張圓圓 王先科 賈 滔

（河南省水產(chǎn)科學(xué)研究院 450044）

錦鯉皰疹病毒(KHV)的檢測(cè)技術(shù)概述

張圓圓 王先科 賈 滔

（河南省水產(chǎn)科學(xué)研究院 450044）

本文介紹了錦鯉皰疹病毒（KHV）的臨床感染癥狀和5種檢測(cè)手段，包括PCR檢測(cè)法、細(xì)胞培養(yǎng)分離法、透射電鏡觀察法、ELISA檢測(cè)法、間接免疫熒光檢測(cè)法（IFAT）等，旨在通過(guò)進(jìn)一步了解錦鯉皰疹病毒病的發(fā)病機(jī)理，為KHV病毒株的分離純化以及相關(guān)疫苗的研制提供參考。

KHV；癥狀；檢測(cè)；分離

錦鯉皰疹病毒(Koiherpersvirus，KHV），又稱鯉皰疹病毒Ⅲ型(CyHV-Ⅲ),是錦鯉皰疹病毒病的主要病原，傳染性強(qiáng)，死亡率高，可引起錦鯉、鯉及變種框鏡鯉的魚(yú)苗、幼魚(yú)和成魚(yú)大量死亡。世界衛(wèi)生組織（OIE)將其列為必須申報(bào)的疾病，我國(guó)將其列為二類疾病。

鯉魚(yú)是河南省漁業(yè)主要養(yǎng)殖品種，也是漁民的主要收入來(lái)源之一。近年來(lái)頻繁暴發(fā)的錦鯉皰疹病毒病發(fā)病快，覆蓋面廣，死亡率高，嚴(yán)重威脅著河南省漁業(yè)的發(fā)展。2015年鄭州東部及中牟等地出現(xiàn)多起較嚴(yán)重的大面積死亡，洛陽(yáng)、商丘等地也出現(xiàn)不同程度的發(fā)病情況，對(duì)養(yǎng)殖戶造成嚴(yán)重的損失。目前尚未有效的藥物能夠控制該病情，養(yǎng)殖戶對(duì)此“談虎色變”。筆者現(xiàn)將國(guó)內(nèi)外已經(jīng)成熟的錦鯉皰疹病毒檢測(cè)技術(shù)總結(jié)如下，旨在通過(guò)對(duì)不同的檢測(cè)方式的概述，進(jìn)一步了解錦鯉皰疹病毒病的發(fā)病機(jī)理，為KHV病毒株的分離純化以及相關(guān)疫苗的研制提供參考。

1 臨床癥狀

發(fā)病魚(yú)及潛在發(fā)病的魚(yú)具有以下癥狀：游動(dòng)緩慢，平衡能力失調(diào)，多在魚(yú)塘周圍漫游；肉眼可觀察到頭蓋骨凹陷，眼球凹陷，鰓絲發(fā)白，糜爛或壞死，黏液增多；體表黏液增多，皮膚出現(xiàn)不規(guī)則出血癥狀。解剖后發(fā)現(xiàn)中后腎充血、腫大；肝胰臟失血嚴(yán)重，鑷子觸碰時(shí)易碎；脾臟充血，呈紫紅色。

2 錦鯉皰疹病毒病原的檢測(cè)方法

目前有效的檢測(cè)和診斷手段主要包括：PCR檢測(cè)、細(xì)胞培養(yǎng)分離、電鏡觀察、ELISA（酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定）和免疫熒光檢測(cè)法等。

2.1 PCR檢測(cè)

2.1.1 常規(guī)PCR檢測(cè)

根據(jù)世界動(dòng)物衛(wèi)生組織（OIE）推薦的引物，目前已擴(kuò)增出的KHV片段有兩種，分別為TK（KHV胸腺嘧啶脫氧核苷激酶基因）和Sph（KHV聚合酶基因）。疑似瀕死病魚(yú)解剖后，取鰓、肝胰臟、腎臟、脾臟和腦等組織混合樣，冰浴勻漿，常規(guī)方法提取DNA、PCR及凝膠電泳分析。TK基因大小409bp,擴(kuò)增所需引物序列為：上游引物:5’-GGGTTACCTGTACGAG-3’,下游引物：5’-CACCCAGTAGATTATGC-3’。PCR反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性5min；95℃變性1min、51℃退火1min、72℃延伸1min，40次循環(huán)；72℃延伸10min。

Sph基因大小292bp,擴(kuò)增所需引物序列為：上游引物5’-GACACCACATCTGCAAGGAG-3’，下游引物5’-GACACATGTTACAATGCTCGC-3’，PCR反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性30s；94℃變性30s、63℃退火30s、72℃延伸30s，40次循環(huán)；72℃延伸7min。

將PCR產(chǎn)物進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)分析，同時(shí)設(shè)定陰性、陽(yáng)性對(duì)照。

2.1.2 nest-PCR（嵌套式聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)）檢測(cè)

nest-PCR主要用于對(duì)潛在的KHV病毒進(jìn)行檢測(cè)。常規(guī)方法提取DNA后PCR，將第一輪PCR產(chǎn)物作為第二輪PCR模板進(jìn)行擴(kuò)增。一輪PCR引物為長(zhǎng)引物，擴(kuò)增484bp的片段，二輪PCR引物為短引物，擴(kuò)增一輪PCR產(chǎn)物中412bp的片段。其中引物序列設(shè)計(jì)如下：

一輪上游引物：

5’-GACGACGCCGGAGACCTTGTG-3’

一輪下游引物：

5’-CACAAGTTCAGTCTGTTCCTCAA-3’

二輪上游引物：

5’-GCCGGAGACCTTGTGATAGA-3’

二輪下游引物：

5’-CCCACGTGCAACTTTGACCC-3’

將二輪PCR產(chǎn)物經(jīng)過(guò)1.2%瓊脂糖凝膠電泳分析，同時(shí)設(shè)定陰性、陽(yáng)性對(duì)照。

2.1.3 LAMP（環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增）法

LAMP（loop-mediated isothermal amplification）是2000年由日本研究人員Notomi等發(fā)明的一種新型的體外等溫?cái)U(kuò)增特異核酸片段的技術(shù)。該技術(shù)主要是利用兩對(duì)特殊設(shè)計(jì)的引物和具有鏈置換活性的DNA聚合酶，使模板兩端引物結(jié)合處循環(huán)出現(xiàn)環(huán)狀單鏈結(jié)構(gòu)，讓引物可以在等溫條件下（約65℃)順利結(jié)合進(jìn)行鏈置換擴(kuò)增反應(yīng)，克服了傳統(tǒng)PCR反應(yīng)需要通過(guò)反復(fù)的熱變性過(guò)程獲得單鏈模板的缺點(diǎn)，大大節(jié)省了時(shí)間，同時(shí)因?yàn)閮蓪?duì)引物針對(duì)靶基因6個(gè)區(qū)域，LAMP具有極高的擴(kuò)增特異性。該技術(shù)在65℃下，60min內(nèi)能擴(kuò)增出109-1010個(gè)拷貝，直接肉眼觀察白色沉淀或者綠色熒光就能得出結(jié)果，簡(jiǎn)單、快速、廉價(jià)，特別適用于現(xiàn)場(chǎng)快速大量的檢測(cè)。

目前針對(duì)KHV檢測(cè)的LAMP技術(shù)已經(jīng)基本成熟，反應(yīng)體系如下：

上游內(nèi)引物KHV-FIP:5’-CCCAAACCCAAGAA -GCAGAAACCCGTTGCCTGTAGCATAGAAGA-3’

下游內(nèi)引物KHV-BIP:5’-CACTCCCTCCGATG -GAGTGAAACTGCCCATGTGCAACTTTG-3’

上游外引物KHV-F3:5’-CTGTATGCCCGAGAG -TGC-3’

下游外引物KHV-B3:5’-AACTCCATCGCCGTC -ATG-3’

環(huán)引物KHV-LF:5’-CCCGCCGCCGCA-3’

常規(guī)方法提取DNA后，加入引物、反應(yīng)液進(jìn)行反應(yīng)，65℃下反應(yīng)60min，肉眼觀察濁度或者熒光判斷結(jié)果即可。

2.2 細(xì)胞培養(yǎng)與分離法

目前，國(guó)內(nèi)外常用錦鯉鰭條細(xì)胞系KF和普通鯉魚(yú)腦細(xì)胞系CCB進(jìn)行KHV病毒培養(yǎng)和分離。根據(jù)已有的報(bào)道，國(guó)內(nèi)于2011年首次分離出錦鯉皰疹病毒，之后，在武漢、廣州等地也相繼分離出KHV。

采集新鮮病魚(yú)的肝、腎、脾、鰓及腦等組織混合樣，在無(wú)菌條件下以1:8的重量體積比加入含1%雙抗的滅菌PBS，在冰浴上勻漿后-80℃下反復(fù)凍融，4℃下以 3000rpm、6000rpm、9000rpm依次離心各10min，在超凈工作臺(tái)上取1ml上清加入到含單層CCB或KF細(xì)胞系的培養(yǎng)瓶中，加入含10%血清的培養(yǎng)基，放入25℃生化培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每天觀察CPE情況。感染KHV的細(xì)胞體積增大，并出現(xiàn)大量的細(xì)胞質(zhì)空泡，細(xì)胞單層崩解，細(xì)胞發(fā)生融合。

2.3 透射電鏡觀察法

取待測(cè)病魚(yú)的鰓絲、肝胰臟、脾臟、腎臟及腦等組織混合樣，剪成0.5cm2大小的組織塊，用2.5%戊二醛溶液固定，磷酸緩沖液清洗，再用1%鋨酸溶液固定2h，梯度乙醇脫水，苯二甲酸二丙烯酯包埋，常規(guī)電鏡超薄切片染色，透射電鏡觀察并拍照。KHV感染過(guò)的樣本細(xì)胞體積增大，出現(xiàn)大量的空泡，并且能夠在細(xì)胞質(zhì)中觀察到大量成熟和未成熟的病毒粒子。

2.4 ELISA檢測(cè)

該方法以純化的KHV作為抗原包被酶標(biāo)板，檢測(cè)魚(yú)血清中的KHV抗體，是判斷外表健康魚(yú)是否感染KHV的有效方法。該法具有特異性強(qiáng)、靈敏度高、方便快速的特點(diǎn)，為我國(guó)錦鯉皰疹病毒病的監(jiān)測(cè)和血清流行病學(xué)調(diào)查提供有效的技術(shù)手段。具體操作過(guò)程如下：

首先包被純化的KHV病毒，封閉1h后用PBST 洗3遍，加入待測(cè)血清孵育,同時(shí)設(shè)置陰性和陽(yáng)性對(duì)照；接著加入IgM抗體孵育1h，再加入HRP標(biāo)記羊抗鼠抗體IgG,最后加入TMB顯色液，待陽(yáng)性出現(xiàn)條帶加入終止液,測(cè)定吸光值(OD）數(shù)值，即可評(píng)估待測(cè)KHV的含量。

2.5 間接免疫熒光檢測(cè)法（IFAT）

免疫熒光技術(shù)是將不影響抗原抗體活性的熒光色素標(biāo)記在抗體（或抗原）上，與其相應(yīng)的抗原（或抗體）結(jié)合后，在熒光顯微鏡下呈現(xiàn)一種特異性熒光反應(yīng)。

間接免疫熒光法檢測(cè)KHV 方法如下：CCB細(xì)胞接種至96孔板，細(xì)胞長(zhǎng)到90%時(shí)加入疑似病樣組織濾液，25℃培養(yǎng)箱孵育至出現(xiàn)CPE，吸棄培養(yǎng)液，室溫下加入-20℃預(yù)冷的甲醇固定10min，PBS洗滌3~4次；0.5%Triton處理10min，PBS洗滌3~4次；37℃下5%BSA處理30min，PBS洗滌3~4次，然后分別加入鼠抗KHV一抗、羊抗鼠二抗各孵育1h，PBS洗滌3~4次，倒置熒光顯微鏡下觀察，感染KHV的病樣會(huì)在顯微鏡下觀察到大量的綠色熒光。

3 小結(jié)

目前全國(guó)各地通過(guò)各種檢測(cè)手段進(jìn)行KHV的檢測(cè)和分離，但是面臨的共同問(wèn)題就是在疑似病例中KHV陽(yáng)性檢出率偏低。筆者認(rèn)為，為了提高陽(yáng)性檢出率，可以從以下幾個(gè)方面進(jìn)行改進(jìn)：

3.1 采樣時(shí)需分清細(xì)菌性敗血癥引起的急性爛鰓病和錦鯉皰疹病毒引起的急性爛鰓病，只有由錦鯉皰疹病毒引起的急性爛鰓才會(huì)檢測(cè)出KHV。

3.2 取樣的時(shí)候盡量取新鮮活體樣本，帶回實(shí)驗(yàn)室后盡快檢測(cè)，凍存的樣本影響DNA的檢測(cè)。

3.3 對(duì)于癥狀比較明顯的樣本可以采用一種方法進(jìn)行檢測(cè)，潛在樣本需通過(guò)至少2種方法，最終確認(rèn)是否為KHV陽(yáng)性。

Overview of detection methods of koi herpesvirus(KHV)

Zhang Yuan-yuan,Wang Xian-ke,Jia Tao

(Henan Academy of Fishery Science,Zhengzhou 450044,Henan,China)

This paper introduced the symptoms of KHV infection and five detection methods,including PCR, cell culture and separation,TEM observation,ELISA,IFAT.It aimed to probe the disease mechanism of KHV and offer reference for KHV separation and related vaccines development.

KHV;symptoms;detection;separation

現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系建設(shè)專項(xiàng)（nycytx-49-34),河南省農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系（：2060302-社會(huì)公益研究）

張圓圓（1986-），女，漢族，碩士研究生，從事漁業(yè)資源調(diào)查和病害防控工作