惠　越 綜述，張　鑫，劉國躍，戢　慧，李　沖，陳　淼△ 審校

(1.遵義醫(yī)學院重癥醫(yī)學科2病區(qū)，貴州遵義 563000；2.湖南省長沙市第三醫(yī)院　410015)

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MicroRNA-21相關靶基因的研究進展*

惠越1綜述，張鑫1，劉國躍1，戢慧2，李沖1，陳淼1△審校

(1.遵義醫(yī)學院重癥醫(yī)學科2病區(qū)，貴州遵義 563000；2.湖南省長沙市第三醫(yī)院410015)

[關鍵詞]miRNA-21；靶基因；細胞凋亡；潛在靶點

MicroRNA(miRNA)是一類新近發(fā)現(xiàn)的非編碼小分子RNA，廣泛表達于機體的各個組織和器官，主要通過與相關靶基因結合在轉錄后水平負性調控約60%的人類基因[1]。其中，miRNA-21在心腦血管、肝臟、肺臟、腎臟等多種疾病中異常表達，明確其所調控的靶基因對闡明miRNA-21的功能及在各種生命過程和疾病發(fā)生機制中的作用非常關鍵。目前鑒定靶基因最直接的方法是利用熒光定量PCR及Western blot方法分別檢測轉染或敲低miRNA后細胞中mRNA水平及蛋白水平的變化,從而確定miRNA與靶基因的對應關系。這種方法可以大大提高準確率，但最終確定靶基因，還需要鑒定miRNA的靶位點。本文就目前國內外關于miRNA-21靶基因的研究進展作一綜述。

1實驗證實的miRNA-21靶基因

1.1PTENPTEN是迄今發(fā)現(xiàn)的第一個具有磷酸酶活性的抑癌基因，定位于染色體10q23.3，全長約200 kb，它是一種具有磷酸脂酶活性的抑癌基因，其表達產物PTEN蛋白有403個氨基酸，是一個雙特異性磷酸酶，能使磷脂酰肌醇-3,4,5-三磷酸(PIP3)脫磷酸形成磷脂酰肌醇-3,4-二磷酸(PIP2)，使其喪失信號功能，從而阻斷磷脂酰肌醇3-激酶/絲氨酸蘇氨酸蛋白激酶B(PI3K/Akt)信號通路，抑制細胞周期的進展，促進細胞凋亡[2-3]。其中，PTEN是這一信號通路中的“分子開關”，其失活必然激活PI3K/Akt通路[4]。相關研究已經證實miRNA-21在多種腫瘤細胞中介導PTEN的表達[5]。研究者通過對非小細胞肺癌和肺癌周圍組織的研究發(fā)現(xiàn)，轉染miRNA-21的抑制劑后，PTEN的表達明顯上調，并且進一步證明了miRNA是通過與PTEN的3′ UTR端直接結合而抑制其表達[6]。Ou等[7]分別通過上調及降低miRNA-21在鼻咽癌CNE1和CNE2細胞系中的表達水平，發(fā)現(xiàn)miRNA-21可誘導鼻咽癌細胞生長并抑制細胞凋亡；進一步通過miRNA-21轉染PTEN野生型及突變型熒光素酶報告基因載體，并以免疫印跡法檢測PTEN和磷酸化Akt表達，驗證了miRNA-21通過Akt信號通路抑制PTEN mRNA的表達。在創(chuàng)傷性腦損傷體外試驗中，Wang等[8]證實了miRNA-21可通過PTEN/Akt信號通路，調節(jié)其下游凋亡相關蛋白Caspase-3、Caspase-9、Bcl-2和Bax的表達水平來減少神經元細胞的凋亡，提供了新的創(chuàng)傷性腦損傷神經元凋亡的分子機制，并且提示miRNA-21可能為其治療的潛在靶點。

1.2PDCD4程序性細胞死亡因子4(programmed cell death 4，PDCD4)最初于1995年在小鼠體內被發(fā)現(xiàn)，在小鼠體內大部分細胞發(fā)生凋亡時該基因表達上調，是目前已經證實的miRNA-21的靶基因之一。人PDCD4基因定位于10q24，全長3.5 kb。正常組織細胞中，PDCD4蛋白主要位于細胞核中，當細胞周圍環(huán)境發(fā)生改變時，它可以通過核輸出信號轉移到細胞質中。PDCD4作為一種細胞凋亡基因在動物和人類腫瘤中被大量研究，其在胃癌、肝癌等腫瘤組織中表達明顯下調，甚至缺失[9-10]。Ferraro等[11]在一組結腸腫瘤標本研究中，對miRNA-21、ITGβ4、PDCD4定量PCR數(shù)據集進行ROC曲線分析，結果顯示，miRNA-21表達水平增高、ITGβ4、PDCD4表達水平降低，且3個基因組合能夠預測結直腸癌的轉移。研究認為PDCD4表達產物可在轉錄水平抑制細胞增殖從而抑制腫瘤的生長[12]。在宮頸癌hela細胞中轉染miRNA-21抑制劑后，檢測到細胞中PDCD4表達明顯上升，進一步研究證實miRNA-21上存在一個與PDCD4 mRNA 3′ UTR相結合的位點，抑制miRNA-21可導致PDCD4的表達上調[13]。另外，F(xiàn)rankel等[14]對乳腺癌的研究中發(fā)現(xiàn)，在MCF-7細胞中導入外源性 miRNA-21抑制劑后PDCD4的表達明顯上調。最近有研究證明，miRNA-21/PDCD4軸在細胞吞噬作用中發(fā)揮了重要作用，參與了死亡細胞的消化與清除。Das等[15-16]證實miRNA-21的表達水平在LPS激活的巨噬細胞中進一步增強，并通過PDCD4調節(jié)IL-10誘導物，從而影響細胞的吞噬作用。Wei等[17]在氧化應激損傷的心肌細胞中發(fā)現(xiàn)NF-κB正向調控miRNA-21的表達，且證明PDCD4是miRNA-21的直接作用靶點。此外，miRNA-21的過表達能保護ROS介導的心肌損傷。

1.3TPM1原肌球蛋白(tropomyosin，TPM)是肌肉收縮過程中重要的調節(jié)蛋白質，廣泛分布于各種真核細胞中。原肌球蛋白1(tropomyosin 1，TPM1)屬于這一家族中相對分子質量較高的一類，是肌肉收縮過程中重要的調節(jié)蛋白質。在對乳腺癌細胞MCF-7轉染miRNA-21的研究中發(fā)現(xiàn)，重組人TPM1表達明顯上調，其機制是通過miRNA-21與TPM1-mRNA的3′UTR結合，從而調節(jié)TPM1的表達。Zhu等[18]報道了TPM1基因序列中miRNA-21 潛在結合位點的序列，驗證了TPM1 是miRNA-21的作用靶點，miRNA-21在轉錄后水平抑制TPM1表達。Wang等[19]同樣證明TPM1 mRNA 3′-UTR是miRNA-21的直接作用靶點，miRNA-21通過TPM1來調節(jié)血管平滑肌細胞的功能。一些致動脈粥樣硬化的因素可誘導缺氧誘導因子1(HIF-1)上調miRNA-21，再靶向作用于TPM1促進ASMC增殖，導致ASO形成。HIF-1/miRNA-21/TPM1通路可能在ASO的發(fā)病機制中發(fā)揮關鍵作用[19-20]。

1.4Sprouty1、Sprouty2Sprouty蛋白是一類軟脂?；椎鞍?，廣泛表達于機體各個組織與器官。Sprouty有4個亞型，分別為Sprouty1、Sprouty2、Sprouty3和Sprouty4。研究發(fā)現(xiàn)，miRNA-21可在腫瘤組織中負性調控Sprouty蛋白家族的表達，后者可使受體酪氨酸激酶(receptor tyrosine kinase，RTK)信號通路異常,引起組織生長發(fā)育失調、細胞異常增生和轉化[21]。在對心力衰竭小鼠的研究中發(fā)現(xiàn)，miRNA-21可與Sprouty-mRNA相應的堿基對結合，從而導致Sprouty蛋白家族表達下調；進一步通過降低小鼠體內miRNA-21表達水平，可檢測到Sprouty1蛋白的表達明顯上調，從而有效地改善了患病小鼠的預后。其機制可能與Sprouty1蛋白對細胞外信號調節(jié)激酶(acellular signal-regulated kinase，ERK)信號通路的抑制相關[22]。miRNA-21還可提高成纖維細胞的生存率，導致心肌纖維化和功能障礙。房顫患者miRNA-21的表達增加，miRNA-21及Sprouty1在人心房肌的表達與心肌纖維化密切相關[23]。Bronnum等[24]研究表明miRNA-21促進心外膜間皮細胞向纖維上皮間質轉化，其通過靶向作用于Sprouty1、PDCD4來調控調節(jié)心肌纖維上皮間質轉化。Sayed等在結腸癌SW480細胞中轉染miRNA-21的反義抑制劑來抑制miRNA-21表達，并通過相關方法檢測到Sprouty2與miRNA-21直接靶向連接。miRNA-21通過靶向作用于PTEN和Sprouty2增強MAPK和Akt信號轉導，并負性調節(jié)酪氨酸激酶受體信號轉導[25]。在多發(fā)性骨髓瘤細胞中，Sprouty2通過抑制活化的MAPK /ERK通路來抑制腫瘤發(fā)展；通過轉染抑制劑下調miRNA-21增加Sprouty2在多發(fā)性骨髓瘤細胞系的表達，證實miRNA-21調控Sprouty2的表達[26]。

1.5Fas配體(FasL)FasL是能夠結合到死亡受體TNFRSF6/FAS的細胞因子，介導T細胞引起的凋亡。CTL細胞在活化后，識別靶細胞，細胞表面表達的高水平FasL與靶細胞表面的Fas相互識別，通過Fas觸發(fā)靶細胞內部的凋亡程序，使靶細胞發(fā)生死亡。FasL的表達也受到了miRNA-21的調控。Wang等[27]指出Foxo3a 通過miRNA-21來調控FsaL 的表達。Foxo3a在阿霉素的介導下可以降低miRNA-21啟動子的活性，熒光素酶實驗結果顯示miRNA-21可以抑制FasL轉錄活性。Shang等[28]在膠質母細胞瘤的研究中發(fā)現(xiàn)，過表達 miRNA-21在轉錄后水平抑制FasL蛋白表達；降低miRNA-21水平，則FasL蛋白表達增加。通過構建FasL 3′UTR野生型載體及突變載體，以熒光素酶實驗證實，F(xiàn)asL為miRNA-21直接靶基因[28]。腫瘤表面過表達的FasL可誘導特異性激活的腫瘤浸潤淋巴細胞(TIL)凋亡導致腫瘤免疫逃逸，促進腫瘤細胞增殖，侵襲和轉移。Wu等[29]實驗證實乳腺癌組織中FasL的表達與miRNA-21呈負相關，miRNA-21靶向調節(jié)FasL介導的細胞凋亡可能打破腫瘤免疫逃逸機制，使腫瘤的免疫治療成為可能。

1.6TIMP3和RECKTIMP3和RECK是基質金屬蛋白酶(MMPs)的負調控因子，也是miRNA-21的靶基因。肝細胞癌中高遷移率族蛋白B1(HMGB1)誘導的miRNA-21的表達在轉錄后水平抑制MMP抑制劑RECK、TIMP3的表達，它能影響肝癌的進展和轉移。HMGB1發(fā)出信號增加miRNA-21的表達，通過抑制RECK、TIMP3增強MMPs活性；抑制HMGB1高表達的肝細胞癌中miRNA-21水平，可減輕miRNA-21對其靶基因TIMP3、RECK的抑制，從而降低腫瘤MMPs的活性，最終阻礙腫瘤的進展[30]。體外培養(yǎng)的人結腸癌細胞中過表達的miRNA-21能顯著下調RECK水平，通過其下調RECK、增加MMP2活性來調控基質miRNA-21誘導的腫瘤入侵[31]。黑色素瘤細胞徑向生長期向垂直生長期的過渡與MMPs有關，TIMP3抑制MMPs的表達，可以減少某些腫瘤的惡性表達程度。miRNA-21抑制TIMP3表達，能促進黑色素瘤從徑向生長期過渡到更惡性的垂直生長期，從而增加了腫瘤的侵襲性[32]。Zhou等[33]證實miRNA-21通過靶向作用于細胞凋亡的啟動子TIMP-3，抑制神經細胞凋亡。TIMP-3 mRNA及蛋白在受損的背根神經元表達減少，而大腦皮層缺血會導致TIMP-3 mRNA及蛋白表達增加。這兩種不同結果顯示細胞的損傷與保護不僅與miRNA-21調控有關，還可能與中樞、外周神經細胞的再生能力有關。

2miRNA-21潛在的作用靶點

miRNA靶基因的驗證工作量大，驗證過程復雜，雖然近年國內外涌現(xiàn)出大量有關miRNA-21的研究，但已證實的miRNA-21直接靶基因并不多，對其靶基因的篩選和驗證仍是今后研究的重點和難點。目前，常用的miRNA靶基因預測軟件中數(shù)據較全面且更新較快的有miRBase、TargetScan、Pictar、miRecords、TarBase及miRTarBase。對這些數(shù)據庫檢索發(fā)現(xiàn)，miRNA-21預測靶基因集合生物通路富集性分析發(fā)現(xiàn) P38 MAPK通路中EGFR、RASGRP3、NTF3、MAP3K1、TGFBR1等為miRNA-21的潛在作用靶點。miRNA-21可能通過調節(jié)這些基因間接調控MAPK通路，從而在調節(jié)AKI炎癥中發(fā)揮重要作用。也可能通過調節(jié)ACVR2A、SMAD7、TGFBR1、BMPR2、MYC、PITX2 等靶標基因，從而調控P53信號通路，抑制AKI腎小管細胞的凋亡，對AKI起保護作用[34-35]。韓澤平等[36]在人類miRNA疾病數(shù)據庫(HMDD)中尋得miRNA-21、miR-145、miR-221和miR-222為至今前列腺癌領域研究最多的miRNAs。運用miRwalk數(shù)據庫查詢得上述4個miRNAs的共同靶基因，再結合前列腺基因數(shù)據庫(PGDB)查找前列腺癌相關基因，得到CDKN1A、PTEN、ERBB2、MYC、TP53、ESR1和BCL2等7個共同靶基因與前列腺癌密切相關。這些潛在靶點值得進一步研究。

3展望

綜上所述，目前對于miRNA的研究已進入一個全新階段。盡管現(xiàn)階段已預測出許多miRNA-21直接調控的靶基因，但經證實的靶基因不多，且現(xiàn)有研究大多數(shù)為腫瘤方面研究，針對MODS及臟器保護方面研究并不多，應用于臨床并得到臨床驗證的更是少之又少。miRNA-21在調控網絡中所發(fā)揮的作用以及在疾病的診斷、治療及預后中所具有的價值，有待進一步的探索。

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doi:·綜述·10.3969/j.issn.1671-8348.2016.08.041

* 基金項目：國家自然科學基金資助項目(8156010205)。

作者簡介：惠越(1987-)，碩士，住院醫(yī)師，主要從事肺保護方面研究。△通訊作者，E-mail:chengmiao64@163.com。

[中圖分類號]Q522

[文獻標識碼]A

[文章編號]1671-8348(2016)08-1121-04

(收稿日期：2015-07-11修回日期：2015-12-26)