李宏彥，王燕平，張維波，佘銳萍，吳橋興，賈術(shù)永，田宇瑛，王廣軍，王 澤，龐 莉

(1.北京中醫(yī)藥大學(xué)針灸推拿學(xué)院，北京 100029;2.中國中醫(yī)科學(xué)院針灸研究所，北京 100700; 3.中國農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院，北京 100094)

小型豬經(jīng)脈不通病理模型的宏觀定量觀察法*

李宏彥1，2，王燕平1，張維波2△，佘銳萍3，吳橋興3，賈術(shù)永2，田宇瑛2，王廣軍2，王 澤2，龐 莉2

(1.北京中醫(yī)藥大學(xué)針灸推拿學(xué)院，北京 100029;2.中國中醫(yī)科學(xué)院針灸研究所，北京 100700; 3.中國農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院，北京 100094)

目的:建立小型豬經(jīng)脈不通病理模型的宏觀定量觀察法，為中醫(yī)理論的實驗研究提供新途徑。方法:使用凝膠注射法堵塞小型豬的胃經(jīng)和腎經(jīng)低流阻通道，制造經(jīng)脈不通病理模型，測量造模前后小型豬24 h的飲水量、糞便濕重、干重和尿量，測量造模前后第52天的體質(zhì)量和體尺以及造模后第52天的牙齒尺寸與個數(shù)，測量各臟器的最大面積和質(zhì)量。在上述數(shù)據(jù)基礎(chǔ)上，計算糞便含水量、臟器系數(shù)、臟器面積系數(shù)和腸長度系數(shù)。結(jié)果:獲得上述指標(biāo)的定量數(shù)據(jù)，初步建立了小型豬的宏觀定量觀察法。結(jié)論:使用該方法觀察小型豬經(jīng)脈不通病理模型具有可行性。

宏觀定量法;小型豬;經(jīng)脈不通;病理模型;經(jīng)絡(luò)

與所有的科學(xué)理論一樣，中醫(yī)理論揭示的生命和疾病規(guī)律是建立在大量臨床和實驗觀察基礎(chǔ)上的。臨床觀察主要針對人體的宏觀物理表征，即表現(xiàn)出來的、能被感官分辨的人體物理特性［1］。實驗觀察則鮮為人知，它既有主觀內(nèi)省的觀察，也有客觀的解剖和測量?！鹅`樞·經(jīng)水》指出:“若夫八尺之士，皮肉在此，外可度量切循而得之，其死可解剖而視之……皆有大數(shù)?！眰鹘y(tǒng)中醫(yī)的臨床和實驗觀察是以整體觀為方法學(xué)基礎(chǔ)，將物質(zhì)與功能相結(jié)合來體現(xiàn)生命的本質(zhì)。因此，如何既保持中醫(yī)的宏觀整體特色，又充分吸納西方實驗科學(xué)定量分析的優(yōu)勢，是中醫(yī)從經(jīng)典整體論過渡到現(xiàn)代整體論的關(guān)鍵。

經(jīng)絡(luò)不通引起的氣血運(yùn)行失常，早期多表現(xiàn)為功能的改變，因此探索功能性變化的研究方法已成為中醫(yī)基礎(chǔ)研究的重點。本研究室經(jīng)過多年研究，提出了經(jīng)絡(luò)的組織液通道學(xué)說［2］，通過實驗發(fā)現(xiàn)了循經(jīng)低流阻通道［3-5］，并成功建立了經(jīng)脈不通病理模型［6-8］，驗證了“不通則痛”的中醫(yī)學(xué)說［9］。在此基礎(chǔ)上，本實驗擬對小型豬的代謝、體質(zhì)量、體尺、牙齒及臟器的大體形態(tài)進(jìn)行了多指標(biāo)定量測量，尋找由經(jīng)脈堵塞引起的器官水平的宏觀變化指標(biāo)，嘗試在大型動物上建立具有中醫(yī)特色的實驗觀察方法，為小型豬經(jīng)脈不通病理模型的研究提供新手段。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 中國實驗用雄性小型豬(北京市琉璃河科興實驗動物養(yǎng)殖中心)3只，3月齡，體質(zhì)量9～11 kg，毛色黑，隨機(jī)抓取順序放入1、2、3號籠，按籠號順序?qū)游锓譃?組，分別為胃經(jīng)豬、腎經(jīng)豬和對照豬。

1.1.2 飼養(yǎng)方法 圖1顯示，大型動物專用籠具(北京市琉璃河科興實驗動物養(yǎng)殖中心)，籠具大小 1 m×0.7 m×0.8 m，單籠飼養(yǎng)。每日提供濃縮飼料(希望飼料有限公司)，8∶00給料150 g，20∶00給料100 g，飲水不限量。動物房溫度(20±2)℃，濕度50%±10%Rh(實驗動物使用許可證號SYXK (京)2011-0014)。

1.1.3 實驗器材 經(jīng)絡(luò)測定儀(5726F30型，東華電子儀器廠)、干燥箱(202系列，上海圣科儀器設(shè)備有限公司)、電子天平(T-2000型，精度為0.5 g)、備皮刀、量杯、軟尺、游標(biāo)卡尺、體質(zhì)量秤、相機(jī)1 (NikonD5000，105 mm微距鏡頭，日本)、相機(jī) 2 (Canon5D2，日本)、面積測定盤、手術(shù)器材、消毒酒精等。

1.1.4 實驗試劑 Macrolane穩(wěn)定性透明質(zhì)酸(凝膠)(瑞典 Uppsala公司);阿利新藍(lán)8 GX(美國SIGMA公司);悅靈膠(杭州普濟(jì)醫(yī)藥技術(shù)開發(fā)有限公司);3%戊巴比妥鈉(自制);速眠新Ⅱ(吉林省華牧動物保健品有限公司);安特固強(qiáng)力膠(新加坡安特固化學(xué)有限公司)。

1.2 經(jīng)絡(luò)不通病理模型的建立

圖2、3顯示，使用3%戊巴比妥鈉(0.5 ml/kg)和速眠新Ⅱ(0.1 ml/kg)分別注射小豬兩側(cè)臀部肌肉進(jìn)行麻醉。備皮后用經(jīng)絡(luò)測定儀測量循經(jīng)低電阻點［10］，以“·”標(biāo)記，點間距離約1～2 cm，胃經(jīng)豬測量胃經(jīng)區(qū)域，腎經(jīng)豬測量腎經(jīng)區(qū)域，對照豬只做麻醉處理。然后用流阻測定儀在低電阻點的連線上測低流阻點［2-11］，測定后連接盛有凝膠(少量阿利新藍(lán)染色后)的注射器，向低流阻點緩慢注入0.5～1 ml:胃經(jīng)單側(cè)4點，雙側(cè)共8點;腎經(jīng)單側(cè)3點，雙側(cè)共6點。凝膠注射后，將悅靈膠注入凝膠皮丘邊緣與低電阻線相交處的皮下組織，取出針頭立即按壓針孔。

1.3 觀察內(nèi)容及方法

1.3.1 代謝觀察 造模前觀察7 d，造模后觀察51 d，每24 h測量飲水量、尿量和糞便量。飲水量用量杯測量當(dāng)日剩余水量，計算倒入水量與剩余水量的差值。尿量用量杯測量收集桶中的尿量。糞便量直接稱量代謝盤中的糞便為糞便濕重;將糞便放入最高溫度為150℃、定時25 min的干燥箱，待溫度降至36℃取出糞便稱重，所稱質(zhì)量為糞便干重。計算糞便含水量=(糞便濕重 －糞便干重)/糞便濕重×100%。

1.3.2 體質(zhì)量、體尺、牙齒的測量與計算 用體質(zhì)量秤和軟尺分別測量造模當(dāng)天和取材當(dāng)天豬的體質(zhì)量和體尺(胸圍、腹圍、腿臀圍、體長)，計算造模前后的體質(zhì)量差值和胸圍、腹圍、腿臀圍的體軀指數(shù)，胸圍體軀指數(shù)=胸圍/體長×100%［12］。造模后第52天處死取出下頜骨及牙齒，使用游標(biāo)卡尺測量雙側(cè)門齒和犬齒的長度及前臼和臼齒的寬度。

1.3.3 臟器大體形態(tài)觀察 圖4～圖7顯示，動物處死后打開胸腹腔，用相機(jī)記錄各臟器原位情況，然后取出心臟、肺、脾、胃、肝臟、腎臟、睪丸、前列腺、膀胱、小腸和大腸，分別進(jìn)行離體稱重，再放到面積測定盤上拍照，觀察臟器外觀(相機(jī)2)及內(nèi)部剖檢情況(相機(jī)1)，記錄臟器的質(zhì)地、顏色、表面、黏膜和內(nèi)容物是否有異常，并給予初步分級評估:“－”表示未見明顯異常，“+”表示有異常，“++”表示有明顯異常，特殊情況以文字說明。

1.3.4 系數(shù)的計算 利用已獲數(shù)據(jù)計算系數(shù):臟器系數(shù)=臟器質(zhì)量/體質(zhì)量×100%［13］;臟器面積系數(shù)=臟器投影面積/同水平軀體截面積×100%，臟器投影面積從照片上數(shù)格獲得，軀體截面積=同水平體圍2/4π，其中心臟、肺與胸圍所在軀體截面積比較，脾、胃、肝臟、膽囊與胸圍和腹圍所在軀體截面積的均值比較，腎臟、膀胱、前列腺、睪丸與腹圍和腿臀圍所在軀體截面積的均值比較;腸長度系數(shù)=腸長度/體長×100%。

2 結(jié)果

2.1 代謝

使用N-of-1單樣本統(tǒng)計方法對3只小型豬的總周期分析結(jié)果顯示，造模后胃經(jīng)豬與對照豬飲水量和尿量與造模前比較有較大增加，而腎經(jīng)豬造模前后飲水量和尿量反而略有減少。

2.2 體質(zhì)量

表1顯示，造模前后小型豬體質(zhì)量差值不同，即其體質(zhì)量增加速度有差異。

2.3 體尺

表1 體質(zhì)量變化統(tǒng)計表(kg)

表2 體軀指數(shù)表(%)

表2顯示，胃經(jīng)豬造模后3項體尺的體軀指數(shù)均較造模前增大，而腎經(jīng)豬和對照豬造模后的3項體軀指數(shù)均減小。

2.4 牙齒

表3顯示，3只小型豬牙齒個數(shù)有差異。胃經(jīng)豬門齒長度與腎經(jīng)豬和對照豬差異較大，對照豬的臼齒寬度與胃經(jīng)豬和腎經(jīng)豬差異較大。

表3 牙齒統(tǒng)計表(±s，cm)

表3 牙齒統(tǒng)計表(±s，cm)

項門齒 犬齒 前臼 臼齒個數(shù) 長度 個數(shù) 長度 個數(shù) 寬度 個數(shù) 寬度胃經(jīng)豬 4 0.53±0.12 4 0.28±0.12 4 0.30±0.03 8 0.56±0.12目腎經(jīng)豬 4 0.70±0.12 4 0.28±0.02 3 0.30±0.03 7 0.55±0.25對照豬 4 0.73±0.12 4 0.28±0.09 4 0.31±0.17 10 0.68±0.12

2.5 臟器剖檢觀察

表4顯示，胃經(jīng)豬腎臟有異常，腎經(jīng)豬膀胱內(nèi)有白色顆粒。3只豬氣管、小腸、大腸的內(nèi)容物均有異常，且胃經(jīng)豬、腎經(jīng)豬的氣管內(nèi)有明顯異常，對照豬的大腸內(nèi)容物有明顯異常。

2.6 臟器系數(shù)、臟器面積系數(shù)、腸長度系數(shù)

表5顯示，除胃經(jīng)豬脾臟、腎經(jīng)豬膀胱臟器系數(shù)與對照豬相同外，其余各臟器系數(shù)均與對照豬不同，其中腎經(jīng)豬與生殖系統(tǒng)相關(guān)的睪丸和前列腺的臟器系數(shù)與對照豬和胃經(jīng)豬差異較大。

表4 大體剖檢表

表5 各臟器系數(shù)表(%)

表6 臟器面積系數(shù)、腸長度系數(shù)(%)

表6顯示，胃經(jīng)豬與腎經(jīng)豬的各臟器系數(shù)與對照豬均有所不同，其中腎經(jīng)豬與生殖系統(tǒng)相關(guān)的睪丸和前列腺面積系數(shù)與對照豬和胃經(jīng)豬比較差異較大。

3 討論

目前的代謝研究常使用鼠類，已有標(biāo)準(zhǔn)的代謝籠具和測量系統(tǒng)［14］，但尚缺乏與中醫(yī)相關(guān)的大型動物代謝研究。大型動物特別是小型豬與人的同源性達(dá)84%，是針灸研究的優(yōu)選模式生物［15］，故我們用小型豬作為研究對象，在以往的研究基礎(chǔ)上，使用可測量豬代謝指標(biāo)的籠具收集相關(guān)數(shù)據(jù)。飲水和大小便是中醫(yī)問診的主要內(nèi)容之一，也是實驗動物常用的一般體征指標(biāo)。糞便的質(zhì)量與大便積分［17］(硬便1分，軟便2分，不成形便3分)相比更具定量性，這些指標(biāo)均可反映胃腸的水液代謝情況和對飼料的吸收情況。代謝數(shù)據(jù)顯示，腎經(jīng)豬的飲水量和尿量并未隨著月齡的增長而增加，反而減小，這與動物生長規(guī)律相悖，說明凝膠堵塞腎經(jīng)低流阻通道可能對小型豬的發(fā)育有影響。

臟腑功能的減弱常無明顯病理學(xué)改變，這些宏觀的“未病”變化是目前中醫(yī)基礎(chǔ)實驗研究的盲點。體質(zhì)量與體尺是反映小型豬生長發(fā)育的基本指標(biāo)，根據(jù)體尺計算的體軀指數(shù)與其生長發(fā)育有一定的相關(guān)性［12］。傳統(tǒng)體軀指數(shù)只注重胸圍與體長的關(guān)系，本研究的體軀指數(shù)使用了3項體圍與體長的關(guān)系，更準(zhǔn)確地體現(xiàn)了小豬不同部位體尺變化的差異。除整體特征外，中醫(yī)古籍亦有對臟器特征研究的記載。中醫(yī)理論認(rèn)為腎與齒的關(guān)系密切，如《素問·上古天真論》指出:“女子七歲，腎氣盛，齒更發(fā)長……三七，腎氣平均，故真牙生而長極?！比裟I氣不足、髓化乏源則易發(fā)生五遲中的齒遲，即生牙過晚［19］，故牙齒的數(shù)量、長度及寬度可反映腎氣的盈虧?！鹅`樞·腸胃》中明確記載了臟器的質(zhì)量:“舌重十兩……咽門重十兩”，與現(xiàn)代生物醫(yī)學(xué)研究中衡量動物臟腑功能狀態(tài)的組織形態(tài)及臟器質(zhì)量、臟器系數(shù)一樣［20-22］，都是體現(xiàn)臟腑功能宏觀特征的指標(biāo)。在記錄臟器特征的同時，該篇對胃腸尺寸亦有詳述:“胃紆曲屈伸之，長二尺六寸，大一尺五寸，徑五寸”，我們將古人這種對臟器的定量方法應(yīng)用于小型豬的病理模型研究中。在臟器系數(shù)計算方法上，借鑒了針灸同身寸在身體不同部位以本處骨度為標(biāo)準(zhǔn)單位的方法，將軀體近似為圓柱體，根據(jù)3項體圍計算出不同部位的軀體截面積，作為不同臟器的參照標(biāo)準(zhǔn)，所計算的臟器面積系數(shù)和腸長度系數(shù)，體現(xiàn)了不同臟器與軀體相應(yīng)部位的空間關(guān)系。由于臟器指標(biāo)只能在最后的解剖中觀察到，故只有通過大樣本的統(tǒng)計才能消除個體差異，獲得最終結(jié)果，找到規(guī)律。

近年來，中醫(yī)基礎(chǔ)實驗研究借助了顯微鏡等現(xiàn)代設(shè)備，深入到生命的微觀層次，取得了不少研究成果，但卻忽略了這些微觀指標(biāo)并非古人直接觀察到的東西。古人既看不到細(xì)胞，也測不了分子和生物電，他們所總結(jié)的規(guī)律全部基于感官所能獲得的信息，即所謂的宏觀物理表征［1］。因此，若想理解古人總結(jié)的生命規(guī)律，宏觀層次的觀察應(yīng)該是中醫(yī)基礎(chǔ)研究的一個重點。經(jīng)絡(luò)是古人認(rèn)識到的人體基本組成之一，微觀上表現(xiàn)為微米級的組織通道［23］，宏觀上則遍布全身，經(jīng)絡(luò)堵塞、氣血瘀滯的微觀變化經(jīng)長時間積累，最終可通過身體的宏觀癥狀表現(xiàn)出來。本研究對小型豬進(jìn)行了慢性造模，符合經(jīng)絡(luò)堵塞的漸變病理過程，定量觀察了小豬的代謝、體質(zhì)量、體尺、牙齒、臟器大體形態(tài)等宏觀指標(biāo)，還原了古人的觀察內(nèi)容，數(shù)據(jù)的測量與分析又升華了古人的觀察，既有中醫(yī)特色，又符合現(xiàn)代實驗科學(xué)的定量化要求，使統(tǒng)計學(xué)和其他數(shù)學(xué)分析成為可能。本實驗獲得3只小型豬的相關(guān)定量數(shù)據(jù)，證明該方法具有可行性，為下一步的研究奠定了基礎(chǔ)，其宏觀定量的觀察方法可應(yīng)用到其他的中醫(yī)基礎(chǔ)實驗研究上。

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Macroscopical and Quantitative Observation Method of Pathological Changes in Minipigs after Blocking Channels

LI Hong-yan1，2，WANG Yan-ping1，ZHANG Wei-bo2△，SHE Rui-ping3，WU Qiao-xing3，JIA Shu-yong2，TIAN Yu-ying2，WANG Guang-jun2，WANG Ze2，PANG Li2
(1.Acupuncture，Moxibustion and Tuina School of Beijing University of Chinese Medicine，Beijing 100029，China; 2.Institute of Acupuncture＆Moxibustion，China Academy of Chinese Medical Sciences，Beijing 100700，China; 3.College of Veterinary Medicine，China Agricultural University，Beijing 100094，China)

Objective:Establish a macroscopical and quantitative observation method of pathological changes in minipigs after blocking channels to provide a new method for experimental research on basic theory of Traditional Chinese Medicine.Methods:A pathological model of blocked meridian was made by gel injection in the low hydraulic resistance channels along stomach meridian and kidney meridian.The amount of water intake，wet weight and dry weight of feces and urinary volume were measured every day during the whole experiment.Body weight and size of the body were measured on the day before channel blocked and on the 52th day after channel blocked.The size and number of teeth and the surface area and weight of organs were measured on the 52th day.Based on the above data，the water content of feces，organ index，organ area index and intestine length index were calculated.Result:The quantative data above are obtained and a macroscopical and quantitative observation method of pathological changes in minipigs after blocking channels is established.Conclusion:This macroscopical and quantitative method of observing the pathological changes in minipigs after blocking channels is feasible.

Macroscopical and quantitative method;Minipig;Blocked channel;Pathological model;Meridian

R224.1

:B

:1006-3250(2016)04-0525-04

2015-12-08

國家自然科學(xué)基金資助項目(81173206)-基于組織液通道的小型豬經(jīng)脈不通病理模型研究

李宏彥(1990-)，女，內(nèi)蒙古人，醫(yī)學(xué)碩士，從事針灸經(jīng)典理論的臨床應(yīng)用與實驗研究。

△通訊作者:張維波(1961-)，男，北京人，研究員，博士研究生導(dǎo)師，從事經(jīng)絡(luò)生物理化性質(zhì)研究，E-mail:1507307638@ qq.com。