宗振平，朱　琪，錢婉瑩，鐘友剛，許劍琴，劉鳳華（.中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，北京海淀0093；.北京農(nóng)學(xué)院動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，北京昌平006）

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犬子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞和基質(zhì)細(xì)胞的分離培養(yǎng)與鑒定

宗振平1，朱琪1，錢婉瑩1，鐘友剛1，許劍琴1，劉鳳華2
（1.中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，北京海淀100193；2.北京農(nóng)學(xué)院動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，北京昌平102206）

摘要：為了探究犬子宮內(nèi)膜細(xì)胞的培養(yǎng)方法，采用組織塊培養(yǎng)法和酶消化培養(yǎng)法進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)并使用倒置顯微鏡觀察細(xì)胞的形態(tài)結(jié)構(gòu)和生長(zhǎng)狀態(tài)，對(duì)細(xì)胞進(jìn)行免疫組化鑒定。結(jié)果表明，組織塊培養(yǎng)法需要1周左右培養(yǎng)出犬子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞，且細(xì)胞不易純化；酶消化培養(yǎng)法節(jié)省時(shí)間，獲得的細(xì)胞活力強(qiáng)、純度高。綜上所述酶消化培養(yǎng)法更適于培養(yǎng)犬子宮內(nèi)膜細(xì)胞，為后期細(xì)胞水平研究奠定基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：犬；子宮內(nèi)膜細(xì)胞；組織塊培養(yǎng)法；酶消化培養(yǎng)法

1　材料與方法

1.1子宮來(lái)源子宮由中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)院提供，為正常犬進(jìn)行子宮與卵巢切除術(shù)（OHE）后的子宮，子宮內(nèi)膜生長(zhǎng)階段為間情期。

1.2主要試劑和儀器DMEM/F12（GIBCO）；胎牛血清（GIBCO）；EDTA-胰蛋白（GIBCO）；Ⅰ型膠原酶（GIBCO）；PBS（GIBCO）；超凈工作臺(tái)（蘇州凈化設(shè)備有限公司）；倒置相差顯微鏡（重慶奧特光學(xué)儀器有限責(zé)任公司）；CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱（香港力康生物醫(yī)療科技控股集團(tuán)）；TDZ5-WS多管架自動(dòng)平衡離心機(jī)（湖南湘儀離心機(jī)儀器有限公司）。

1.3方法

1.3.1子宮取樣使用保溫桶加入200 mL的生理鹽水（含100 U/mL青霉素，100 μg/mL鏈霉素）將做完子宮與卵巢切除術(shù)（OHE）的子宮帶回實(shí)驗(yàn)室。在無(wú)菌環(huán)境下，首先將子宮周圍的其余組織剪除，然后使用加入雙抗的生理鹽水對(duì)子宮進(jìn)行沖洗。子宮外部沖洗干凈后，使用手術(shù)剪在子宮角與卵巢的交界剪1個(gè)小孔，使用注射器抽取加入雙抗的生理鹽水對(duì)子宮內(nèi)部進(jìn)行沖洗。

1.3.2組織塊培養(yǎng)法在超凈工作臺(tái)中，準(zhǔn)備好加入雙抗的生理鹽水、玻璃平皿、5 mL玻璃瓶、15 mL離心管，在玻璃平皿和玻璃瓶中加入雙抗生理鹽水。子宮沖洗完畢后放入到加雙抗生理鹽水的玻璃平皿中，將子宮角剪開，使用手術(shù)剪將子宮內(nèi)膜從肌層上分離下來(lái)放入小玻璃瓶中，然后將組織塊剪碎到體積大約為1 mm3（分離的組織塊內(nèi)血細(xì)胞含量較多時(shí)，剪碎前使用生理鹽水沖洗2～3次）。組織塊被剪碎后使用加入雙抗的生理鹽水沖洗干凈，沖洗完畢后使用移液槍將組織塊移入到15 mL離心管中，1 000 r/min離心5 min，離心后使用PBS沖洗2～3次。使用PBS沖洗完畢后，在離心管中加入3～4倍組織塊體積的3%胰酶37℃水浴1 min，然后1 000 r/min離心5 min。丟棄上清液，根據(jù)組織的量，加入少量培養(yǎng)基混勻（培養(yǎng)基的量盡可能的少）。將混勻的組織塊分裝到細(xì)胞瓶中鋪勻，組織塊密度大約為5塊/cm3。組織塊分布均勻后，將細(xì)胞瓶倒置放入CO2培養(yǎng)箱中4 h促進(jìn)組織塊貼壁，4 h后將細(xì)胞瓶慢慢翻轉(zhuǎn)過(guò)來(lái)靜置培養(yǎng)。24 h后進(jìn)行補(bǔ)液，加入1.5 mL培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。以后每天觀察組織塊的生長(zhǎng)狀態(tài)，每2 d換液1次，每次加入3 mL培養(yǎng)基。

1.3.3酶消化培養(yǎng)法酶消化法的前期組織塊處理同組織塊法，使用PBS沖洗完后在離心管內(nèi)加入3～4倍體積的5%的Ⅰ型膠原酶，37℃水浴50 min。進(jìn)行水浴時(shí)離心管要全部浸入水中，每隔10 min震蕩混勻1次。水浴完畢后，加入PBS對(duì)消化液進(jìn)行稀釋（便于進(jìn)行過(guò)濾）。首先使用80目的過(guò)濾網(wǎng)對(duì)稀釋后的消化液進(jìn)行過(guò)濾（該過(guò)程主要將消化后的肌肉組織與細(xì)胞分離），然后使用300目的細(xì)胞篩對(duì)第一次過(guò)濾后的細(xì)胞懸液進(jìn)行過(guò)濾（該過(guò)程主要將上皮細(xì)胞團(tuán)及上皮細(xì)胞和基質(zhì)細(xì)胞分離），使用300目的濾網(wǎng)進(jìn)行過(guò)濾后上皮細(xì)胞團(tuán)及單個(gè)上皮細(xì)胞則保留在濾網(wǎng)上方，使用PBS對(duì)濾網(wǎng)上保留的細(xì)胞團(tuán)和細(xì)胞進(jìn)行沖洗，沖洗后使用移液槍將沖洗液移入離心管中，1 000 r/min離心5 min，丟棄上清后的沉淀即為上皮細(xì)胞團(tuán)和單個(gè)上皮細(xì)胞。根據(jù)細(xì)胞量使用培養(yǎng)基將細(xì)胞稀釋到2×105個(gè)/mL，然后將細(xì)胞懸液移入細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，做好標(biāo)記放入CO2培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)。300目濾網(wǎng)過(guò)濾后的細(xì)胞液中主要為基質(zhì)細(xì)胞，將細(xì)胞液移入離心管中，1 500 r/min離心10 min，沉淀即為基質(zhì)細(xì)胞。使用培養(yǎng)基將基質(zhì)細(xì)胞濃度稀釋到5×105個(gè)/mL，然后將細(xì)胞懸液移入細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，做好標(biāo)記放入CO2培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)。

1.3.4H.E.染色鏡下觀察細(xì)胞爬片，細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)完畢后取出進(jìn)行H.E.染色。首先使用PBS沖洗載玻片2次，每次1 min；使用4%多聚甲醛進(jìn)行固定20 min，PBS漂洗兩次，每次1 min；使用蘇木精染色10 min，自來(lái)水洗滌；鏡下觀察細(xì)胞核染色，如染色多深則使用1%鹽酸酒精分色數(shù)秒，自來(lái)水洗滌；使用伊紅染液染色3 min，自來(lái)水洗滌；染色完畢后將載玻片晾干，使用中性樹膠封片。

1.3.5免疫組化鑒定將無(wú)菌蓋玻片置于六孔板中，將調(diào)節(jié)好的細(xì)胞懸液滴加在蓋玻片上進(jìn)行培養(yǎng)。顯微鏡下觀察，待細(xì)胞長(zhǎng)滿后，取出蓋玻片，用90%乙醇固定10 min，PBS漂洗。上皮細(xì)胞使用犬特異性的角蛋白抗體按照操作進(jìn)行染色，基質(zhì)細(xì)胞使用犬特異性的波形蛋白抗體按照操作進(jìn)行染色。使用PBS做陰性對(duì)照組進(jìn)行染色，光學(xué)顯微鏡下觀察染色結(jié)果。

習(xí)近平總書記指出：“只有堅(jiān)持愛國(guó)和愛黨、愛社會(huì)主義相統(tǒng)一，愛國(guó)主義才是鮮活的、真實(shí)的，這是當(dāng)代中國(guó)愛國(guó)主義精神最重要的體現(xiàn)?！盵注]習(xí)近平：《習(xí)近平在中共中央政治局第二十九次集體學(xué)習(xí)時(shí)強(qiáng)調(diào)：大力弘揚(yáng)愛國(guó)主義精神 為實(shí)現(xiàn)中國(guó)夢(mèng)提供精神支柱》，《人民日?qǐng)?bào)》2015年12月31日，第1版。愛國(guó)主義是一個(gè)歷史范疇，愛國(guó)主義和熱愛中國(guó)共產(chǎn)黨、熱愛社會(huì)主義制度、熱愛中國(guó)特色社會(huì)主義相統(tǒng)一、相一致，是由沒有共產(chǎn)黨就沒有新中國(guó)、只有社會(huì)主義才能救中國(guó)、只有中國(guó)特色社會(huì)主義才能發(fā)展中國(guó)、只有中國(guó)共產(chǎn)黨才能帶領(lǐng)中華民族實(shí)現(xiàn)偉大復(fù)興中國(guó)夢(mèng)的歷史事實(shí)和現(xiàn)實(shí)邏輯所決定的。

2　結(jié)果

2.1組織塊法原代培養(yǎng)細(xì)胞體外生長(zhǎng)方式和形態(tài)特征

2.1.1基質(zhì)細(xì)胞組織塊法培養(yǎng)的基質(zhì)細(xì)胞在組織塊貼壁后24 h內(nèi)即向外游離，細(xì)胞絕大部分為單個(gè)向外游離。在游離初期細(xì)胞呈梭形，游離細(xì)胞相互連接后細(xì)胞增殖生長(zhǎng)呈束為多邊形。

2.1.2上皮細(xì)胞組織塊培養(yǎng)法中上皮細(xì)胞大約在7 d左右開始向外游離。如圖1所示，上皮細(xì)胞呈梭形沿組織塊呈圓環(huán)形向外生長(zhǎng)，以細(xì)胞團(tuán)的方式存在，細(xì)胞之間緊密連接，胞質(zhì)透明，細(xì)胞核輪廓清晰，核仁明顯。

2.2酶消化法原代培養(yǎng)細(xì)胞體外生長(zhǎng)方式和形態(tài)特征

2.2.1基質(zhì)細(xì)胞圖2為接種24 h后的基質(zhì)細(xì)胞，可見細(xì)胞單個(gè)生長(zhǎng)呈梭形。酶消化法接種的基質(zhì)細(xì)胞在培養(yǎng)4 h后貼壁，24 h后處于增殖狀態(tài)，48 h后基質(zhì)細(xì)胞體積變?yōu)樵瓉?lái)的2～3倍，連接成片，細(xì)胞間連接緊密，呈漩渦狀。

圖1　組織塊培養(yǎng)法中向外游離的上皮細(xì)胞（4×10）

圖2　酶消化法接種24 h后的基質(zhì)細(xì)胞A：4×10鏡下的基質(zhì)細(xì)胞；B：4×20鏡下的基質(zhì)細(xì)胞

2.2.2上皮細(xì)胞圖3為培養(yǎng)24 h后的上皮細(xì)胞，可見上皮細(xì)胞連接緊密，輪廓清晰，形態(tài)呈梭形。上皮細(xì)胞在培養(yǎng)8 h后貼壁，24 h后開始增殖，上皮細(xì)胞連接成片后細(xì)胞形態(tài)依然保持梭形，細(xì)胞間連接緊密。48 h后上皮細(xì)胞仍保持梭形，有一部分已經(jīng)細(xì)胞衰老。

圖3　酶消化法接種24 h后的上皮細(xì)胞A：4×10鏡下的上皮細(xì)胞；B：4×20鏡下的上皮細(xì)胞

2.3H.E.染色

2.3.1基質(zhì)細(xì)胞如前插彩版圖4-A、B所示H.E.染色后基質(zhì)細(xì)胞的形態(tài)更加明顯，基質(zhì)細(xì)胞核呈藍(lán)色，細(xì)胞質(zhì)呈紫色。細(xì)胞形態(tài)為多邊形，輪廓更加明顯。

2.3.2上皮細(xì)胞如前插彩版圖5 -A、B所示H.E.染色后可見上皮細(xì)胞延組織塊向外擴(kuò)散生長(zhǎng)，細(xì)胞與細(xì)胞間連接緊密，長(zhǎng)成一片。細(xì)胞核為藍(lán)色，細(xì)胞質(zhì)為紫色。細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)明顯，細(xì)胞間連接染色后也更加明顯。

2.4免疫組化細(xì)胞鑒定試驗(yàn)

2.4.1基質(zhì)細(xì)胞如中插彩版圖6所示，使用犬特異性波形蛋白抗體進(jìn)行免疫組化試驗(yàn)后鏡下觀察基質(zhì)細(xì)胞細(xì)胞質(zhì)呈棕黃色，PBS陰性對(duì)照組基質(zhì)細(xì)胞不著色。使用蘇木精染液復(fù)染后，鏡下觀察基質(zhì)細(xì)胞細(xì)胞核呈藍(lán)色。

2.4.2上皮細(xì)胞如中插彩版圖7所示，使用犬特異性角蛋白抗體進(jìn)行免疫組化試驗(yàn)后鏡下觀察上皮細(xì)胞細(xì)胞質(zhì)呈棕黃色，PBS陰性對(duì)照組上皮細(xì)胞不著色。使用蘇木精染液復(fù)染后，鏡下觀察基質(zhì)細(xì)胞細(xì)胞核呈藍(lán)色。

3　討論

人子宮內(nèi)膜細(xì)胞培養(yǎng)中Akoum A等研究中采用Matthews C J的方法將組織剪碎，使用Ⅰ型膠原酶進(jìn)行孵育消化，通過(guò)2 000 r/min離心10 min將腺細(xì)胞和基質(zhì)細(xì)胞分離[1-2]，Tuckerman E等研究中將收集的人子宮內(nèi)膜剪成1～3 mm3大小，使用0.2%Ⅰ型膠原酶進(jìn)行37℃水浴1 h，每30 min進(jìn)行吹打1次，使消化下來(lái)的細(xì)胞分散開，經(jīng)過(guò)1 000 r/min離心5 min獲得腺上皮細(xì)胞，剩下的組織同樣條件繼續(xù)進(jìn)行消化1 h，然后離心分離獲得顆粒型上皮細(xì)胞[3]。國(guó)內(nèi)研究中戈一峰等研究中使用1.25%Ⅰ型膠原酶進(jìn)行37℃水浴1.5 h，先用80目篩網(wǎng)初篩，然后用300目復(fù)篩，基質(zhì)細(xì)胞通過(guò)細(xì)胞篩，而上皮細(xì)胞留在篩網(wǎng)上，使用PBS沖洗篩網(wǎng)即可獲得上皮細(xì)胞，過(guò)網(wǎng)的濾液則通過(guò)離心獲取基質(zhì)細(xì)胞[4]。秦莉花等使用加入EDTA 的0.25%胰酶、0.1%膠原酶和0.1%透明質(zhì)酸混合體積為剪碎組織的3倍進(jìn)行消化，每20 min終止消化1次，取上清液，加入配好的培養(yǎng)基終止培養(yǎng)，剩余部分按同樣條件繼續(xù)消化，共消化6次，消化完畢經(jīng)過(guò)處理即獲得子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞和基質(zhì)細(xì)胞[5]。陳曉嵐等使用1.25%Ⅰ型膠原酶消化剪碎組織1.5 h，使用80目和300目細(xì)胞篩進(jìn)行初篩和復(fù)篩，基質(zhì)細(xì)胞進(jìn)行500 r/min離心10 min，然后沖洗干凈進(jìn)行培養(yǎng)，篩網(wǎng)上的上皮細(xì)胞被沖洗下來(lái)，沉淀后培養(yǎng)[6]。人的子宮內(nèi)膜細(xì)胞培養(yǎng)大部分使用Ⅰ型膠原酶的方法進(jìn)行消化，處理方式大致相同。

目前國(guó)內(nèi)對(duì)于奶牛、綿羊、兔和小鼠的子宮內(nèi)膜細(xì)胞培養(yǎng)均有研究[7-11]，張雷等分別使用組織塊法和酶消化法進(jìn)行奶牛子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞的培養(yǎng)，組織塊法是將組織剪碎后直接加入培養(yǎng)基進(jìn)行倒置培養(yǎng)，2～4 h后翻轉(zhuǎn)培養(yǎng)瓶進(jìn)行培養(yǎng)，酶消化法先使用0.3%胰蛋白酶進(jìn)行37℃水浴40 min，吸取懸液使用雙層紗布過(guò)濾，未消化的組織塊使用PBS沖洗，獲得上皮細(xì)胞懸液，剩余的組織塊使用0.1%Ⅱ型膠原酶進(jìn)行37℃水浴2 h，將第1次和第2次的消化液合并，加入培養(yǎng)基終止消化，1 000 r/min離心10 min，獲得的細(xì)胞使用培養(yǎng)基進(jìn)行稀釋培養(yǎng)[8-9]。

國(guó)外Kovacs G.等使用酶消化法進(jìn)行犬子宮內(nèi)膜細(xì)胞培養(yǎng)，使用1%Ⅰ型膠原酶進(jìn)行37℃水浴2～3 h，然后先使用250 μm的細(xì)胞篩除去肌肉組織和未消化完全的組織，然后使濾液通過(guò)40 μm的細(xì)胞篩，通過(guò)兩次篩濾獲得犬子宮內(nèi)膜基質(zhì)細(xì)胞和上皮細(xì)胞[12]。國(guó)內(nèi)目前沒有犬子宮內(nèi)膜細(xì)胞培養(yǎng)的相關(guān)研究，本試驗(yàn)中培養(yǎng)條件是根據(jù)人和各種動(dòng)物的研究進(jìn)行摸索得出。在細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中細(xì)胞密度的調(diào)整非常關(guān)鍵，細(xì)胞懸液密度一般為2×105/mL。密度過(guò)低細(xì)胞不易建立細(xì)胞連接，細(xì)胞不易進(jìn)行增殖；密度過(guò)高細(xì)胞生長(zhǎng)過(guò)密，容易導(dǎo)致細(xì)胞活性降低。在細(xì)胞生長(zhǎng)過(guò)程中要注意掌握犬子宮內(nèi)膜基質(zhì)細(xì)胞和上皮細(xì)胞的生長(zhǎng)周期，基質(zhì)細(xì)胞在24 h內(nèi)增殖較快，細(xì)胞保持梭形狀態(tài)。本試驗(yàn)使用組織塊法和酶消化法兩種方法進(jìn)行犬子宮內(nèi)膜細(xì)胞培養(yǎng)，其中酶消化法節(jié)省時(shí)間，獲得的細(xì)胞活性、細(xì)胞純度較高，適于培養(yǎng)犬子宮內(nèi)膜細(xì)胞。

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Isolation，Cultureand Identification of Canine Endometrial Epithelial Cells and Stromal Cells

ZONG Zhen-ping1，ZHU Qi1，QIAN Wan-ying1，ZHONG You-gang1，XU Jian-qin1，LIU Feng-hua2
（1.College of veterinary medicine，China Agriculture University，Beijing 100193，China；2.Animal science and technology college，Beijing Univercity of Agriculture，Beijing 102206，China）

Abstract：To study the methods for culturing canine endometrial cells，tissue block culture method and enzymatic digestion culture method were used in this study . Cells were identified by immunohistochemical staining，the morphological structure and growth status of endometrial epithelium cells were observed by inverted phase-contrast microscope .Our results showed that tissue block culture method which is not easy to purify cells took longer time to get endometrial epithelium cells than the enzymatic digestion culture method.The enzymatic digestion culture method got high-viability and high-purity cells in 24 hours.In conclusion，enzymatic digestion culture method is appropriate for canine endometrial cell culture，which can be used for the further study.

Key words：canine；endometrial cells；tissue block culture method；enzymatic digestion culture method

Corresponding authors: XU Jian-qin；LIU Feng-hua

通訊作者：許劍琴，E-mail：jianqinxucau@126.com；劉鳳華，E-mail：liufenghua1209@126.com

作者簡(jiǎn)介：宗振平（1988-），女，碩士，研究方向?yàn)樾?dòng)物中獸醫(yī)，E-mail：lanberzong@163.com

基金項(xiàng)目：“十二五”國(guó)家科技支撐計(jì)劃重點(diǎn)項(xiàng)目：防制畜禽呼吸、消化系統(tǒng)常見病證中獸藥創(chuàng)制及應(yīng)用示范（2011BAD34B-01）；北京市教委創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)的建設(shè)與教師職業(yè)發(fā)展的項(xiàng)目（PXM2-013_014207_000067）

收稿日期：2014-06-12

中圖分類號(hào)：S858.292

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號(hào)：0529- 6005（2016）01- 0020- 04