龍煙朦，高鴻博，馬　磊，2，李木子，2，劉　群，2，劉　晶，2（.中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，北京海淀0093；2.農(nóng)業(yè)部動(dòng)物流行病學(xué)與人畜共患病重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室農(nóng)業(yè)部國(guó)家動(dòng)物寄生原蟲(chóng)實(shí)驗(yàn)室，北京海淀0093）

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新孢子蟲(chóng)對(duì)小鼠致病力及在小鼠體內(nèi)動(dòng)態(tài)分布的研究

龍煙朦1，高鴻博1，馬磊1，2，李木子1，2，劉群1，2，劉晶1，2
（1.中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，北京海淀100193；2.農(nóng)業(yè)部動(dòng)物流行病學(xué)與人畜共患病重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室農(nóng)業(yè)部國(guó)家動(dòng)物寄生原蟲(chóng)實(shí)驗(yàn)室，北京海淀100193）

摘要：小鼠是研究新孢子蟲(chóng)的動(dòng)物模型。通過(guò)小鼠毒力試驗(yàn)，檢測(cè)3株新孢子蟲(chóng)（Nc-1，Nc-LIV和Nc-BJ）對(duì)BALB/ c小鼠的致病力差異；同時(shí)研究了低劑量Nc-LIV株（1×106）感染后，新孢子蟲(chóng)在小鼠的心、肝、脾、肺、腎、腦和后肢肌肉中的分布情況及其在血清中抗體的動(dòng)態(tài)變化規(guī)律。結(jié)果顯示，Nc-LIV對(duì)BALB/c小鼠的毒力最強(qiáng)，Nc-BJ其次，Nc-1最弱。小鼠血清中新孢子蟲(chóng)抗體在感染后4 d出現(xiàn)至第32天達(dá)到峰值。感染后第8天在腦組織中可檢測(cè)到新孢子蟲(chóng)特異性基因Nc-5，在第32天達(dá)到峰值后下降；其他組織中則分布很少。通過(guò)觀察新孢子蟲(chóng)Nc-LIV在小鼠體內(nèi)各器官組織動(dòng)態(tài)分布的規(guī)律，為進(jìn)一步建立小鼠感染新孢子蟲(chóng)的動(dòng)物模型，研究新孢子蟲(chóng)病奠定了基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：新孢子蟲(chóng)；毒力試驗(yàn)；組織分布；腦荷蟲(chóng)量

高鴻博（1994-），女，本科生，從事動(dòng)物醫(yī)學(xué)專業(yè)學(xué)習(xí)，E-mail：gaohongbo1994@163.com

注：高鴻博與龍煙朦對(duì)本文具有同等貢獻(xiàn)

新孢子蟲(chóng)（Neospora caninum）隸屬于原生動(dòng)物門(mén)（Protozoa），頂復(fù)亞門(mén)（Apicomplexa），孢子蟲(chóng)綱（Sporozoea），真球蟲(chóng)目（Eumeriina），肉孢子蟲(chóng)科（Sarcocystidae），新孢子蟲(chóng)屬（Neospora）。新孢子蟲(chóng)主要寄生在中樞神經(jīng)系統(tǒng)、肌肉細(xì)胞、肝、腦及多種有核細(xì)胞內(nèi)，引起孕畜的流產(chǎn)和死胎，以及新生兒的運(yùn)動(dòng)神經(jīng)系統(tǒng)障礙[1]。盡管新孢子蟲(chóng)分布廣泛、中間宿主眾多，但在全世界范圍分離到的蟲(chóng)株非常有限。自1988年Dubey等從先天性腦脊髓炎的犬腦組織中分離第一株新孢子蟲(chóng)并命名為Nc-1株后[2]，研究人員先后從不同的宿主體內(nèi)分離到新孢子蟲(chóng)蟲(chóng)株約80株[3]。其中Nc-LIV分離自英國(guó)先天感染的幼犬神經(jīng)組織[4]。Nc-BJ株則于2011年分離自北京地區(qū)新孢子蟲(chóng)抗體陽(yáng)性牛血液淋巴細(xì)胞[5]。我國(guó)奶牛新孢子蟲(chóng)感染情況普遍，有流產(chǎn)史的母牛與新孢子蟲(chóng)血清抗體陽(yáng)性密切相關(guān)，說(shuō)明新孢子蟲(chóng)感染是奶牛流產(chǎn)的重要原因[6-7]。2007年對(duì)流產(chǎn)奶牛進(jìn)行診斷時(shí)發(fā)現(xiàn)流產(chǎn)胎牛的腦組織中存在新孢子蟲(chóng)，從病原學(xué)角度證實(shí)了新孢子蟲(chóng)是引起奶牛流產(chǎn)的原因[8]。

牛是新孢子蟲(chóng)的重要中間宿主，但對(duì)牛進(jìn)行新孢子蟲(chóng)人工感染比較困難且代價(jià)昂貴。小鼠是研究新孢子蟲(chóng)的常見(jiàn)實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ停渲心承┙幌敌∈?，如BALB/c小鼠對(duì)新孢子蟲(chóng)易感性很強(qiáng)[9]。鄧沖等人成功建立了新孢子蟲(chóng)病BALB/c小鼠的感染模型，報(bào)道了新孢子蟲(chóng)Nc-1蟲(chóng)株的生物學(xué)特性、致病情況，并對(duì)其在小鼠各組織器官的分布情況進(jìn)行了常規(guī)PCR檢測(cè)[10]。本研究以BALB/c小鼠為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，通過(guò)人工感染新孢子蟲(chóng)標(biāo)準(zhǔn)株Nc-1、Nc-LIV、北京分離株Nc-BJ研究不同來(lái)源的新孢子蟲(chóng)分離株對(duì)小鼠的致病性差異；檢測(cè)Nc-LIV株在小鼠體內(nèi)動(dòng)態(tài)分布情況，為進(jìn)一步研究大型動(dòng)物的新孢子蟲(chóng)病提供參考資料。

1　材料與方法

1.1試驗(yàn)材料新孢子蟲(chóng)標(biāo)準(zhǔn)株Nc-1，Nc-LIV和北京株Nc-BJ，由中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，農(nóng)業(yè)部國(guó)家動(dòng)物寄生原蟲(chóng)實(shí)驗(yàn)室傳代并保存；6周齡近交系BALB/c雌性小鼠，購(gòu)自北京華阜康生物科技股份有限公司；羊抗鼠IgG-HRP抗體，購(gòu)自北京欣經(jīng)科生物技術(shù)有限公司；全血組織細(xì)胞基因組DNA快速提取試劑盒，購(gòu)自北京艾德萊生物技術(shù)公司；PCR相關(guān)試劑，購(gòu)自北京全式金生物技術(shù)有限公司；實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)試劑，購(gòu)自寶生物工程（大連）有限公司。

1.2試驗(yàn)方法

1.2.1毒力試驗(yàn)30只BALB/c小鼠隨機(jī)等分成3組。每組分別腹腔接種Nc-1，Nc-LIV或Nc-BJ株5×106個(gè)速殖子/只，連續(xù)觀察90天并記錄小鼠的臨床癥狀、體重變化和死亡時(shí)間。毒力試驗(yàn)重復(fù)一次，綜合兩次試驗(yàn)的結(jié)果繪制存活曲線。

1.2.2Nc-LIV在小鼠體內(nèi)動(dòng)態(tài)分布

1.2.2.1試驗(yàn)設(shè)計(jì)將35只BALB/c小鼠分成兩組，試驗(yàn)組28只，對(duì)照組7只。試驗(yàn)組腹腔接種Nc-LIV株1×106個(gè)速殖子/只，對(duì)照組腹腔注射300 μL PBS/只。接種后每天觀察并記錄小鼠的臨床癥狀、體重變化和死亡時(shí)間。分別于接種后第1、2、4、8、16、32天和第64天，試驗(yàn)組隨機(jī)選取3只小鼠，對(duì)照組選取1只小鼠，分離血清，斷頸處死。無(wú)菌條件下剖檢，采集心、肝、脾、肺、腎、腦和后肢肌肉組織。樣本保存于-80℃待檢。提取腦組織DNA，進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)，計(jì)算小鼠感染新孢子蟲(chóng)的腦荷蟲(chóng)量和動(dòng)態(tài)變化。

1.2.2.2血清新孢子蟲(chóng)抗體檢測(cè)應(yīng)用間接ELISA方法檢測(cè)小鼠血清中抗體水平。收集新鮮釋放的Nc-1速殖子，超聲裂解制備新孢子蟲(chóng)全蟲(chóng)抗原。以全蟲(chóng)抗原100 ng/孔包被，待檢小鼠血清1∶100稀釋，二抗羊抗鼠IgG-HRP 1∶5 000稀釋，測(cè)定OD450nm/630 nm值。

1.2.2.3組織新孢子蟲(chóng)檢測(cè)應(yīng)用全血組織細(xì)胞基因組DNA快速提取試劑盒提取小鼠心、肝、脾、肺、腎、腦和后肢肌肉組織DNA。以小鼠各組織DNA為模板，Np6（5′-CAGTCAACCTACGTCTTCT-3′）和Np21（5′-GTGCGTCCAATCCTGTAAC-3′）為特異性引物，擴(kuò)增新孢子蟲(chóng)特異性基因Nc-5基因。1%瓊脂糖凝膠電泳觀察PCR擴(kuò)增結(jié)果。

1.2.2.4腦組織荷蟲(chóng)量檢測(cè)應(yīng)用實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法擴(kuò)增腦組織中新孢子蟲(chóng)的Nc-5基因和小鼠的18S基因，經(jīng)計(jì)算確定小鼠腦組織荷蟲(chóng)量。Nc-5特異性引物為Np6/Np21；小鼠18S特異性引物上游F：5′-ATTAGATACAGAACCAACCCAC-3′，下游R：5′-TGAATGATCCGTCGCAGAC-3′。根據(jù)Nc-5標(biāo)準(zhǔn)品和腦組織18S DNA標(biāo)準(zhǔn)品繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。每20 μL反應(yīng)體系中包括：2 μL DNA模板，上下游引物各0.8 μL（10 μmol/L），SYBR premix Ex TaqⅡ染料10 μL和ddH2O 6.4 μL。反應(yīng)結(jié)束后分別根據(jù)各濃度目的基因和內(nèi)參基因的Ct值，運(yùn)用7500 software分析擴(kuò)增曲線和標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.3數(shù)據(jù)處理與分析試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS 13.0軟件和GraphPad Prism 5.0處理分析。

2　結(jié)果與分析

2.1毒力試驗(yàn)

2.1.1臨床癥狀及體重變化3個(gè)感染組小鼠臨床癥狀類似。感染前期主要表現(xiàn)為活動(dòng)性下降，被毛蓬亂、拱背蜷縮、全身震顫等。60 d后大部分小鼠神經(jīng)癥狀加重，出現(xiàn)活動(dòng)障礙、后肢僵直、身體重心偏移和原地轉(zhuǎn)圈等癥狀。感染前期各組體重變化無(wú)明顯差異，后期對(duì)照組體重平穩(wěn)上升，試驗(yàn)組體重波動(dòng)大，且個(gè)體差異增大。接種后15 d試驗(yàn)組小鼠體重開(kāi)始下降，第30天后實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組差異明顯，至第71天Nc-LIV組小鼠全部死亡且體重下降最明顯，Nc-BJ組次之，Nc-1組小鼠體重變化幅度最小（圖1）。

2.1.2存活率接種后第4天Nc-LIV組小鼠開(kāi)始死亡，在接種后71 d全部死亡；Nc-BJ組小鼠于第6天開(kāi)始死亡；Nc-1組小鼠于第8天開(kāi)始死亡。至接種后88 d，Nc-BJ組存活1只，Nc-1組存活6只（圖2）。

2.2Nc-LIV在小鼠體內(nèi)動(dòng)態(tài)分布

圖1　小鼠感染新孢子蟲(chóng)后體重變化

圖2　小鼠存活曲線

2.2.1臨床癥狀和病理變化小鼠接種Nc-LIV速殖子（1×106個(gè)）后第16天出現(xiàn)被毛凌亂，但精神狀態(tài)良好。第26天至第53天表現(xiàn)精神萎靡、消瘦，出現(xiàn)拱背顫抖、后肢僵直等神經(jīng)癥狀。接種后第8天有肺臟出血和肝臟腫大充血等病理變化；腎臟和心臟也出現(xiàn)充血現(xiàn)象。各采樣點(diǎn)剖檢均未發(fā)現(xiàn)有腹水，后肢肌肉組織表觀正常，未見(jiàn)出血情況。

2.2.2血清抗體水平變化接種后第3天可檢測(cè)到新孢子蟲(chóng)特異性抗體，隨后抗體水平緩慢增加，第8-16天快速增加，于第32天達(dá)到峰值后緩慢下降（圖3）。

圖3　小鼠血清新孢子蟲(chóng)抗體

2.2.3新孢子蟲(chóng)在小鼠組織中分布情況以各取樣點(diǎn)的組織DNA為模板，PCR擴(kuò)增新孢子蟲(chóng)Nc-5特異性基因。在接種后第2、4天的部分組織中檢測(cè)到Nc-5基因。第8天肺臟中檢測(cè)到Nc-5。第32天腦組織中檢測(cè)到Nc-5基因片段，大小為328 bp。其他組織器官中均未檢測(cè)到（圖4）。

圖4　小鼠腦組織Nc- 5擴(kuò)增結(jié)果1～7：Nc-LIV組接種后第1、2、4、8、16、32、64天；8：PBS組接種后第32天；9：陰性對(duì)照；10：陽(yáng)性對(duì)照；M：DNA Marker

2.2.4腦荷蟲(chóng)量檢測(cè)使用絕對(duì)熒光定量PCR檢測(cè)各采樣點(diǎn)腦組織DNA中新孢子蟲(chóng)含量。接種后第4天起腦荷蟲(chóng)量逐步增加；第32天達(dá)峰值，每微克組織中可檢測(cè)到約1 286個(gè)蟲(chóng)體；第32天至第64天，腦荷蟲(chóng)量下降。

圖5　熒光定量PCR檢測(cè)腦組織DNA中荷蟲(chóng)量

3　討論

通常根據(jù)新孢子蟲(chóng)對(duì)小鼠致病力來(lái)判定其毒力強(qiáng)弱。本試驗(yàn)中小鼠腹腔接種3種新孢子蟲(chóng)蟲(chóng)株，連續(xù)觀察90 d，其中Nc-LIV組小鼠最早出現(xiàn)臨床癥狀和發(fā)生死亡，在接種后第71天死亡率100%；Nc-BJ組小鼠死亡率90%；Nc-1組小鼠死亡率僅40%。表明Nc-LIV對(duì)BALB/c小鼠的毒力最強(qiáng)，Nc-BJ次之，Nc-1最弱。本課題組在前期分離Nc-BJ株時(shí)曾對(duì)其毒力

進(jìn)行過(guò)初步研究，發(fā)現(xiàn)小鼠感染Nc-BJ后第6天出現(xiàn)死亡，觀察僅持續(xù)到感染后第32天，死亡率為43%[8]。本研究發(fā)現(xiàn)，小鼠感染Nc-BJ株后死亡趨勢(shì)與之前的研究結(jié)果相似，并通過(guò)延長(zhǎng)觀察時(shí)間及與Nc-1和Nc-LIV株的對(duì)比試驗(yàn)進(jìn)一步完善了新孢子蟲(chóng)對(duì)小鼠的致病性研究。在三株新孢子蟲(chóng)中Nc-LIV的致病性最強(qiáng)，Nc-BJ致病性居中，Nc-1的毒力最弱，可能與Nc-1在細(xì)胞上多次傳代，導(dǎo)致毒力減弱有關(guān)[11]。

新孢子蟲(chóng)Nc-5基因是其特異性基因，被廣泛應(yīng)用于新孢子蟲(chóng)感染的檢測(cè)[12-13]。在Nc-LIV株在小鼠體內(nèi)的動(dòng)態(tài)分布研究中，實(shí)時(shí)熒光定量PCR結(jié)果顯示，接種后第8天，小鼠腦組織DNA中檢測(cè)到新孢子蟲(chóng)Nc-5基因，說(shuō)明此時(shí)Nc-LIV已突破血腦屏障而侵入腦內(nèi)。腦組織中蟲(chóng)體含量32 d達(dá)到峰值，這與小鼠在接種后第26-53天期間表現(xiàn)出明顯的神經(jīng)癥狀相符，隨后腦荷蟲(chóng)量下降。結(jié)果與同等劑量Nc-BJ株在小鼠腦組織中荷蟲(chóng)量變化趨勢(shì)類似[8]。而常規(guī)PCR只在感染后第32天，檢測(cè)出腦組織的Nc-5基因，其原因可能是由于新孢子蟲(chóng)分布在小鼠組織中的數(shù)量少，常規(guī)PCR法敏感性低所致。其他組織器官中，僅在第8天的肺組織DNA中檢測(cè)到Nc-5基因，這與新孢子蟲(chóng)的嗜組織性[14]，即對(duì)血管豐富的肺臟偏愛(ài)有關(guān)。

4　結(jié)論

通過(guò)對(duì)不同地區(qū)不同來(lái)源的3株新孢子蟲(chóng)分離株對(duì)小鼠的致病力研究發(fā)現(xiàn)，Nc-LIV株對(duì)BALB/c小鼠的毒力最強(qiáng)，Nc-BJ株次之，Nc-1株最弱。初步了解了Nc-LIV在小鼠體內(nèi)組織器官中的動(dòng)態(tài)分布規(guī)律，為新孢子蟲(chóng)病病原的進(jìn)一步研究奠定了基礎(chǔ)。

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Virulenceand Dynamic Distribution of Neospora caninum in Mice

LONG Yan-meng1，GAO Hong-bo1，MA Lei1，2，LI Mu-zi1，2，LIU Qun1，2，LIU Jing1，2
（1.College of Veterinary Medicine，China Agricultural University，Beijing 100193，China；2.China Key Laboratory of Animal
Epidemiology and Zoonosis，Ministry of Agriculture，and National Animal Protozoa Laboratory，Beijing 100193，China）

Abstract：Mice are animal models in Neospora caninum research.Virulence of three strains of N.caninum（Nc-1，Nc-LIV and Nc-BJ）was detected by virulence assay.Parasites distribution in tissues and dynamic variation of antibody were investigated when mice were infected with low doses of Nc-LIV（1×106）.Nc-LIV was the strongest virulence strain for BALB/c mice，Nc-BJ was the moderate virulence strain and Nc-1 was the weakest one.Serum antibodies to Neospora appeared in 4 days after infection and reached the peak in 32 days.N.caninum specific genes Nc-5 could be detected in the brains after 8 days and at the peak in 32 days after infection.Spread of tachyzoites of Nc-LIV among the tissues were traced in BALB/c mice for further establishment of an animal model and laid the foundation of the N.caninum research.

Key words：Neospora caninum；virulence assay；tissues distribution；parasitic burden in the brain

Corresponding author：LIU Jing

通訊作者：劉晶，E-mail：liujingvet@cau.edu.cn

作者簡(jiǎn)介：龍煙朦（1993-），女，本科生，從事動(dòng)物醫(yī)學(xué)專業(yè)學(xué)習(xí)，E-mail：long_yanmeng@126.com

基金項(xiàng)目：國(guó)家自然科學(xué)基金（31302075）；國(guó)家教育部博士點(diǎn)基金（20130008120010）

收稿日期：2015-08-26

中圖分類號(hào)：S852.72+3

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號(hào)：0529- 6005（2016）01- 0003- 03