皮細胞；增殖影響

我國養(yǎng)殖業(yè)長期面臨仔畜存活率低的問題，而母畜的泌乳量不足是造成該問題的主要原因。人們通過使用激素來提高母畜泌乳量。隨著食品安全事件的不斷發(fā)生，為了獲得安全、無污染的綠色食品，人們將目光轉(zhuǎn)向傳統(tǒng)中草藥。有些中草藥具有增強機體免疫力、提高母畜泌乳量的藥效作用，同時具有無殘留、無污染等優(yōu)點。本試驗擬從妊娠中期孕鼠體內(nèi)分離培養(yǎng)乳腺上皮細胞，將自主配制的促乳中藥復方分別以水煎和醇提兩種方法提純，并以不同濃度添加到細胞培養(yǎng)液中，使用MTT法檢測不同方法提純的中草藥對小鼠乳腺上皮細胞增殖的影響，篩選出增殖效果最佳的中藥復方。如果在生產(chǎn)實踐中找到提高母畜泌乳量、補充母畜營養(yǎng)的中藥復方制劑，將為開發(fā)提高母畜泌乳量的中草藥產(chǎn)品奠定基礎(chǔ)。

1　材料與方法

1.1試驗動物的選擇清潔級ICR妊娠中期孕鼠。

1.2復方中藥提取液的制備中藥復方一：王不留行、黃芪、黨參、熟地、甘草、當歸、白術(shù)；中藥復方二：黃芪、當歸、王不留行、漏蘆、川木通、路路通、紅花、丹參。復方1和復方2分別用水煎和醇提兩種方法進行提取，用DMEM/ F12培養(yǎng)基配制中藥原液。

1.3試驗方法將孕鼠乳腺組織剪碎，加入適量混合酶[1]。消化1.5 h后過濾，將濾液以1 000 r/min離心10 min，取上清再次離心后棄上清，向離心管中加入適量DMEM/F12培養(yǎng)液，用150目細胞篩過濾后收集濾液，將濾液以1 000 r/min離心10 min，棄上清，用培養(yǎng)液重懸細胞團。將懸浮細胞置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4 h后，水平晃動使沉淀的乳腺上皮細胞懸浮，離心棄上清，用完全培養(yǎng)基（含胎牛血清10%、氫化可的松5 μg/mL、IGF-1 10 μg/mL、EGF 10 g/mL、胰島素5 mg/mL、雙抗100 IU（μg）/mL，調(diào)pH值7.2）重懸細胞，并且將細胞吹打均勻，培養(yǎng)箱培養(yǎng)。使用相差消化和相差貼壁法對分離的乳腺上皮細胞進行純化，經(jīng)2～3代后獲得較純細胞。

1.4乳腺上皮細胞的鑒定將純化后細胞置于顯微鏡下觀察，并且收集培養(yǎng)5 d的細胞上清液通過SDS-PAGE電泳對乳腺上皮細胞進行酪蛋白檢測，同時以酪蛋白標準品為陽性對照，以成纖維細胞上清液為陰性對照，完全培養(yǎng)液為空白對照。

繪制純化后細胞生長曲線并計算細胞群體倍增時間。群體倍增時間＝t×lg2/（lgNt-lgNo）t：消化細胞時間；Nt：培養(yǎng)t小時細胞平均數(shù)；No：接種細胞數(shù)。

1.5中草藥提取物對乳腺上皮細胞增殖的影響

據(jù)相關(guān)文獻[2-4]使用完全培養(yǎng)基將水煎和醇提4種中藥復方分別稀釋成藥物濃度為400、200、100、50、25 mg/mL及10 mg/mL的溶液。用完全培養(yǎng)液將細胞制成單細胞懸液，接種密度為1×105個/mL，每孔接種100 μL，置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。48 h后向96孔板內(nèi)加入含有不同濃度中藥提取液的培養(yǎng)液，設(shè)對照組。于1、3、5 d后吸出孔內(nèi)培養(yǎng)液，每孔加20 μL MTT溶液，放入培養(yǎng)箱內(nèi)孵育4 h，棄上清，每孔加入150 μL的DMSO，室溫振蕩10 min，使結(jié)晶物質(zhì)充分溶解。

采用SPSS17.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計分析，P＜0.05認為有統(tǒng)計學意義。

2　結(jié)果

2.1小鼠乳腺上皮細胞形態(tài)鑒定結(jié)果使用混合酶法分離培養(yǎng)的乳腺上皮細胞在培養(yǎng)24 h后，發(fā)現(xiàn)大部分細胞團已經(jīng)貼壁生長，如圖1。96 h時，呈鋪路石狀，如圖2。當乳腺上皮細胞數(shù)量較多時，呈島嶼狀生長，當細胞數(shù)量較少時各細胞的凸起和細胞外基質(zhì)會形成拉網(wǎng)狀結(jié)果，如圖3、4。

圖1　原代培養(yǎng)24 h后貼壁的細胞團（×200）

圖2　96 h后呈片生長并且邊界明顯成鋪路石狀（×200）

圖3　呈島嶼狀的乳腺上皮細胞（×200）

圖4　呈拉網(wǎng)狀的乳腺上皮細胞（×200）

2.2小鼠乳腺上皮細胞分泌物鑒定結(jié)果SDSPAGE電泳表明，乳腺上皮細胞上清液中所含的蛋白與酪蛋白標準品分子質(zhì)量相同，說明細胞分泌物中含有酪蛋白，證明所分離培養(yǎng)細胞是具有正常分泌功能的乳腺上皮細胞。

圖5　SDS- PAGE檢測結(jié)果A：蛋白質(zhì)標準品；B：酪蛋白標準品；C：成纖維細胞上清液；D：培養(yǎng)液；E：乳腺上皮細胞上清液

2.3小鼠乳腺上皮細胞的生長曲線和群體倍增時間結(jié)果乳腺上皮細胞生長曲線呈“S”型。在接種后2～7 d處于增殖狀態(tài)，且該細胞群體倍增時間在第5天最短。因此選取培養(yǎng)4～6 d的細胞進行消化計數(shù)，可知該細胞倍增時間為60.8 h。

圖6　乳腺上皮細胞生長曲線

2.4中藥復方提取物對小鼠乳腺上皮細胞的作用結(jié)果水煎復方一在濃度為200～400 mg/mL時對小鼠乳腺上皮細胞增殖作用顯著；水煎復方二在濃度為200～400 mg/mL時對乳腺上皮細胞增殖作用顯著。醇提復方一在濃度為25～400 mg/mL時對乳腺上皮細胞增殖作用顯著，且在濃度為400 mg/mL時增殖作用最強。醇提復方二在濃度為100～400 mg/mL時對乳腺上皮細胞增殖作用極顯著（P＜0.01），表1～3。

2.5中藥復方對小鼠乳腺上皮細胞增殖率的影響隨著藥物作用時間的增加對乳腺上皮細胞增殖作用降低。在復方提取液濃度為400 mg/mL時乳腺上皮細胞的增殖率最大。醇提中藥復方對乳腺上皮細胞增殖率的影響大于水煎中藥復方，圖7～10。

表1　中藥復方提取物對小鼠乳腺上皮細胞增殖的影響（1 d）

表2　中藥復方提取物對小鼠乳腺上皮細胞增殖的影響（3 d）

表3　中藥復方提取物對小鼠乳腺上皮細胞增殖的影響（5 d）

3　結(jié)論與討論

3.1小鼠乳腺上皮細胞體外培養(yǎng)試驗最初接種細胞數(shù)為1×105個，但在2 d后乳腺上皮細胞才開始增殖，說明乳腺上皮細胞潛伏期較長，可能乳腺上皮細胞在潛伏期內(nèi)主要參與活動是貼附過程。進行生物學檢測試驗最適宜時期為對數(shù)生長期，本試驗細胞的對數(shù)生長期從第3天到第6天，其細胞群體倍增時間為60.8 h，比文獻[5]中提早2 h，可能是試驗過程中使用混合酶消化以及在純化過程中使用EDTA孵育的原因，本試驗在分離乳腺上皮細胞過程中降低了胰蛋白酶濃度，可以減少細胞損傷，增強原代細胞活力。在純化過程中使用EDTA孵育同樣減少了胰蛋白酶作用時間，從而降低了胰蛋白酶的不利因素，所以倍增時間減少。

圖7　水煎中藥復方一對乳腺上皮細胞增殖率的影響

圖8　水煎中藥復方二對乳腺上皮細胞增殖率的影響

圖9　醇提中藥復方一對乳腺上皮細胞增殖率的影響

圖10　醇提中藥復方二對乳腺上皮細胞增殖率的影響

3.2中藥復方對小鼠乳腺上皮細胞的增殖和抑制作用本試驗采用中藥復方提取物直接刺激乳腺上皮細胞，發(fā)現(xiàn)其對小鼠乳腺上皮細胞具有高濃度促進細胞生長，低濃度抑制生長的雙重作用，與周凡報道相符[6]。但中藥提取物促進細胞增殖的濃度有所差異，并且藥物作用效果隨作用時間增加而變化，高濃度藥物隨著作用時間增加，促進增殖的效果逐漸降低，低濃度藥物隨作用時間的增加其抑制增殖效果越明顯。同時醇提中藥復方對乳腺上皮細胞的增殖效果優(yōu)于水煎中藥復方，與通常服藥方式相悖。提示本試驗中藥復方的中藥成分可能為醇溶性。

本試驗通過體外刺激乳腺上皮細胞可以在一定程度反應(yīng)復方中藥的作用機理，對復方中藥促進母畜泌乳機理的研究提供了試驗基礎(chǔ)。但在中藥復方促進乳腺上皮細胞藥物的有效成分和促進細胞增殖的信號通路等方面尚待進一步研究。

參考文獻：

[1]易瓊，王魯，李圓方，等.改良型混合酶消化法培養(yǎng)小鼠乳腺上皮細胞[J].中國組織工程研究與臨床康復，2012，15（50）：9335-9338.

[2]李悅山，張建龍，薛壘.黃茂與當歸對人臍靜脈內(nèi)皮細胞增殖及VEGF表達的影響[J].新疆醫(yī)科大學學報，2005，28（3）：224-227.

[3]張團笑，牛采琴，秦曉民.王不留行對家兔離體主動脈環(huán)張力的影響及其機制[J].中藥藥理與臨床，2004，20（4）：28-29.

[4]呂文科，弊睿，曉梅.漏蘆黃酮對成骨細胞的體外毒性試驗研究[J].中醫(yī)骨傷科雜志，2006，4（1）：42-44.

[5]王希春，周凡，馮士彬.中草藥提取物對小鼠乳腺上皮細胞增殖的影響[J].西北農(nóng)林科技大學學報，2011，39（7）：15-20，27.

[6]周凡.中草藥提取物對小鼠乳腺上皮細胞增殖作用的研究[D].合肥：安徽農(nóng)業(yè)大學，2010.

Effect of compound herbal extracts on mouse mammary epithelial cells by different methods

GAO Yun-hang1，2，ZHAO Shi-jun1，ZHAO Han-xu1，WANG Kai1，LOU Yu-jie1，MA Hong-xia1，2
（1.College of Animal Science and Technology，Jilin Agricultural University，Changchun 130118，China；2.Key Laboratory of Animal Production，Product Quality and Security，Jilin Agricultural University，Changchun 130118，China）

Abstract：To study the effect of Chinese medicine extracts on mice mammary gland epithelial cell proliferation .Using mixed enzyme digestion method to mouse mammary gland epithelial cells.Decoction and alcohol extraction methods were used to get the Chinese medicine extracts，and then use the extracts to treat the logarithmic phase mammary gland epithelial cells .At 1 day，3 days，and 5 days later，cell viability was determined by MTT method.Using mixed enzyme digestion method，we successfully got mammary gland epithelial cells.Extracts of traditional Chinese medicine in high concentration promoted cell proliferation，and inhibited cell proliferation in low concentration.Promoting effect was decreased with increasing time.Alcohol extraction of traditional Chinese medicine compound promotes cell proliferation in the concentration range is greater than the water decoction of traditional Chinese medicine.Alcohol extraction of traditional Chinese medicine is much better than the decoction of traditional Chinese medicine，probably because the ingredients are soluble in alcohol.

Key words：Extract of Chinese medicine；Mammary gland epithelial cells；Proliferation

Corresponding author：MA Hong-xia

通訊作者：馬紅霞，E-mail：hongxia0731001@163.com

作者簡介：高云航（1975-），男，副教授，博士，從事動物疫病防治研究，E-mail：gaoyunhang@163.com

基金項目：國家現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系建設(shè)專項（CARS-44-E-6）；吉林省科技發(fā)展計劃項目（20100230）；吉林省現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系建設(shè)專項

收稿日期：2014-05-27

中圖分類號：S853.72

文獻標志碼：A

文章編號：0529- 6005（2016）01- 0027- 04