王　婷，劉文華，鄒　玲，張　燦，任慧英（青島農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科技學(xué)院，山東青島266109）

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鼠疫菌素的克隆表達(dá)與活性分析

王婷，劉文華，鄒玲，張燦，任慧英
（青島農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科技學(xué)院，山東青島266109）

摘要：為了研究鼠疫菌素的抑菌作用，PCR擴(kuò)增并克隆鼠疫菌素（pst）基因，構(gòu)建鼠疫菌素原核重組表達(dá)質(zhì)粒pET28a-pst，在大腸桿菌BL21中表達(dá)。經(jīng)His標(biāo)簽蛋白純化柱純化獲得重組鼠疫菌素蛋白，并檢測表達(dá)蛋白的抑菌活性。結(jié)果表明，鼠疫菌素基因長1 074 bp，重組鼠疫菌素為44 kD，以包涵體形式表達(dá)。純化的鼠疫菌素對金黃色葡萄球菌ATCC25923和大腸桿菌O78具有一定的抑菌作用。研究結(jié)果將為進(jìn)一步研究鼠疫菌素的應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：鼠疫菌素；克?。辉吮磉_(dá)；抑菌活性

Expression and Antibacterial Activity Analysis of Pesticin WANG Ting，LIU Wen-hua，ZOU Ling，ZHANG Can，REN Hui-ying

（College of Animal Science and Technology，Qingdao Agricultural University，Qingdao 266109，China）
Abstract：In order to investigate the antibacterial activity of pesticin（pst），pesticin gene was amplified by PCR and cloned into the prokaryotic expression plasmid pET28a-pst and expressed in BL21.The recombinant pesticin was purified with His-Tagged Protein Purification Kit and the antibacterial activity was analyzed .Our results showed that the full length of pesticin gene was 1 074 bp，and the recombinant pesticin was 44 kD.The antibacterial test results showed that purified pesticin had antibacterial activities against Staphylococcus aureu25923 and Escherichia.coli O78.
Key words：pesticin；cloning；prokaryotic expression；antibacterial activity
Corresponding authors：REN Hui-ying；ZHANG Can

細(xì)菌耐藥性以及耐藥菌感染是人醫(yī)和獸醫(yī)臨床共同面臨的一大難題。以大腸桿菌為例，全球每年因產(chǎn)腸毒素大腸桿菌（ETEC）引起的感染超過6.5億例，并導(dǎo)致約80萬例病人死亡[1]。據(jù)王占華報(bào)道[2]，分離自醫(yī)院的854株大腸桿菌對氨芐西林的耐藥率高達(dá)87%，對慶大霉素和美絡(luò)西林的耐藥率超過70%，對頭孢哌酮和頭孢噻吩的耐藥率均超過50%。大腸桿菌引起的初生仔豬腹瀉、雞大腸桿菌性敗血癥是動物養(yǎng)殖中的常見病，其發(fā)病率在細(xì)菌病中居首位。從華北地區(qū)分離的雞源大腸桿菌中84.76%對四環(huán)素耐藥，70.12%對多西環(huán)素耐藥[3]；豬肉中大腸桿菌可耐受的藥物種類達(dá)8～11種，雞肉中大腸桿菌對7～8種藥物耐藥[4]。盡管阿米卡星未被批準(zhǔn)為獸藥，但雞肉源大腸桿菌對阿米卡星的耐藥率達(dá)16.5%。細(xì)菌的廣泛耐藥性使抗生素治療越來越困難，因此開發(fā)能有效規(guī)避細(xì)菌耐藥性的抗生素替代品乃當(dāng)務(wù)之急。

鼠疫菌素由鼠疫耶爾森菌產(chǎn)生，是具有溶菌酶活性的細(xì)菌素，可裂解細(xì)菌細(xì)胞壁中的肽聚糖，從而發(fā)揮殺菌作用。除可直接作用于革蘭陽性菌外，鼠疫菌素還可以殺死親緣關(guān)系較近的革蘭陰性菌。研究發(fā)現(xiàn)[5]，鼠疫菌素能特異靶向致病性大腸桿菌表面的FyuA蛋白，從而對大腸桿菌產(chǎn)生殺傷作用。FyuA是耶爾森菌強(qiáng)毒力島中fyuA基因編碼產(chǎn)物，大部分致病性大腸桿菌攜帶fyuA基因[6]，從而成為鼠疫菌素的靶細(xì)胞。國內(nèi)外對鼠疫菌素的殺菌作用鮮有報(bào)道，為了進(jìn)一步研究鼠疫菌素的殺菌效果，本研究對鼠疫菌素基因進(jìn)行克隆表達(dá)，并對其進(jìn)行活性分析，以期為人和動物細(xì)菌病的控制提供新型的抗生素替代品。

1　材料與方法

1.1質(zhì)粒與菌株克隆載體pMD19-T，購自TaKaRa公司；表達(dá)載體pET28a、大腸桿菌DH5α和BL21均為本實(shí)驗(yàn)室保存，鼠疫菌素DNA模板由云南省地方病防治所提供，金黃色葡萄球菌ATCC- 25923及O78型大腸桿菌分離株均為本實(shí)驗(yàn)室保存。

1.2引物與主要試劑限制性內(nèi)切酶、PCR產(chǎn)物回收試劑盒和T4 DNA連接酶，均購自TaKaRa公司；質(zhì)粒提取試劑盒、膠回收試劑盒、Ni-Agarose His標(biāo)簽蛋白純化試劑盒及BCA蛋白濃度測定試劑盒，均購自北京康為世紀(jì)生物科技有限公司。上游引物pstF：5′-CCGGAATTCATGTCAGATACAA TG-3′，下游引物pstR：5′-CGCGTCGACTTATTTTAACAATC-3′，酶切位點(diǎn)用下劃線表示，由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。慶大霉素及林可霉素藥敏紙片為杭州天和微生物試劑有限公司產(chǎn)品。

1.3鼠疫菌素基因的克隆及重組表達(dá)載體的構(gòu)建以鼠疫菌素DNA為模板，PCR擴(kuò)增鼠疫菌素基因。將目的基因連接到pMD19-T載體上，獲得質(zhì)粒pst/T，測序并進(jìn)行序列分析。將鼠疫菌素基因進(jìn)一步克隆到pET28a表達(dá)質(zhì)粒，對重組質(zhì)粒進(jìn)行PCR及雙酶切鑒定、測序。將測序正確的表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化BL21感受態(tài)細(xì)胞，獲得表達(dá)鼠疫菌素pst的重組菌pET28a-pst/ BL21。

1.4重組蛋白pst的表達(dá)及條件優(yōu)化將重組表達(dá)菌接入含有100 μg/mL卡那霉素的LB培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)至菌液OD值為0.6，加入不同濃度的IPTG進(jìn)行誘導(dǎo)，在不同時間分別取樣，SDSPAGE檢測重組蛋白的表達(dá)情況，分析不同誘導(dǎo)劑濃度和誘導(dǎo)時間對重組蛋白表達(dá)量的影響，確定最佳誘導(dǎo)表達(dá)條件。

1.5重組蛋白pst的可溶性檢測及Western-Blot鑒定離心收集經(jīng)IPTG在最佳條件下誘導(dǎo)表達(dá)后的菌體，PBS重懸后在冰浴條件下進(jìn)行超聲波裂解，裂解條件為：冰浴間歇超聲，超聲3 s，間歇1 s，待菌液較清亮?xí)r，約30 min停止超聲，12 000 r/min （4℃）離心5 min，將上清和沉淀（PBS重懸）分別加入1×SDS上樣緩沖液，煮沸后進(jìn)行SDS-PAGE電泳，分析重組蛋白的表達(dá)形式。參照文獻(xiàn)[7]進(jìn)行Western-Blot分析。鼠抗His標(biāo)簽為首抗（1∶1 500），HRP標(biāo)記羊抗鼠IgG為二抗（1∶3 000），DAB顯色。1.6重組蛋白pst的純化將重組表達(dá)菌進(jìn)行超聲破碎，離心收集沉淀。將包涵體蛋白經(jīng)洗滌后變性溶解，對包涵體粗提取物進(jìn)行透析與復(fù)性，4℃條件下進(jìn)行尿素梯度透析復(fù)性（6、4、2、1、0 mol/L各12 h）。將復(fù)性的pst蛋白溶液用Ni-Agarose His標(biāo)簽蛋白純化試劑盒純化，收集目的蛋白峰后進(jìn)行SDS-PAGE分析蛋白純度。以BCA蛋白濃度測定試劑盒測定蛋白濃度。

1.7重組蛋白pst的抑菌試驗(yàn)將金黃色葡萄球菌ATCC25923和大腸桿菌O78菌株分別經(jīng)液體培養(yǎng)至對數(shù)期（菌液濃度達(dá)108CFU/mL），取200 μL菌液在普通瓊脂平板表面均勻涂布，將滅菌牛津杯（直徑8 mm）放置于培養(yǎng)基的表面，在其中加入200 μL濃度為1 mg/mL的純化蛋白，慶大霉素和林可霉素為抗生素對照，37℃溫箱中培養(yǎng)18 h左右，測量抑菌圈大小。

1.8重組蛋白pst的溶菌活性復(fù)蘇金黃色葡萄球菌ATCC25923和大腸桿菌O78首株，分別進(jìn)行液體培養(yǎng)，37℃培養(yǎng)8 h，用LB肉湯依次倍比稀釋到10-5，將蛋白與菌液相互作用，同時設(shè)PBS對照，作用2 h后，取出100 μL，用LB肉湯依次倍比稀釋到10-3和10-2，取400 μL加至無菌平皿中，倒入約50℃的培養(yǎng)基，充分搖勻，每個稀釋度重復(fù)2次，凝固后倒置培養(yǎng)24 h，進(jìn)行計(jì)數(shù)。

2　結(jié)果與分析

2.1鼠疫菌素基因的克隆及測序用pst引物對擴(kuò)增鼠疫菌素基因，并克隆入pMD19-T載體。將重組質(zhì)粒進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到與預(yù)期1 074 bp大小一致的條帶（圖1）。經(jīng)測序比對分析，克隆基因與鼠疫菌素pst基因（GenBank號為NC-017159.1）的同源性為100%。

2.2pst重組表達(dá)載體pET28a-pst的構(gòu)建將質(zhì)粒pst/T經(jīng)雙酶切后回收目的條帶，插入pET28a，構(gòu)建pET28a-pst重組表達(dá)質(zhì)粒。PCR及酶切分析均得到與預(yù)期大小相當(dāng)?shù)臈l帶，重組質(zhì)粒的測序分析表明插入的片段正確（圖2）。

2.3pst表達(dá)條件的優(yōu)化將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至BL21，IPTG誘導(dǎo)表達(dá)后進(jìn)行SDS-PAGE分析。與空質(zhì)粒相比，出現(xiàn)與預(yù)期44 kD一致的蛋白條帶。蛋白誘導(dǎo)優(yōu)化分析結(jié)果顯示0.8 mmol/LIPTG，誘導(dǎo)6 h效果最佳（圖3、4）。

圖1　pst基因的PCR擴(kuò)增M：DNA標(biāo)準(zhǔn)分子質(zhì)量；1：pst基因的PCR產(chǎn)物

圖2　pET28a- pst的雙酶切結(jié)果M：DNA標(biāo)準(zhǔn)分子質(zhì)量；1：pET28a-pst的雙酶切；2：pET28a-pst

圖3　IPTG濃度對pst表達(dá)的影響M：標(biāo)準(zhǔn)蛋白分子質(zhì)量；1～8：重組菌分別用0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4 mmol/L的IPTG進(jìn)行誘導(dǎo)；9：空質(zhì)粒表達(dá)菌

圖4　誘導(dǎo)時間對pst表達(dá)的影響M：標(biāo)準(zhǔn)蛋白分子質(zhì)量；1：空質(zhì)粒表達(dá)菌；2～9：重組菌分別誘導(dǎo)1、2、3、4、5、6、7、8 h

2.4重組蛋白pst的可溶性檢測及Western-Blot鑒定將誘導(dǎo)表達(dá)的菌體經(jīng)超聲裂解，分別取上清與沉淀進(jìn)行SDS-PAGE電泳。結(jié)果表明，沉淀中有大量的目的蛋白條帶，而上清中僅有少量的蛋白條帶，因此pst重組蛋白主要以包涵體的形式存在（圖5）。將經(jīng)IPTG誘導(dǎo)的重組菌pET28apst/BL21經(jīng)SDS-PAGE電泳后進(jìn)行Western-Blot鑒定。結(jié)果表明，重組蛋白能與抗His的單克隆抗體結(jié)合，且符合44 kD的預(yù)期大小。

2.5重組蛋白pst的純化與鑒定將重組表達(dá)菌的包涵體蛋白經(jīng)變性與透析復(fù)性后進(jìn)行蛋白純化。純化蛋白經(jīng)SDS-PAGE分析，證明與預(yù)期的44 kD大小相符。

2.6重組蛋白pst的抑菌試驗(yàn)平板抑菌試驗(yàn)結(jié)果表明，重組蛋白pst能夠?qū)瘘S色葡萄球菌ATCC 25923和O78型大腸桿菌產(chǎn)生抑菌效果，抑菌圈大小分別為16 mm和12 mm。

2.7重組蛋白pst的溶菌活性通過蛋白與菌液相互作用后，與PBS對照組相比，金黃色葡萄球菌細(xì)菌數(shù)下降22%，大腸桿菌O78細(xì)菌數(shù)下降14%。

圖5　目的蛋白pst的可溶性鑒定M：標(biāo)準(zhǔn)蛋白分子質(zhì)量；1：菌體裂解上清；2：菌體裂解沉淀

3　討論

細(xì)菌素是細(xì)菌產(chǎn)生的一種具有殺菌作用的蛋白質(zhì)，通常認(rèn)為，細(xì)菌素只能作用于與它同種不同菌株的細(xì)菌以及與它親緣關(guān)系相近的細(xì)菌[8]。細(xì)菌素可抑制多種病原菌，但抑菌譜的寬窄差異較大。如乳球菌素僅能抑制其他乳球菌，而戊糖片球菌產(chǎn)生的細(xì)菌素對綠膿桿菌、克雷伯菌及李斯特菌具有抑制作用[9]。細(xì)菌素的作用機(jī)制多種多樣，主要分能量依賴性和非能量依賴性兩種。鼠疫菌素是比較獨(dú)特的細(xì)菌素，具有溶菌酶活性，能水解肽聚糖成分。肽聚糖是細(xì)菌細(xì)胞壁特有的成分，細(xì)菌細(xì)胞壁的結(jié)構(gòu)存在差異，革蘭陰性菌的肽聚糖層有外膜包裹，而革蘭陽性菌肽聚糖層暴露在表面，因此理論上鼠疫菌素可對革蘭陽性菌產(chǎn)生直接殺傷作用。文獻(xiàn)報(bào)道，鼠疫菌素對革蘭陰性的殺傷作用需要依賴于目標(biāo)細(xì)菌表面特定的外膜蛋白FyuA，F(xiàn)yuA是耶爾森菌強(qiáng)毒力島中fyuA基因的編碼產(chǎn)物，大部分致病性大腸桿菌攜帶fyuA基因[3，10]，從而成為鼠疫菌素的靶細(xì)胞。理論上鼠疫菌素對革蘭陽性菌，如金黃色葡萄球菌、溶壁微球菌及大部分致病性大腸桿菌具有裂解作用。

本研究發(fā)現(xiàn)，人工表達(dá)的鼠疫菌素對金黃色葡萄球菌ATCC25923和大腸桿菌O78具有抑菌作用，對鼠疫菌素作用機(jī)理的深入研究將為開發(fā)治療細(xì)菌病的抗生素替代品奠定基礎(chǔ)。

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通訊作者：任慧英，E-mail：renren0228@sina.com；張燦，E-mail：cleverflame@163.com

作者簡介：王婷（1990-），女，碩士生，主要從事獸醫(yī)微生物與免疫學(xué)方向的研究，E-mail：wangting900603@163.com

基金項(xiàng)目：山東省自然科學(xué)基金（ZR2009DM009）；山東省自然科學(xué)基金（ZR2013CQ024）

收稿日期：2014-10-27

中圖分類號：R 516.8

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號：0529- 6005（2016）01- 0006- 03