宋麗聰，王黎霞，劉新月，趙晨璐，張建軍，安　健（.北京農(nóng)學(xué)院動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，北京昌平006；.北京農(nóng)業(yè)職業(yè)學(xué)院畜牧獸醫(yī)系，北京房山044）

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柔嫩艾美耳球蟲裂殖子對侵入細(xì)胞凋亡抑制通路的研究

宋麗聰1，王黎霞2，劉新月1，趙晨璐1，張建軍1，安健1
（1.北京農(nóng)學(xué)院動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，北京昌平102206；2.北京農(nóng)業(yè)職業(yè)學(xué)院畜牧獸醫(yī)系，北京房山102442）

摘要：為了研究柔嫩艾美耳球蟲（Eimeria tenlla）裂殖子入侵宿主細(xì)胞后對凋亡誘導(dǎo)的抑制通路，將純化的裂殖子與牛腎傳代細(xì)胞（MDBK細(xì)胞）共培養(yǎng)1.5 h。用含6%乙醇的完全培養(yǎng)基誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡2.5 h，通過流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡率。采用標(biāo)準(zhǔn)試劑盒測定Cyto C，Caspase8，Caspase9，Caspase3的活性。流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果顯示，入侵裂殖子的細(xì)胞在誘導(dǎo)凋亡后其凋亡率為4.57%，而未感染的細(xì)胞其凋亡率達(dá)到23.69%，二者差異顯著（P＜0.05），誘導(dǎo)凋亡的MDBK細(xì)胞早期凋亡率為19.50%，晚期凋亡率為4.19%，而感染裂殖子后誘導(dǎo)凋亡的MDBK細(xì)胞其早期凋亡率為3.53%，晚期凋亡率為1.04%，差異顯著（P＜0.05）。結(jié)果表明，裂殖子的入侵不但可以抑制細(xì)胞凋亡，還可以延緩細(xì)胞進(jìn)入早期凋亡的時(shí)間。試劑盒結(jié)果表明，裂殖子使Cyto C，Caspase8，Caspase9的活性下降，而Caspase3沒有變化。根據(jù)上述結(jié)果初步判斷，E. tenlla裂殖子抑制MDBK細(xì)胞的凋亡是通過線粒體通路。

關(guān)鍵詞：柔嫩艾美耳球蟲；裂殖子；MDBK細(xì)胞；細(xì)胞凋亡；通路

雞球蟲病是一種由原生動(dòng)物門寄生蟲引起的疾病，嚴(yán)重影響著家禽的飼料轉(zhuǎn)化率，全球每年因?yàn)榍蛳x病造成的經(jīng)濟(jì)損失約2.4億美元[1]。深入研究球蟲與入侵宿主細(xì)胞的相互關(guān)系，可以為研制新型抗球蟲疫苗和治療藥物奠定基礎(chǔ)。

研究表明，弓形蟲能通過阻斷不同的凋亡信號級聯(lián)放大反應(yīng)來抑制宿主細(xì)胞凋亡，以此延長在宿主細(xì)胞內(nèi)的存活時(shí)間，以便于完成生活史[2]。最新的研究表明，弓形蟲等胞內(nèi)寄生的原蟲可以通過調(diào)節(jié)NF-KB、Caspase級聯(lián)、細(xì)胞色素C、P13K-AKB信號通路抑制宿主細(xì)胞凋亡[3]。然而，球蟲對宿主細(xì)胞凋亡機(jī)制的相關(guān)研究較少。目前，有研究表明，E.tenella感染可造成宿主細(xì)胞膜電位的下降以及線粒體通透性轉(zhuǎn)換孔（MPTP）的開放。而MPTP開放是E.tenella調(diào)節(jié)宿主細(xì)胞線粒體凋亡通路中的關(guān)鍵環(huán)節(jié)[4]。為了深入研究E.tenella抑制侵入細(xì)胞凋亡的機(jī)制，我們實(shí)驗(yàn)分離純化E. tenlla裂殖子，使其入侵MDBK細(xì)胞，采用6%乙醇作為凋亡誘導(dǎo)劑，采用流式細(xì)胞術(shù)，標(biāo)準(zhǔn)試劑盒分光光度法檢測裂殖子對細(xì)胞線粒體凋亡通路相關(guān)因子的變化，初步確定E.tenella抑制MDBK細(xì)胞凋亡的通路。

1　材料與方法

1.1E.tenlla BJ4株孢子化卵囊由北京農(nóng)學(xué)院實(shí)驗(yàn)室保存，每3個(gè)月用公雞雛復(fù)壯，宿主細(xì)胞為本實(shí)驗(yàn)室保存的MDBK細(xì)胞系。

1.2實(shí)驗(yàn)分組試驗(yàn)共分4組。A組：未感染球蟲，未誘導(dǎo)凋亡；B組：未感染球蟲，誘導(dǎo)凋亡；C組：感染球蟲，未誘導(dǎo)凋亡；D組：感染球蟲，誘導(dǎo)凋亡，每組3個(gè)重復(fù)樣品。

1.3裂殖子分離純化及誘導(dǎo)侵入細(xì)胞的凋亡

孢子化卵囊感染7日齡無球蟲雛雞，每只雞1× 105卵囊。感染108 h捕殺試驗(yàn)雞，剪開盲腸壁，在洗脫液中刮下黏膜，勻漿，游離出裂殖子。勻漿通過過濾離心除去盲腸組織塊和大的雜質(zhì)。加入適量洗脫液重懸，42℃水浴鍋中水浴5 min。將水浴后的裂殖子重懸液加入層析柱中，收集純化后的裂殖子。與傳至第3代的MDBK細(xì)胞共培養(yǎng)1.5 h。用6%乙醇誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡2.5 h。1.4流式細(xì)胞術(shù)檢測將待測細(xì)胞濃度調(diào)整為5×105～1×106個(gè)/mL。取1 mL細(xì)胞，離心收集沉淀。將細(xì)胞重懸于200 μL Binding Buffer。加入10 μL PI和10 μL Annexin V-FITC，混勻，室溫避光孵育15 min。加入300 μL Binding Buffer，上機(jī)檢測。

1.5試劑盒檢測Cyto C的釋放量及Caspase8，Caspase9，Caspase3的活性按照檢測試劑盒產(chǎn)品說明書，使用比色法和分光光度法檢測Cyto C的釋放量及Caspase8，Caspase9，Caspase3的活性。

1.6統(tǒng)計(jì)學(xué)分析數(shù)據(jù)分析采用SPSS17.0軟件進(jìn)行，用方差齊性檢驗(yàn)和單因素方差分析（One Way ANOVA）進(jìn)行多組間比較分析，以P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1裂殖子的純化結(jié)果由雞盲腸黏膜分離得到的裂殖子（圖1A），含有大量的細(xì)菌，紅細(xì)胞及雜質(zhì)。經(jīng)DE-52纖維素層析柱純化后，收集到較為純凈的裂殖子（圖1B）。

圖1　裂殖子分離及純化A：分離后未純化的裂殖子；B：純化后的裂殖子

2.2流式細(xì)胞術(shù)檢測結(jié)果未入侵組細(xì)胞凋亡率為0.69%（圖2A），入侵組細(xì)胞凋亡率為1.34%（圖2C）。誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡2.5 h后，細(xì)胞凋亡率達(dá)到23.69%（圖2B）。而裂殖子入侵的細(xì)胞，細(xì)胞凋亡率僅為4.57%（圖2D），后者細(xì)胞凋亡率大約是前者的19.29%。

圖2　流式細(xì)胞術(shù)檢測MDBK細(xì)胞在各種處理方式下的凋亡水平注：左下象限顯示活細(xì)胞，為（FITC-/PI-）；右上象限是非活細(xì)胞，即壞死細(xì)胞和晚期凋亡細(xì)胞，為（FITC＋/PI＋）；而右下象限顯示早期凋亡細(xì)胞，為（FITC＋/PI-）；左上象限顯示機(jī)械損傷細(xì)胞

2.3Cyto C，Csapase8，Caspase9，Caspase3的檢測結(jié)果誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡后，細(xì)胞漿中的Cyto C濃度大于線粒體中的含量（圖3aB），且差異顯著（P＜0.05）。攻蟲后誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡細(xì)胞漿中Cyto C的釋放量也大于線粒體中的含量（圖3aD），且差異顯著（P＜0.05）。但是細(xì)胞漿中Cyto C的釋放量小于細(xì)胞漿中Cyto C的釋放量（圖3aD），且差異顯著（P＜0.05）。誘導(dǎo)凋亡組Caspase8酶活力高于空白組（圖3b），因此，凋亡誘導(dǎo)有效。而攻蟲誘導(dǎo)凋亡組caspase8酶活力低于誘導(dǎo)凋亡組，且差異顯著（P＜0.05）。誘導(dǎo)凋亡組Caspase9酶活力高于空白組（圖3c），且差異顯著（P＜0.05），因此，凋亡誘導(dǎo)有效。而攻蟲誘導(dǎo)凋亡組caspase9酶活力低于誘導(dǎo)凋亡組，且差異顯著（P＜0.05）。誘導(dǎo)凋亡組Caspase3酶活力高于空白組（圖3d），且差異顯著（P＜0.05），因此，凋亡誘導(dǎo)有效。但攻蟲凋亡組Caspase3酶活力高于誘導(dǎo)凋亡組，且差異顯著（P＜0.05）。

圖3　不同條件下4種凋亡因子的變化注：A：空白組；B：誘導(dǎo)凋亡組；C：攻蟲組；D：攻蟲誘導(dǎo)凋亡組；不同字母代表差異顯著（P＜0.05），相同字母代表差異不顯著

3　結(jié)論

本試驗(yàn)表明，E.tenlla裂殖子可以入侵并抑制MDBK細(xì)胞的凋亡，裂殖子可能是通過抑制細(xì)胞線粒體凋亡通路中CytoC，caspase8，caspase9的激活達(dá)到抑制細(xì)胞啟動(dòng)自我凋亡程序的，而Caspase3是否受到其他蛋白的調(diào)控還需要進(jìn)一步研究。

4　討論

本試驗(yàn)通過流式細(xì)胞術(shù)檢測不同處理?xiàng)l件下的細(xì)胞凋亡狀況，分析數(shù)據(jù)可以發(fā)現(xiàn)誘導(dǎo)凋亡組，細(xì)胞凋亡率達(dá)到23.69%（圖2B），而攻蟲凋亡組，細(xì)胞凋亡率僅為4.57%（圖2D）。除此之外，誘導(dǎo)凋亡組細(xì)胞早期凋亡率為19.50%，晚期凋亡率為4.19%。誘導(dǎo)凋亡組細(xì)胞早期凋亡率為3.53%，晚期凋亡率為1.04%。由此可以證明，裂殖子不但可以抑制細(xì)胞凋亡，還可以延緩細(xì)胞進(jìn)入早期凋亡的時(shí)間，以此延長自身在細(xì)胞內(nèi)的生存時(shí)間。

在脊椎動(dòng)物細(xì)胞凋亡過程中，線粒體被認(rèn)為是處于凋亡調(diào)控的中心位置，而其關(guān)鍵性因子是細(xì)胞色素C。另外，Caspase8被認(rèn)為是細(xì)胞凋亡信號轉(zhuǎn)導(dǎo)過程中比較上游的一個(gè)Caspase。在Fasreceptor和TNFR-1介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡過程中Caspase8被激活，形成一個(gè)P18和P10組成的二聚體，進(jìn)一步激活下游的Caspase4，Caspase6，Caspase9和Caspase10[5-6]。如圖3a，3b，3c所示，D組均比B組數(shù)值低，即裂殖子可以通過抑制Cyto C，Caspase8，Caspase9的激活抑制或延緩細(xì)胞凋亡。而圖3d所示，D組Caspase3酶活力高于B組，這可能是因?yàn)镃aspase3作為直接的凋亡誘導(dǎo)因子處于細(xì)胞凋亡調(diào)控的最后一環(huán)，受到最多的正負(fù)調(diào)控，如近年研究發(fā)現(xiàn)，熱休克蛋白家族和核轉(zhuǎn)錄因子（NF-κB）家族都具有阻斷宿主細(xì)胞凋亡的作用。

目前，弓形蟲與宿主細(xì)胞凋亡關(guān)系的研究主要集中于JNK通路，曾有報(bào)道，堆型艾美耳球蟲存在與痘病毒抑制細(xì)胞凋亡相關(guān)[7]的絲氨酸蛋白酶抑制劑，其主要抑制Caspase的活性。NF-κB通路幾乎不依賴Caspase通路，而JNK通路的激活卻和Caspase有很大關(guān)系。另外，發(fā)現(xiàn)牛艾美耳球蟲入侵細(xì)胞可使Fas的表達(dá)受c-FLIP的影響[8]，而這個(gè)通路與弓形蟲抑制凋亡的通路相關(guān)。該通路的受體TNFR1也是NF-κB的重要受體，通過連接TRADD，TRAF2/5，RIP1，激活核因子通路。弓形蟲屬與艾美耳屬在遺傳學(xué)上十分相近[9]，因此，我們推測，凋亡過程可能有另外的蛋白參與，或者E.tenlla裂殖子抑制宿主細(xì)胞凋亡的通路可能不止一條。

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Thepathway of invaded cells to inhibit apoptosis by Eimeriatenellamerozoites

SONG Li-cong1，WANG Li-xia2，LIU Xin-yue1，ZHAO Chen-lu1，ZHANG Jian-jun1，AN Jian1
（1.College of Animal Science and Technology，Beijing University of Agriculture，Beijing 102206，China；2.Beijing Vocational College of Agriculture，Beijing 102442，China）

Abstract：In order to study the inhibitory pathways of E.tenlla merozoites-invaded host cells after induction of apoptosis，the purified merozoites and MDBK cells were co-cultured for 1.5 h.The apoptosis was induced by complete medium containing 6%ethanol for 2.5 h.Then the apoptosis of MDBK cells was analyzed by flow cytometry .We used kit and spectrophotometry to measure the activity of cytochrome C，Caspase8，and Caspase9.The results of flow cytometry indicated that apoptotic rate was 4.57%in the merozoites group and apoptotic rate was 23.69%in of the group without merozoites，and the difference was significant（P＜0.05）.Early apoptotic rate was 19.50%and late apoptotic rate was 4.19%in the group without merozoites，while early apoptotic rate was 3.53%and late apoptotic rate was 1.04%in the merozoites group.The difference was significiant（P＜0.05）.Merozoites can not only inhibit apoptosis，but also delay cells into early apoptosis.The results also showed that the cyto C，Caspase 8，and Caspase 9 were decreased，while Caspase 3 unchanged.These results suggest that E.tenella merozoites inhibits apoptosis in MDBK cells induced by mitochondrial pathway.

Key words：E.Tenella；Merozoites；MDBK cells；Apoptosis；Pathway

Corresponding author：AN Jian

通訊作者：安健，E-mail：anyh001@bac.edu.cn

作者簡介：宋麗聰（1991-），女，碩士生，研究方向?yàn)楂F醫(yī)寄生蟲與分子生物學(xué)，E-mail：13436347439@163.com

基金項(xiàng)目：北京農(nóng)業(yè)職業(yè)學(xué)院技術(shù)研發(fā)與示范推廣項(xiàng)目（XFYF-14-09）

收稿日期：2015-03-24

中圖分類號：S852.72+3

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號：0529- 6005（2016）01- 0014- 03