韓卓然，孫敬鋒

( 天津農(nóng)學院 水產(chǎn)學院，天津市水產(chǎn)生態(tài)及養(yǎng)殖重點實驗室，天津 300384 )

水產(chǎn)動物益生菌的篩選及應用

韓卓然，孫敬鋒

( 天津農(nóng)學院 水產(chǎn)學院，天津市水產(chǎn)生態(tài)及養(yǎng)殖重點實驗室，天津 300384 )

水產(chǎn)動物；益生菌；篩選；應用

隨著水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展和養(yǎng)殖強度的增加，水產(chǎn)動物病害爆發(fā)頻繁。傳統(tǒng)的抗生素藥物雖然對治療疾病有積極效用，但長期使用會產(chǎn)生巨大的負面效應：病原菌產(chǎn)生耐藥性，效力下降[1]；藥物殘留干擾水產(chǎn)動物腸道內(nèi)有益微生物菌群的生長和繁殖，影響水產(chǎn)動物的健康；殘留在水體中的抗生素破壞養(yǎng)殖生態(tài)環(huán)境，水產(chǎn)品質(zhì)量下降。近年來，我國水產(chǎn)品因藥物殘留而出口受阻的事件屢見不鮮，給我國水產(chǎn)業(yè)造成巨大損失。

1974年P(guān)arker[2]首創(chuàng)益生菌一詞，最早提出益生菌有利于腸道微生態(tài)平衡。目前普遍認為，益生菌的作用主要是改善動物新陳代謝、提高營養(yǎng)物質(zhì)吸收利用率和免疫力、減少環(huán)境污染等[3]。益生菌因具有無毒、無殘留、無抗藥性、無污染等特點，逐漸被廣泛應用。

1 益生菌的作用機理

1.1 競爭抑制

益生菌菌群與病原菌競爭黏膜附著位點和營養(yǎng)方式，降低病原菌活性，阻止病原菌黏附，使養(yǎng)殖動物獲得穩(wěn)定適宜的微生物環(huán)境[4]。

1.1.1 競爭黏附位點

益生菌黏附定殖于宿主體內(nèi)是發(fā)揮作用的前提。益生菌進入機體后，最先發(fā)揮的作用就是與病原菌競爭附著位點[5]。有研究表明，黏附力強的植物乳酸菌ST-Ⅲ(LactobacillusplantarumCGMCC)與致病菌共同作用于腸細胞時，通過競爭性占位效應形成生物膜，抑制致病菌的黏附和侵入，保護了細胞膜的完整性，使宿主細胞免受損傷[6]。益生菌和病原菌的黏附機制相似，益生菌分泌一種以蛋白為主要成分的黏附素，介導其黏附至腸黏膜上皮細胞，所以益生菌易于與病原菌競爭附著位點。但宿主體內(nèi)毒力因子過多，機體產(chǎn)生的免疫應答反應過強，益生菌就會無法黏附。

1.1.2 競爭營養(yǎng)物質(zhì)

益生菌與異養(yǎng)型細菌爭奪腸道內(nèi)有限的底物，使病原菌因缺乏營養(yǎng)而在競爭中不占優(yōu)勢。研究證明，熒光假單胞菌(Pseudomonasfluorescens)與殺鮭氣單胞菌(Aeromonassalraonicida)競爭游離鐵離子，抑制后者的增殖[7]。大部分微生物生長均需要鐵離子[8]，所以益生菌對鐵離子的競爭力可作為衡量其效果的標準之一。Neeser等[9]還研究證明，益生菌在腸內(nèi)與致病菌爭奪碳水化合物。好氧的芽孢桿菌(Bacillus)在腸道內(nèi)可消耗分子氧，制造厭氧環(huán)境，抑制好氧的致病菌，利于厭氧的乳酸菌和雙歧桿菌(Bifidobacterium)的生存與增殖[10]。

1.2 分泌抑制物

益生菌可以釋放細菌素、親鐵元素、溶菌酶、蛋白酶、過氧化氫等多種物質(zhì)，這些物質(zhì)都可不同程度地抑制各種革蘭氏陰性菌和革蘭氏陽性菌。已證實乳酸菌產(chǎn)生的抑菌素可抑制其他病原菌[11]。黃滄海等[12]研究發(fā)現(xiàn)，乳酸桿菌代謝產(chǎn)物中的乳酸不是唯一起抑菌或滅菌作用的代謝物；乳酸桿菌的菌體及其代謝產(chǎn)物對大腸桿菌(Escherichiacoli)具有一定的協(xié)同抑制作用，且抑菌效果更好、時間更持久。李海兵[13]從健康對蝦腸道內(nèi)篩選出了需鈉弧菌(Vibrionatriegens)和溶藻弧菌(V.alginolyticus)。體外拮抗試驗表明，它們對哈維氏弧菌(V.harveyi)、鰻弧菌(V.anguillarum)、金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)、副溶血弧菌(V.parahaemolyticus)等幾種海洋水產(chǎn)動物的主要致病菌均有不同的抑制作用。抑制反應動力學試驗表明，這些菌的代謝產(chǎn)物中含有抑菌活性物質(zhì)。單曉楓[14]從鯉魚(Cyprinuscarpio)腸黏膜篩選出了有抑菌作用的糞腸球菌(Enterococcusfaecalis)，培養(yǎng)物上清液中含有機酸和對胰蛋白酶敏感的某種抑菌物質(zhì)。

1.3 提供營養(yǎng)促進機體消化吸收

益生菌可以產(chǎn)生蛋白酶、淀粉酶、脂肪酶等胞外酶，它們不僅可以提高消化速率，還可以提供維生素、氨基酸、脂肪酸這類生長因子[15]。Bairagi等[16]報道，分離自鯰魚(Silurusasotus)消化道的菌株可產(chǎn)生胞外淀粉酶和蛋白酶，促進了消化，提高了飼料的利用率。Fang等[17]研究表明，白鱘(Psephuyrusgladius)喂食含乳酸菌、納豆桿菌(B.natto)等益生菌的飼料后，胃中酸性蛋白酶及堿性蛋白酶的活性明顯提高。但應注意的是，不同屬的益生菌分泌的消化酶種類和數(shù)量不同，產(chǎn)淀粉酶的細菌適用于草食性魚類，而產(chǎn)脂肪酶能力強的益生菌適于肉食性魚類。所以，應根據(jù)水產(chǎn)動物種類選擇合適的益生菌[18]。

腸道是吸收營養(yǎng)的重要部位，益生菌可以改變腸黏膜結(jié)構(gòu)，增加營養(yǎng)物質(zhì)的吸收利用率，還可以調(diào)節(jié)腸道內(nèi)pH值，影響腸道內(nèi)消化酶活性，提高魚類消化能力。Fang等[17]報道，匙吻鱘(Polyodonspathula)飼喂益生菌后，前腸腸壁和肌肉層厚度增加，前腸、中腸褶皺明顯增多，消化吸收率明顯提高。丁酸梭菌(Clostridiumbutyricum)使腸道絨毛高度以及腸道上皮細胞微絨毛高度顯著增加，腸吸收面積增大，吸收效率提高[19]。益生菌可以增加腸道內(nèi)短鏈脂肪酸的含有量，且短鏈脂肪酸除了可以促進腸蠕動，降低食糜對機體的損傷外，還可以降低腸道內(nèi)的pH值[19-20]。梅景良等[21]提取了黑鯛(Acanthopagrusschlegelii)胃、腸、肝胰臟內(nèi)的酶，發(fā)現(xiàn)只有在一定的pH內(nèi)酶才具有活性。

1.4 增強非特異性免疫力

益生菌不僅可以刺激胸腺和脾等免疫器官發(fā)育，激發(fā)機體體液和細胞免疫[22]，還可以增強水產(chǎn)動物非特異性免疫力。幼魚、蝦和其他無脊椎動物的免疫系統(tǒng)發(fā)育不及成體，主要依賴非特異性免疫反應。

1.4.1 提高酶活力

溶菌酶存在于魚體表黏液、血漿和肝臟中，可破壞病原菌細胞壁，這使魚體表黏液成為保護魚類的天然屏障。Taoka等[23]用含乳酸桿菌、枯草芽孢桿菌(B.subtilis)、丁酸梭菌和酵母菌的復合益生菌飼喂牙鲆(Paralichthysolivaceus)，牙鲆體表黏液和血漿中的溶菌酶活性及血漿蛋白含量均有所提高。孟小亮[24]給黃顙魚(Pelteobagrusfulvidraco)投喂地衣芽抱桿菌(B.licheniformis)后，黃顙魚血清內(nèi)的白細胞吞噬活性和溶菌酶活性明顯提高、谷丙轉(zhuǎn)氨酶活性降低，而總蛋白含量有所增加。結(jié)果表明，應用地衣芽抱桿菌增強了黃顙魚的非特異性免疫力，也在一定程度上改善了肝臟功能。

1.4.2 提高腸道黏膜屏障功能

腸道黏膜屏障包括微生物屏障、化學屏障、免疫屏障和機械屏障，其中機械屏障最為重要。機械屏障由腸上皮細胞和上皮細胞分泌的黏液組成，杯狀細胞分泌黏蛋白遍布整個腸道，形成一層黏液層。黏液層能夠保護腸道上皮細胞免受病原菌侵襲，成了腸道黏膜屏障的第一道防線。益生菌可以增加黏蛋白的分泌量，強化腸道黏膜屏障的防御能力?；瘜W屏障由腸道中的胃酸、溶菌酶、膽汁等生物因子構(gòu)成。凡納濱對蝦(Litopenaeusvannamei) 攝食添加益生菌的飼料時，腸道蛋白酶、淀粉酶活性增高，酶活性與生長速度具一定相關(guān)性[25]。生物屏障由腸道內(nèi)菌群與腸道黏膜結(jié)合或黏附形成，益生菌可以增殖有益菌，抑制有害菌，使腸道菌群保持穩(wěn)定。免疫屏障是免疫細胞、免疫分子、免疫組織和免疫器官構(gòu)成的生理性屏障，具有防御病原微生物感染的作用。

1.4.3 參與其他免疫調(diào)控

益生菌在腸道中還有其他免疫調(diào)控效應，包括增強樹突細胞和T細胞免疫功能，阻止致炎性細胞因子的合成及增強自然殺傷細胞的作用[26]、分泌抑菌因子及使上皮細胞緊密連接等。

2 益生菌的篩選

盡管有陸生動物益生菌用于水產(chǎn)養(yǎng)殖的報道，但從宿主本身篩選出的土著微生物可以很好地適應環(huán)境，更高效的抑制病原菌[27]。而那些非分離自魚類消化道的益生菌株，往往不能穩(wěn)定地定殖在魚類消化道中。除了考慮益生菌在腸道內(nèi)定殖以及定殖的時間外，還應注意其耐酸、耐鹽、耐熱等特性，這些因素均會影響益生菌的活性及作用效果。所以，篩選的益生菌應具有如下特點:(1)在低pH值和膽汁中可以存活，可在腸內(nèi)定殖，競爭優(yōu)勢強；(2)易于獲得，在體內(nèi)易繁殖，體外易培養(yǎng)，不與病原菌雜交；(3)產(chǎn)生的抑菌物質(zhì)對機體本身沒有危害；(4)能夠提高機體免疫力；(5)經(jīng)高熱加工后，益生菌活性好，穩(wěn)定性高；(6)不帶耐藥因子或所含耐藥因子少。根據(jù)上述特點，為保證其應用的安全性及其良好效果，目前篩選益生菌時普遍遵循以下過程。

2.1 候選菌株的獲得

篩選優(yōu)良菌株是使益生菌發(fā)揮良好作用的基礎(chǔ)，在篩選過程中主要考慮合適的培養(yǎng)基、培養(yǎng)條件及盡可能從腸道中獲得更多的菌株。所以獲得大量候選菌株是一項十分繁重的任務。可從幼魚和甲殼類動物消化道中分離得到固有微生物，黏附在上皮細胞的益生菌；再從黏附于黏液上的微生物中或消化道短暫定居的微生物中分離出來[28]。

2.2 益生菌的篩選

從大量候選菌株中篩選出益生菌菌種是至關(guān)重要的環(huán)節(jié)。以對病原菌的拮抗作用，對酸、膽鹽和熱的耐受性，以及在腸道中的黏附能力等為篩選指標，篩選出目標菌株。

2.2.1 體外拮抗試驗

動物腸道內(nèi)的固有菌群對外來菌群有顯著的拮抗作用。體外拮抗試驗是篩選益生菌的主要方法，絕大多數(shù)益生菌的篩選都是以抑制特定病原菌為目的，即在固體培養(yǎng)基上根據(jù)抑制物和含鐵細胞的產(chǎn)生或?qū)︷B(yǎng)分的競爭，篩選出益生菌[29]。目前研究者應用不同的方法進行體外拮抗試驗。張玲[30]用十字交叉法，以哈維氏弧菌和副溶血弧菌作為指示菌，利用體外拮抗試驗篩選出了嗜鹽單胞菌屬(Halomonas)；張棋[31]利用牛津杯抑菌試驗進行復篩；王福強[32]以弧菌為指示菌，先后運用了點種法、上清液法和共培養(yǎng)法進行抑菌試驗；李海兵[13]采用瓊脂擴散法從健康中國明對蝦(Fenneropenaeuschinensis)及凡納濱對蝦腸道分離出了對病原弧菌具有拮抗作用的候選菌，并進行了體外拮抗試驗。曾東[33]采用雙層平板法測定分離菌株對病原菌的拮抗作用。

2.2.2 菌株耐受性

2.2.3 菌株的鑒定

傳統(tǒng)的鑒定菌株方法通常是參考細菌鑒定手冊，綜合考慮菌株耐受性，結(jié)合形態(tài)觀察、革蘭氏染色、測定各項生理生化指標和血清學反應等。目前分子生物學方法也普遍應用于細菌鑒定過程中，如指紋圖譜技術(shù)、基因組探針技術(shù)、基因測序、GC含量測定和聚合酶鏈式反應等。近年來，自動微生物鑒定系統(tǒng)因其高效、簡便，準確等特點也逐漸被廣泛應用[36-38]。此外，也有將光學手段應用到益生菌的鑒定工作中，如熒光光譜、紅外光譜技術(shù)等[39-41]。

2.2.4 安全性鑒定

雖然對益生菌安全性并無公認的解釋，但綜合目前對益生菌安全性的研究可以獲得如下的認識:益生菌一定不能是致病菌，且不能產(chǎn)生有害物質(zhì)，菌株不能通過遺傳修飾獲得有害基因或者具有將有害基因或耐藥性因子轉(zhuǎn)移的潛力。所以，試驗篩選出的益生菌還需在活體中檢測，包括向宿主動物體內(nèi)引入候選菌種，監(jiān)測記錄生長狀況、種群分布、殘留量和各種理化指標等，確保該菌種對宿主無害。最后還要確保益生菌在正常條件下可穩(wěn)定增長。

2.3 體內(nèi)作用效果評價

嚴格按照以上步驟篩選出的菌株，具有如下特點：(1)在體外能夠拮抗病原菌；(2)對不良環(huán)境具有耐受性；(3)對宿主沒有致病性。評價這些候選菌株在魚體內(nèi)或水體中的應用效果，是篩選優(yōu)良菌株的最后關(guān)鍵性一步，即從候選菌株中繼續(xù)篩選能夠抵抗病原體攻擊(通常需要攻毒試驗來確定)、具有免疫增強作用或明顯改善水質(zhì)的菌株。Burbank等[42]從虹鱒(Oncorhynchusmykiss)腸道中篩選出了可抑制嗜冷黃桿菌(Flavobacteriumpsychrophilum)的益生菌，體外試驗結(jié)果表明，有16株菌株具有可抑制或降低嗜冷性黃桿菌致病性的潛在能力，被作為候選益生菌。Burbank等[43]從上述16株候選益生菌菌株中挑選10株進行飼喂試驗。結(jié)果表明，有兩株 (C6-6和C6-8)可顯著降低感染了嗜冷黃桿菌的虹鱒的死亡率。這兩株菌株最終可以從胃腸道中再次被分離出來，表明其在腸道內(nèi)定殖的能力。

3 益生菌在水產(chǎn)養(yǎng)殖中的應用

益生菌應用于水產(chǎn)養(yǎng)殖的方式有多種，如注射或浸浴生物體[44-45]、作用于養(yǎng)殖水體和作為飼料添加劑等。目前，將益生菌直接應用于養(yǎng)殖水體和作為飼料添加劑的方法因安全、見效快等優(yōu)勢被普遍使用。

3.1 直接應用于養(yǎng)殖水體

在養(yǎng)殖水體中使用益生菌，可以改善養(yǎng)殖水體的水質(zhì)，促進水產(chǎn)動物生長[46]。趙玉潔等[47]報道，光合細菌能將水域中異養(yǎng)菌分解的殘余有機物產(chǎn)生的有機酸、硫化氫及氨等作為基質(zhì)，合成菌體物質(zhì)并增殖，既參與水質(zhì)凈化，又可被其他動物所捕食。張小平[48]在養(yǎng)殖水體中添加枯草芽孢桿菌SC02及與假單胞菌的復合菌劑，在一定時間內(nèi)能有效去除養(yǎng)殖水體中氨氮、亞硝酸鹽氮和總氮等的含量。張信娣等[49]將紅假單胞菌(Rhodopseudomonasspheroides)應用于三角帆蚌(Hyriopsiscumingii)養(yǎng)殖水體，可穩(wěn)定水體pH，去除含氮化合物，降低化學需氧量，促進水體氮循環(huán)。宋協(xié)法等[50]在養(yǎng)殖半滑舌鰨(Cynoglossussemilaevis)稚魚的水體中添加以芽孢桿菌為主要成分的益生菌干粉后，稚魚的肥滿度和成活率分別提高了5.29%～5.41%和5.10%～5.67%。

益生菌自身繁殖分解了大量的有機物，為有益藻類提供了營養(yǎng)，促進了浮游動物的生長，維持了生態(tài)系統(tǒng)平衡。養(yǎng)殖水體中的殘餌和糞便使大量有機物積聚在池塘淤泥中，大量繁殖異養(yǎng)有害菌，污染水質(zhì)，消耗氧氣。加入益生菌可減少微生物耗氧量，改變水體和底泥的微生物組成和結(jié)構(gòu)。Devaraja等[51]向蝦池中投入了以芽孢桿菌為主的復合微生物制劑后，水體沉積物好養(yǎng)菌的數(shù)量增加，有害弧菌的數(shù)量降低，加速了水體中有機物的降解，改善了養(yǎng)殖生態(tài)環(huán)境。

3.2 水產(chǎn)動物餌料添加劑

益生菌可以改善飼料品質(zhì)，提高飼料營養(yǎng)，增強水產(chǎn)動物對飼料的吸收利用率，降低發(fā)病率，促進生長，提高幼苗成活率，改善水產(chǎn)品品相及口感。Mirbakhsh等[52]在蝦苗培養(yǎng)中使用枯草芽孢桿菌SI02和花域枯草芽孢桿菌IS03(B.vallismortisIS03)，提高了幼苗的生長率及成活率。覃初斌[53]等研究發(fā)現(xiàn)，鼠李糖乳桿菌(L.rhamnosus) CCICC6141和干酪乳桿菌(L.casei) BL23可以刺激斑馬魚(Daniorerio)卵母細胞的成熟，提高繁殖力以及胚胎質(zhì)量。Burbank等[42]發(fā)現(xiàn)，芽孢桿菌可以提高稚參變態(tài)率；張漢華等[54]在斑節(jié)對蝦(Penaeusmonodon)養(yǎng)殖水體中添加益生菌制劑后發(fā)現(xiàn)，斑節(jié)對蝦性狀改善明顯，規(guī)格變大、活力變強、大小均勻、產(chǎn)量提高、飼料系數(shù)降低；孟小亮[24]對黃顙魚投喂地衣芽孢桿菌后，降低了魚體肌肉脂肪含量，增加肌肉粗蛋白以及風味氨基酸含量，使魚肉鮮美適口，提高了水產(chǎn)品營養(yǎng)價值和經(jīng)濟價值。

很多研究表明，同種魚飼喂單一益生菌和復合益生菌的效果不同。潘雷[55]發(fā)現(xiàn)，大菱鲆(Scophthalmusmaximus)攝食添加含地衣芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌、嗜酸乳酸菌(L.acidophilus)以及雙歧桿菌(Bifidobacterium)的復合益生菌的飼料后，存活率顯著提高。胡毅等[25]將3種菌株分別或組合為不同的復合益生菌加入飼料中，發(fā)現(xiàn)飼喂復合益生菌組的凡納濱對蝦的淀粉酶活力、血清蛋白濃度及溶菌酶活力明顯高于單一菌株組。但曾東[33]卻發(fā)現(xiàn)，復合菌的效果不一定優(yōu)于單一菌，單一枯草芽孢桿菌菌劑的作用效果優(yōu)于枯草芽孢桿菌與光合細菌復合菌劑和枯草芽孢桿菌與腸球菌復合菌劑。

4 展 望

益生菌為無毒、無殘留、無副作用的微生物制品，在水產(chǎn)養(yǎng)殖中逐漸廣泛應用，但水產(chǎn)動物益生菌的研究及應用依舊存在很多不足。首先，對益生菌抑制病原菌作用機理的研究都是在體外條件下進行，而在體內(nèi)的作用機制是否與體外相同尚不清楚。益生菌與致病菌競爭營養(yǎng)物質(zhì)的種類和過程也不明確；其次，水產(chǎn)養(yǎng)殖中使用很多益生菌并不是從水產(chǎn)動物或者生活環(huán)境中篩選出來，而是來自某些陸生動物，這就造成益生菌株無法定殖或不穩(wěn)定、效果不佳；第三，同一株菌在不同水生動物體內(nèi)的作用效果、復合菌株與單一益菌株的益生效果、不同復合菌株最佳配伍都尚不清楚；最后，益生菌在宿主體內(nèi)是否會過量繁殖或突變、是否會對宿主產(chǎn)生不利影響、直接將益生菌添加到養(yǎng)殖水體中是否會破壞生態(tài)平衡等問題也亟待研究。

盡管益生菌在應用中遇到諸多問題，但是隨著人們對水產(chǎn)品安全和品質(zhì)的要求不斷提高，以及水產(chǎn)養(yǎng)殖疾病問題日益突出，益生菌成了可以替代抗生素及化學藥品，防止水產(chǎn)動物病害的最佳選擇，所以必須加強水產(chǎn)動物益生菌篩選和應用研究。第一，加強對已有益生菌菌種添加量、添加劑型、添加頻率、安全性和藥品配伍等問題的研究；第二，不斷加強針對特異性病原的開發(fā)和應用的研究，不斷豐富水生動物益生菌資源。第三，加強基礎(chǔ)理論研究，主要針對益生菌在體內(nèi)的增殖特點、作用機理及與免疫力的相互關(guān)系等研究，以期為水產(chǎn)動物益生菌的篩選及應用提供科學的理論依據(jù)。

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Screening and Application of Probiotics in Aquaculture

HAN Zhuoran, SUN Jingfeng

(Tianjin Key Lab of Aqua-ecology and Aquaculture, Department of Fishery Science,Tianjin Agricultural University, Tianjin 300384, China)

aquatic animal; probiotics; screening; application

S917.4

C

1003-1111(2016)01-0093-06

10.16378/j.cnki.1003-1111.2016.01.017

2015-06-01；

2015-08-31.

教育部重點科研項目(209006)；天津市應用基礎(chǔ)與前沿技術(shù)研究重點項目(15JCZDJC34000)；天津市高等學校創(chuàng)新團隊基金資助項目(TD12-5018).

韓卓然(1992-)，女，碩士研究生；研究方向：水產(chǎn)動物病害及免疫.E-mail: hzr_0714@163.com.通訊作者：孫敬鋒(1976-)，男，教授，博士；研究方向：水產(chǎn)動物病害防治.E-mail：sun_jf@163.com.