葛邦國　宋　燁

（中華全國供銷合作總社濟南果品研究院，山東濟南250014）

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蘋果渣中蘋果多酚柱層析分離工藝研究

葛邦國宋燁

（中華全國供銷合作總社濟南果品研究院，山東濟南250014）

摘要：本文研究了大孔吸附樹脂對蘋果渣中蘋果多酚純化和Sephadex凝膠對蘋果多酚的精制工藝參數，選定AB-8為純化用大孔吸附樹脂，采用70％乙醇作為解吸劑；Sephadex凝膠精制后的蘋果多酚，經冷凍干燥，得到蘋果多酚粉末。蘋果多酚得率為0.12％，蘋果多酚的純度由初步純化的15.5％提高到75.6％。

關鍵詞：蘋果多酚；大孔樹脂；純化；精制

植物多酚的提取純化工藝，一般采用乙醇提取，真空濃縮，然后樹脂吸附進行初步純化，但這種方法能耗高，過程長，產品純度不高[1,2]。隨著功能成分提取技術的發(fā)展，多酚的提取純化更多的采用柱層析技術，使用大孔吸附樹脂和Sephadex凝膠，以提高產品純度[3,4]。近年來，大孔吸附樹脂在植物功能性成分提取純化中的研究和應用日漸增多，顯示出了獨特的吸附和洗脫特性，這一技術既可提高樣品供試液純度，也可減少有毒有機溶劑的使用[5-7]。Sephadex凝膠屬于分子篩凝膠，具有分子篩特性，可按分子量大小分離物質，適合于不同類型有機物的分離，性質穩(wěn)定，易實施循環(huán)操作。本文研究了大孔吸附樹脂對蘋果渣中蘋果多酚純化和Sephadex凝膠對蘋果多酚的精制工藝參數。

1　材料與方法

1.1材料與試劑

實驗所用材料為經微波法或超臨界二氧化碳提取得到的蘋果多酚粗提物。大孔吸附樹脂X-5、AB-8、NKA9、HD400，購于天津南開大學化工廠；Folin-Ciocalteu試劑，購于Sigma公司；綠原酸、(+)-兒茶素、(-)-表兒茶素、p-香豆酸、槲皮素，咖啡酸、香草醛、阿魏酸、根皮苷、沒食子酸等物質，均購自于Sigma公司；其它試劑均為分析純。

1.2儀器與設備

島津UVmini-1240紫外/可見分光光度計（日本）；RE1002旋轉蒸發(fā)儀，常州市國立試驗設備研究所（中國）；2BV循環(huán)水式多用真空泵，北京融合立盛科技有限公司（中國）；HZX-HA型水浴恒溫振蕩器，金壇市精達儀器制造有限公司（中國）；LC2200S分析天平（德國）；TDL-5-A高速離心機，上海安亭儀器廠（中國）；層析柱（1.6cm×40cm)），無錫兆陽化工裝備有限公司（中國）。

1.3蘋果多酚的測定

選擇Folin酚法測定蘋果多酚。酚類物質的含量采用高效液相色譜測定，標樣為綠原酸、(+)-兒茶素、(-)-表兒茶素、p-香豆酸、槲皮素，咖啡酸、香草醛、阿魏酸、根皮苷、沒食子酸。色譜分析條件：Kromasil C18色譜柱（150mm×4.6mm，5μm）；流動相為乙腈（A）和水（B）；柱溫30℃；進樣量10μL；流速1.0mL/min。紫外檢測器檢測，波長280nm。

表1　梯度洗脫條件

1.4大孔吸附樹脂的預處理[8]

選取的四種大孔吸附樹脂分別用95％乙醇室溫浸泡24h后，裝柱，首先用95％乙醇洗滌，至流出溶液加水不呈白色混濁，再用蒸餾水脫除乙醇。接著用2BV的5％ HCl淋洗并浸泡4h，水洗至中性；再用2BV的2％NaOH溶液淋洗并浸泡4h，水洗至中性。

1.5Sephadex G25預處理

SephadexG25在使用之前將凝膠溶脹于層析溶劑中至少3h。先用2～3個柱體積的洗脫液進行清洗。凝膠柱的填裝在保證膠粒不變形的前提下，應在盡可能高的壓力下裝柱。將處理好的凝膠在燒杯內用1倍體積的洗脫液攪拌成懸浮液，自柱頂部沿管內壁緩緩加入柱。

1.6測定指標及方法

樹脂的吸附量（mg/g）及解吸率（％）計算公式如下：

2　結果與分析

2.1大孔吸附樹脂靜態(tài)吸附解吸試驗

2.1.1大孔樹脂的篩選

準確稱取已處理好的AB-8、X-5、HD400、NKA四種樹脂各2.0g于150mL三角瓶中，分別加入40mL 0.866mg/mL蘋果多酚提取液，置于水浴恒溫振蕩器上，40℃、150r/min振蕩，在1、2、3、4、5h設定時間取樣測定，以吸附量、時間作圖。

由圖1可知，HD400、NKA和X-5起始吸附能力較差，隨著時間的延長，吸附量緩慢上升；AB-8起始吸附量較大，此后吸附量增加較快，在4～5h內即可基本達到平衡。從圖中可看出，AB-8對蘋果多酚的吸附量和吸附速率都高于X-5、HD400和NKA。所以最終選定AB-8為純化用大孔吸附樹脂。

圖1　不同樹脂對蘋果多酚的吸附效果

2.1.2不同濃度乙醇對解吸效果的影響

對于蘋果多酚的解吸，從解吸能力、易于回收、節(jié)能、廉價和毒性角度來選擇適宜的解吸劑，綜合考慮，以醇類較佳。本研究選用乙醇作為解吸劑，通過靜態(tài)實驗來確定乙醇濃度。取充分吸附蘋果多酚后的AB-8樹脂1.0g，分別準確加入30％、50％、70％、80％、90％乙醇各25mL，室溫靜置24h，過濾，檢測濾液中蘋果多酚的含量，根據濾液中多酚含量計算乙醇解吸能力，比較乙醇濃度對蘋果多酚解吸效果的影響，結果見表2。由表2可以看出，隨著乙醇濃度的增加，樹脂的吸附能力越大，當乙醇濃度大于70％時，樹脂吸附能力增幅不是很大，同時乙醇濃度越大，乙醇越容易蒸發(fā)，有安全隱患，因此本實驗選用70％乙醇作為解吸劑，此時解吸率為85.68％。

表2　不同乙醇濃度對蘋果多酚的解析效果

2.1.3溫度對吸附性能的影響

準確稱取經預處理的AB-8樹脂5.0g，置于150mL三角瓶中，加入濃度為0.866mg/mL的蘋果渣提取液50mL，靜置4h，吸附溫度分別設定為20℃、30℃、40℃和50℃，結果見圖2。由圖2可以看出，溫度對吸附性能的影響很小，溫度30℃時吸附能力只比20℃提高5％，考慮到節(jié)能，故在室溫下進行吸附即可。

圖2　溫度對吸附效果的影響

2.2AB-8大孔吸附樹脂動態(tài)純化蘋果多酚工藝

稱取2.0g預處理好的AB-8樹脂，裝入2.0×40cm的玻璃層析柱中。將0.866mg/mL濃度的樣品放入樹脂，分段收集樣品，當流出液濃度達上樣的1/5時，可認為蘋果多酚已收集結束，停止進樣，計算吸附量。

2.2.1粗提液濃度對樹脂吸附能力的影響

粗提的蘋果多酚，添加不同質量的蒸餾水，進行動態(tài)樹脂吸附實驗。若粗提液濃度小于0.5mg/mL，試驗過程中，樹脂容易泄漏，部分樹脂未能完成吸收，從而影響樹脂的吸附能力；濃度大于1.5mg/mL，溶液出現絮狀沉淀，使樹脂堵塞，吸附能力下降。由圖3可以看出，當濃度在1.1mg/mL時，樹脂的吸附能力最大。故上樣濃度控制在1.0mg/mL～1.3mg/mL范圍內。

圖3　上樣濃度對吸附量的影響

2.2.2吸附流速對吸附能力的影響

研究不同吸附流速對樹脂吸附能力的影響，選擇流量分別為1、2、3、4BV/h，試驗結果見圖4。由圖4可知，在1BV/h～4BV/h內，隨著流速的增加，每毫升樹脂對蘋果多酚的吸附能力下降，但2BV/h較3BV/h、4BV/h下降速度慢，綜合考慮，本試驗選擇流速為2BV/h。

圖4　流速對吸附量的影響

2.2.3粗提液pH對樹脂吸附能力的影響

將粗提液用10％HCl和10％NaOH調節(jié)成不同pH值的溶液，進行動態(tài)吸附實驗，結果見圖5。由于多酚呈弱酸性，所以要達到較好的效果必須在弱酸性條件下進行吸附。當粗提液pH=4.80時，AB-8樹脂對蘋果多酚的吸附能力最強。在較高的pH（pH>4.80）條件下，酚羥基由于解吸而增加了其在水中的溶解度，從而降低了樹脂在水溶液中對多酚的吸附能力。而當pH<4.80時，部分黃酮類物質改變性質，樹脂吸附能力下降。因此，pH為4.80時，樹脂吸附能力較強。

圖5　pH對解吸效果的影響

2.2.4不同解吸速度對洗脫效果的影響

圖6　蘋果多酚解析曲線

選擇濃度為1.1mg/mL的粗提液，采用2BV/h的流速進行吸附，以5BV去離子水洗滌，然后用70％乙醇進行洗脫，解析流速采用1BV/h、2BV/h，分時段測定洗脫液中多酚的含量，制定解吸效果的曲線，結果見圖6。

解吸流速大小影響解吸效果，流速過快，解吸拖尾嚴重，洗脫帶寬，洗脫不徹底，效果差；流速過慢，解吸時間長，蘋果多酚易損失。常用的解吸流速是吸附流速的1/3～1/2，由圖6可以看出，不同流速對解吸能力是有一定的影響，以1BV/h的流速進行洗脫得到的峰形集中，2BV/h的流速洗脫則略有拖尾現象，故采用1BV/h的解吸流速，即為吸附流速的1/2，實驗結果表明解吸效果較為理想。經過計算所得的蘋果多酚制品的純度由純化前的6.8％提高到15.5％。

2.3蘋果多酚的精制

經大孔吸附樹脂純化后的樣品仍含有較多糖類。采用SephadexG25可以對蘋果多酚進行進一步精制。SephadexG25屬于分子篩凝膠，具有分子篩特性，可按分子量大小分離物質，適合于不同類型有機物的分離，并且性質穩(wěn)定，易實施循環(huán)操作。

樣液上柱后用蒸餾水洗脫，流速1mL/min，每8min收集一次洗脫液，1～10為水洗液，10管后采用80％的乙醇以0.5mL/min的流速進行洗脫，每管按照0.5mL/min的量收集洗脫液，然后逐管分別進行多酚的測定，結果如圖7所示。從圖7可以看到，比較明顯的峰有6個，其中最早出現的峰多酚含量較少，自25管之后多酚的含量明顯增加，25～50管之間為多酚分布的高峰區(qū)間，合并25管之后的洗脫液進行組成測定。

圖7　SesphedexG25精制蘋果多酚的結果

2.4蘋果多酚的組成研究

將10種標準品，綠原酸、兒茶素、表兒茶素、沒食子酸、根皮苷、槲皮素、阿魏酸、對香豆酸、咖啡酸各取少量，用甲醇溶解后，混合稀釋至合適的濃度，按1.7中所述的色譜條件，以保留時間為橫坐標，吸光度為縱坐標，做圖，標準品圖譜結果見圖8。

在蘋果渣中共檢測出5種多酚物質，分別是綠原酸、表兒茶素、兒茶素、對香豆酸和根皮苷，見圖9（1、表兒茶素，2、綠原酸，3、兒茶素，4、對香豆酸，5、根皮苷）。從蘋果多酚物質組成及比例上看，綠原酸含量最高，約占多酚物質的85％，其它如兒茶素、對香豆酸、根皮苷等含量較低。精制后的蘋果多酚，經冷凍干燥，得到產品蘋果多酚粉末。經過計算所得蘋果多酚得率為0.12％，蘋果多酚的含量由初步純化的15.5％提高到75.6％。

圖8　標準品圖譜

圖9　蘋果多酚圖譜

3　結論

本研究選用AB-8大孔吸附樹脂進行蘋果多酚的柱層析純化，采用2BV/h吸附流速，1BV/h的解吸流速，可將蘋果多酚較好的洗脫下來。大孔樹脂純化后的蘋果多酚經Sephadex精制得到純度較高的多酚產品。此時，蘋果多酚總酚得率為0.12％，含量為75.60％。

參考文獻：

[1]石碧,狄瑩.植物多酚[M].北京:科學出版社,2000:8-21.

[2]任靜.蘋果多酚類物質的提取分離及活性研究[D].西安:西北大學,2005.

[3]黃文強.吸附分離材料[M].北京:化學工業(yè)出版社,2005.

[4]姜慧,籍保平,李博,等.影響蘋果多酚分離提純的因素[J].食品科學,2004,(25):6.

[5]郭娟.蘋果渣中蘋果多酚的提取、純化及功效研究[D].鄭州:河南農業(yè)大學,2006.

[6]戚向陽,陳維軍,楊爾寧.蘋果多酚提取物的組成及其抗氧化性能的研究[J].中國糧油學報,2003,18(5):70-72.

[7]錢庭寶.吸附樹脂及其應用[M].北京:化學工業(yè)出版社,1900, (10):433-436.

[8]袁懷波,趙國華.利用大孔吸附樹脂純化葛根異黃酮的研究[J].食品與發(fā)酵工業(yè),2003,29(2):62-65.

The Research of Column Chromatography Separation of Apple Polyphenols in Apple Rvesidue

GE Bang-guo SONGYe
(Jinan Fruit Research Institute All China Federation ofSupply&MarketingCo-operatives,Jinan 250014,China)

Abstract:Research the purification of apple polyphenols from apple residue by macroporous adsorption resin,sephadex purification process parameters of apple polyphenols,select AB-8 for purification with macroporous adsorption resin,use 70％ethanol as a desorption agent.Apple polyphenols after purification by Sephadex,after freeze drying,get apple polyphenol powder,yield is 0.12％,content increased from 15.5％to 75.6％。

Key words:Apple polyphenols;macroporous resin;purification;refined

作者簡介：葛邦國（1978—），男，碩士，高級工程師，研究方向為果蔬精深加工

基金項目：國家農業(yè)科技成果轉化資金項目（2010GB24420688）

收稿日期：2015-09-01

中圖分類號：TS255.3

文獻標志碼：A

文章編號：1008-1038(2016)02-0020-05