費(fèi) 曜，陳中沛，朱丹平，樊 玲，張西儉，牛亞珍

(1.重慶醫(yī)科大學(xué)中醫(yī)藥學(xué)院中藥綜合教研室，重慶 400016;2.重慶市中醫(yī)院內(nèi)分泌科，重慶 400021)

脈通方對糖尿病大鼠糖脂代謝及腎功能的影響*

費(fèi) 曜1，陳中沛2△，朱丹平2，樊 玲2，張西儉2，牛亞珍1

(1.重慶醫(yī)科大學(xué)中醫(yī)藥學(xué)院中藥綜合教研室，重慶 400016;2.重慶市中醫(yī)院內(nèi)分泌科，重慶 400021)

目的:探討脈通方對2型糖尿病大鼠糖脂代謝及腎臟的影響。方法:采用高糖高脂飲食+腹腔注射STZ，建立大鼠2型糖尿病模型。按隨機(jī)數(shù)字表法分為空白對照組、模型組、陽性組、脈通方低、中、高劑量組，灌胃8周，觀察脈通方對大鼠體征、FBG、FINS、ISI、TC、TG、HDL-C、LDL-C、24 h尿蛋白總量、腎臟指數(shù)K/W、CREA、BUN、腎臟組織病理形態(tài)學(xué)的影響。結(jié)果:與模型組比較，脈通方高劑量組可改善2型糖尿病大鼠的體質(zhì)量，減少尿量;降低空腹 FBG值;改善FINS水平和ISI值的降低;降低TG和LDL-C;降低K/W值;使CREA明顯下降。治療組腎小球病理改變有所減輕，系膜和基底膜增生明顯改善。結(jié)論:脈通方對2型糖尿病大鼠具有調(diào)節(jié)糖脂代謝、減輕腎臟肥大、保護(hù)腎臟的作用。

脈通方;2型糖尿病大鼠;糖脂代謝;腎功能

糖尿病腎病(diabetic nephropathy，DN)是糖尿病最常見的慢性微血管并發(fā)癥之一，也是影響患者生活質(zhì)量及導(dǎo)致死亡的主要原因之一。以“補(bǔ)腎瀉濁”為組方原則的“脈通方”用于糖尿病、早中期DN，尤其在腎精不足患者的治療過程中取得了較好的臨床療效［1-2］。本實驗通過建立2型糖尿病大鼠(type 2 DM，T2DM)動物模型，觀察“脈通方”對糖尿病大鼠血糖、血脂及腎功能的影響，初步探討其發(fā)揮腎臟保護(hù)作用的機(jī)制，為指導(dǎo)臨床用藥及新藥研發(fā)奠定基礎(chǔ)。

1 材料

1.1 動物與飼料

SPF級SD雄性大鼠72只，體質(zhì)量(160±20) g。高糖高脂飼料包括脂肪49%，蛋白21%，碳水化合物20.5%，蔗糖9.5%;基礎(chǔ)飼料包括碳水化合物64%，蛋白質(zhì)23%，脂肪13%，均購自重慶醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心。

1.2 藥品

脈通方由黃芪、桑椹、枸杞、山藥、梔子、澤瀉、丹參、川芎、銀花藤、荔枝核組成，藥材購自四川新荷花中藥飲片股份有限公司，經(jīng)藥劑科冷靜藥師鑒定為正品。脈通方湯劑由重慶市中醫(yī)院制劑室制備，濃縮至含生藥 1 g/ml，4℃保存?zhèn)溆?。鏈脲佐菌?STZ，批號MW26522，美國SIGMA公司)，二甲雙胍片(批號20131002，上海施貴寶制藥公司)。

1.3 主要試劑

血糖試紙(華廣生技股份有限公司)，F(xiàn)INS放射免疫試劑盒(北京普爾偉業(yè)生物科技公司)，TC、TG試劑盒(上海復(fù)星長征醫(yī)學(xué)有限公司)，LDL-C、HDL-C試劑盒(浙江伊利康生物技術(shù)有限公司)，尿蛋白試劑盒(批號 30830H)，BUN試劑盒(批號: 305243E)，CREA試劑盒(批號390272I)(北京利德生物公司)。

1.4 主要儀器

三用紫外線分析儀(上海顧村電光儀器廠); ARCHITECT C8000全自動生化分析儀(美國雅培公司);DPC-1000化學(xué)發(fā)光分析儀(美國德普公司);瑞特RightestGM300血糖儀(臺灣);Centra MP4R低溫冷凍離心機(jī)(美國IEC公司)。

2 方法

2.1 2型糖尿病大鼠模型制備

雄性SD大鼠72只，適應(yīng)性喂養(yǎng)3 d后，隨機(jī)選出10只作為空白組，喂飼基礎(chǔ)飼料;剩余造模組62只，高糖高脂飼料喂養(yǎng)4周，禁食12 h后腹腔注射40 mg/kgSTZ(pH 4.2的0.1 ml/L枸椽酸鈉緩沖液配制)，空白對照組同等條件下腹腔注射同等劑量無菌枸櫞酸-枸櫞鈉緩沖液。72 h后禁食不禁水6 h，測空腹血糖(FBG)值≥16.8 mmol/L者判定為2型糖尿病大鼠造模成功。

2.2 分組與給藥

將造模成功的50只大鼠，按隨機(jī)數(shù)字表法分為模型組、二甲雙胍陽性組(0.25 g/kg/d)、中藥低劑量組(8.75 g/kg/d)、中藥中劑量組(17.5 g/kg/d)、中藥高劑量組(35 g/kg/d)(根據(jù)臨床成人用藥量168 g/60 kg/d，按人和大鼠體質(zhì)量劑量折算系數(shù)計算作為中劑量，低、高劑量分別按中劑量的1/2和2倍計算)，每組各10只，繼續(xù)喂飼高糖高脂飼料，每日1次灌胃相應(yīng)藥物8周，其中空白對照組、模型組給予等體積生理鹽水灌胃。每周末稱體質(zhì)量，并根據(jù)體質(zhì)量調(diào)整給藥劑量。

2.3 觀察指標(biāo)及檢測方法

大鼠一般狀況觀察:大鼠精神狀況、皮毛、飲食、活動、體質(zhì)量、大小便、對外界刺激的反應(yīng)等變化;24 h尿蛋白測定:藥物干預(yù)8周末稱體質(zhì)量，收集24 h尿液量取尿量，檢測 24 h尿蛋白?？崭寡侵?FBG)及血生化檢查:末次給藥后的次日晨禁食不禁水6 h，腹腔注射10%水合氯醛麻醉(3 ml/kg)，心臟取血測空腹血糖值，全自動生化分析儀檢測血清總膽固醇(TC)、甘油三酯(TG)、高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)、肌酐(CREA)、尿素氮(BUN);胰島素敏感指數(shù)(ISI)計算:采用放射免疫法測定血清 FINS，計算胰島素敏感性指數(shù)(ISI)=Ln［1/(FINS×FBG)］;處死大鼠，迅速摘除雙腎，去除腎包膜，濾紙吸干后稱重，計算腎臟指數(shù)(腎重/體質(zhì)量，K/W)。取左腎沿正中矢狀面剖開，PBS沖洗干凈，去除包膜置10%中性甲醛中固定，常規(guī)脫水、石蠟包埋，切片厚5 μm，HE及PAS染色，光鏡下觀察腎臟的超微結(jié)構(gòu)變化。

2.4 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 11.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析，計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示，給藥前后血糖值比較采用配對t檢驗，組間比較采用單因素方差分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 大鼠一般狀態(tài)觀察

表1顯示，實驗過程中可見對照組大鼠體質(zhì)量增長明顯，精神良好，反應(yīng)靈敏，糞尿正常，毛皮有光澤。模型組大鼠明顯消瘦，飲水多，小便多，大便溏，精神萎靡，反應(yīng)遲鈍，毛無光澤，動作遲緩。二甲雙胍陽性藥組精神狀況較差，動作稍遲緩，體形較模型組增長，大便成形，小便較多，反應(yīng)靈敏度較正常組差。與模型組比較，脈通方高劑量組體質(zhì)量有所上升(P＜0.05)。

3.2 脈通方對尿量、尿蛋白和腎臟指數(shù)的影響

表1顯示，與模型組比較，脈通方高劑量組大鼠24 h尿量明顯減少(P＜0.05);脈通方高、中劑量組DM大鼠24 h尿蛋白、K/W值降低(P＜0.01，P＜0.05)，且呈量-效關(guān)系;而陽性藥二甲雙胍則對DM大鼠24 h尿蛋白、K/W值的改善作用不明顯(P＞0.05)。

表1 脈通方對各組大鼠體質(zhì)量、尿量、24 h尿蛋白總量及腎臟指數(shù)的影響(±s)

表1 脈通方對各組大鼠體質(zhì)量、尿量、24 h尿蛋白總量及腎臟指數(shù)的影響(±s)

注:與空白對照組比較:△△P＜0.01;與模型組比較:*P＜0.05，＊＊P＜0.01

組別 鼠數(shù) 劑量(g/kg) 體質(zhì)量(g) 24 h尿量(ml) 尿蛋白(mg/24 h) 腎臟指數(shù)(%)空 白 對 照 組 10 — 388.40±18.58 36.8±10.4 17.50±2.62 2.70±0.25模 型 組 10 — 254.50±11.81△△ 73.1± 8.1△△ 39.69±5.65△△ 4.05±0.14△△二 甲 雙 胍 陽 性 組 10 0.25 290.75± 7.89△△＊＊ 54.8± 5.6△△＊＊ 39.04±2.58△△ 3.98±0.48△△脈 通 方 低 劑 量 組 10 8.75 271.50±11.90△△ 70.6± 8.1△△ 34.71±4.12△△ 3.50±0.41△△脈 通 方 中 劑 量 組 10 17.50 268.75±15.09△△ 69.6± 4.9△△ 32.85±2.91△△＊ 3.46±0.36△△＊脈 通 方 高 劑 量 組 10 35.00 274.50±14.98△△＊ 61.9± 7.5△△＊ 30.45±3.79△△＊＊ 3.41±0.49△△＊

3.3 脈通方對血糖、血清胰島素及胰島素敏感指數(shù)的影響

表2顯示，與對照組比較，模型組空腹FINS水平明顯上升(P＜0.01)，ISI顯著下降(P＜0.01)，且制備模型8周時與制備模型3 d時比較，模型組血糖無明顯變化。藥物干預(yù)治療8周后與給藥前比較，二甲雙胍組可明顯降低大鼠空腹血糖值(P＜0.01);而脈通方高劑量組可降低大鼠空腹血糖值(P＜0.05);中、低劑量組僅呈現(xiàn)下降趨勢(P＞0.05)。同時在藥物干預(yù)治療 8周后，與模型組比較，二甲雙胍陽性組大鼠FINS及ISI指數(shù)均降低(P＜0.01);脈通方高劑量可降低大鼠 FINS及 ISI值水平(P＜0.O1，P＜0.05)，中劑量組可降低大鼠FINS值(P＜0.05)，且脈通方對大鼠FINS、ISI值的改善作用呈現(xiàn)出一定的量-效關(guān)系。

表2 脈通方對各組大鼠空腹FBG、FINS及ISI的影響(±s)

表2 脈通方對各組大鼠空腹FBG、FINS及ISI的影響(±s)

注:用藥后與用藥前同組間比較:##P＜0.01;與空白對照組比較:△△P＜0.01;與模型組比較:*P＜0.05，＊＊P＜0.01

組ISI空 白 對 照 組 10 —別 鼠數(shù) 劑量(g/kg) 給藥前血糖(mmol/L) 給藥后血糖(mmol/L) FINS(μU/mL) 8.50±1.61 10.02±1.98 19.90±2.19 －5.27±0.22模 型 組 10 — 23.40±3.13 26.38±2.30 30.90±1.89△△ －6.70±0.05△△二甲 雙 胍 陽 性 組 10 0.25 23.98±2.12 12.83±1.88##＊＊ 27.10±1.13△△＊＊ －5.84±0.14△△＊＊脈通 方 低 劑 量 組 10 8.75 24.48±1.83 23.73±3.24 29.68±2.12△△ －6.54±0.17△△脈通 方 中 劑 量 組 10 17.5 23.93±2.59 23.68±2.97 28.05±1.25△△＊ －6.49±0.09△△脈通 方 高 劑 量 組 10 35 24.02±2.16 22.73±2.45* 27.55±1.49△△＊＊ －6.43±0.13△△＊

3.4 脈通方對大鼠血脂的影響

表3顯示，與對照組比較，模型組大鼠的 TC、TG、LDL-C均顯著升高(P＜0.01)，HDL-C明顯下降(P＜0.01)，提示高糖高脂飼養(yǎng)12周可成功復(fù)制高血脂模型。與模型組比較，脈通方低、中、高劑量組均能明顯降低高血脂大鼠的TG(P＜0.01)，且高劑量組在一定程度上還可降低LDL-C(P＜0.05)。

表3 脈通方對各組大鼠TC、TG、HDL-C及LDL-C的影響(±s)

表3 脈通方對各組大鼠TC、TG、HDL-C及LDL-C的影響(±s)

注:與空白對照組比較:△P＜0.05，△△P＜0.01;與模型組比較:*P＜0.05，＊＊P＜0.01

組別 鼠數(shù) 劑量(g/kg) TC(mmol/L) TG(mmol/L) HDL-C(mmol/L) LDL-C(mmol/L)空 白 對 照 組 10 —1.53±0.18 1.02±0.12 1.08±0.13 0.22±0.04模型組 10 — 1.79±0.11△△ 1.48±0.16△△ 0.63±0.15△△ 0.50±0.08△△二 甲 雙 胍 陽 性 組 10 0.25 1.36±0.05△＊＊ 0.82±0.11△＊＊ 0.70±0.13△△ 0.32±0.06△＊＊脈 通 方 低 劑 量 組 10 8.75 1.76±0.08△△ 1.10±0.14＊＊ 0.57±0.13△△ 0.43±0.03△△脈 通 方 中 劑 量 組 10 17.5 1.67±0.07 1.15±0.19＊＊ 0.68±0.07△△ 0.40±0.10△△脈 通 方 高 劑 量 組 10 35 1.65±0.07 0.95±0.12＊＊ 0.72±0.12△△ 0.38±0.07△△＊

3.5 脈通方對大鼠腎功能的影響

表4顯示，與對照組比較，模型組大鼠 CREA、BUN均明顯升高(P＜0.01)，提示糖尿病模型大鼠已出現(xiàn)腎功能的異常;二甲雙胍組大鼠CREA、BUN值與模型組值接近，均顯著升高(P＜0.01);脈通方高、中、低劑量組則均能不同程度地改善大鼠CREA、BUN值(P＜0.05，P＜0.01)。而與模型組比較，脈通方高、中、低劑量組可均顯著減低大鼠CREA水平(P＜0.01)，對BUN水平影響不大(P＞0.05)。

表4 各組血清CREA、BUN變化比較 (±s)

表4 各組血清CREA、BUN變化比較 (±s)

注:與空白對照組比較:△P＜0.05，△△P＜0.01;與模型組比較:＊＊P＜0.01

組別例數(shù)劑量(g/kg) CREA (umol/L) BUN (mmol/L)空 白 對 照 組 10 —23.00±2.12 5.14±1.17模 型 組 10 — 32.50±2.08△△ 15.98±2.01△△二甲雙胍陽性組 10 0.25 33.12±1.56△△ 16.35±1.83△△脈通方低劑量組 10 8.75 18.50±1.29△＊＊13.83±1.65△△脈通方中劑量組 10 17.5 19.25±3.59△＊＊13.75±2.74△△脈通方高劑量組 10 35 20.50±2.43＊＊ 14.02±2.33△△

3.6 各組大鼠腎組織光鏡下變化

圖1顯示，其中正常對照組腎小球無明顯病理改變，結(jié)構(gòu)完整，未見腎小球肥大，毛細(xì)血管開方，基底膜、系膜基質(zhì)未見異常，無炎癥細(xì)胞浸潤。模型組可見腎小球肥大，部分包曼氏囊不規(guī)則，囊腔間隙變寬，大小不均，基底膜明顯不均一性增厚，腎小球系膜基質(zhì)明顯增多，系膜區(qū)增厚，系膜細(xì)胞高度增生，呈彌散性分布，團(tuán)塊狀聚集擠壓毛細(xì)血管，毛細(xì)血管腔狹窄或閉塞，并伴有大量炎細(xì)胞浸潤。脈通方各給藥組病理改變程度較模型組減輕，腎小球體積略有縮小，系膜和基底膜增生程度明顯改善，毛細(xì)血管腔狹窄程度有減弱，有少量炎細(xì)胞浸潤。

圖1 各組大鼠腎組織形態(tài)學(xué)比較(PAS染色 ×400)

4 討論

“消渴”早在《黃帝內(nèi)經(jīng)》中已有記載，此病基本病機(jī)為陰虛燥熱、水液代謝失調(diào)。課題組結(jié)合大量臨床治療經(jīng)驗，認(rèn)為腎精不足是本病發(fā)生發(fā)展的關(guān)鍵。腎精虧虛、腎失封藏則體內(nèi)水谷精微隨尿而出，而腎陰不足、陰虛火旺亦可上灼肺胃，終致三消并存。此類病人典型癥狀表現(xiàn)為乏力，尿量尤其是夜尿增多，或伴有尿濁，或伴有煩熱盜汗，或伴有性欲低下及男子不育、女子不孕，臨床檢查提示尿蛋白增多，腎功能減退。據(jù)此立“補(bǔ)腎瀉濁”之法，分清別濁，補(bǔ)益腎精，以復(fù)津液運(yùn)化之常，達(dá)到“陰氣漸充，精血漸復(fù)，則病必百愈”之效。在此原則上擬“脈通方”用于臨床糖尿病的治療。前期臨床研究證實，該方案對于DNⅢ期和Ⅳ期的治療效果優(yōu)于伊貝沙坦和二甲雙胍組，能明顯改善臨床癥狀，減少24 h尿蛋白，改善脂質(zhì)代謝，降低血黏度［1-2］。實驗研究結(jié)果提示，該方可降低血管內(nèi)皮生長因子VEGF水平，對大鼠動脈血管內(nèi)皮細(xì)胞具有明顯的保護(hù)作用［3］。

脈通方中黃芪、山藥、桑椹、枸杞益氣健脾，滋陰補(bǔ)腎;山藥兼能補(bǔ)腎澀精止漏;澤瀉、梔子利濕瀉濁;當(dāng)歸、丹參活血化瘀，全方共奏補(bǔ)虛固精、瀉濁化瘀之效?，F(xiàn)代研究表明，黃芪配伍山藥能通過抗氧化及免疫調(diào)節(jié)有效防治糖尿?。?］;山藥多糖對 DM大鼠胰島功能具有保護(hù)作用，能減低血糖，抑制血小板的異常激活和聚集［5］;桑椹能增強(qiáng)陰虛小鼠的免疫力［6］;枸杞多糖能改善胰島 β細(xì)胞功能和肝臟脂質(zhì)過氧化損傷，具有降糖、降脂之效［7-8］;澤瀉和梔子的提取物都有降血糖、降血脂的藥理作用［9-10］。臨床研究亦證實，黃芪配伍當(dāng)歸可降低餐后血糖，調(diào)整蛋白和脂肪代謝紊亂，保護(hù)腎功能，廣泛用于腎病綜合癥［11］。本研究結(jié)果表明，高糖高脂飲食結(jié)合小劑量鏈脲佐菌素(40 mg·kg－1)腹腔注射可成功誘發(fā)實驗?zāi)Ｐ痛笫蟪霈F(xiàn)類似人類2型糖尿病癥狀，且在實驗觀察期內(nèi)糖尿病大鼠模型穩(wěn)定，實驗動物出現(xiàn)廣泛的胰島素抵抗及糖尿病腎病癥狀。與模型組大鼠比較，高劑量脈通方能降低2型糖尿病大鼠的體質(zhì)量，24 h尿量減少，降低血糖，提高胰島素敏感性，對高胰島素血癥有明顯緩解;尤其針對模型大鼠出現(xiàn)CREA、BUN增高及腎臟損傷等DN癥狀，脈通方能顯著降低CREA水平，對BUN值也呈現(xiàn)改善趨勢，同時形態(tài)學(xué)結(jié)果也提示脈通方各給藥組腎臟病理改變程度減輕，腎小球體積有所縮小，系膜和基底膜增生程度明顯改善，毛細(xì)血管腔狹窄程度減弱。提示脈通方除可調(diào)節(jié)2型糖尿病模型大鼠出現(xiàn)的糖脂代謝異常、改善體質(zhì)量減低等癥狀外，還可顯著降低肌酐、尿蛋白總量及糖尿病腎病時出現(xiàn)的腎臟損傷，保護(hù)腎臟，也顯示出“補(bǔ)腎瀉濁”法及脈通方在糖尿病腎病治療方面的獨(dú)特優(yōu)勢，具有較好的臨床運(yùn)用及新藥開發(fā)價值。

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Effects of Mai Tong Fang on Glucose and Lipid Metabolism and Renal Function in Diabetic Rats

FEI Yao1，CHEN Zhong-Pei2△，ZHU Dan-Ping2，F(xiàn)AN Lin2，ZHANG Xi-jian2，NIU Ya-Zhen1
(1.Integrated Department of Chinese Medicine，Chongqing Medical University，Chongqing 400016，China; 2.Department of Endocrinology，F(xiàn)irst People's Hospital of Chongqing，Chongqing 400011，China)

Objective:To observe the renal protection effect on rats of the diabetic nephropathy treated by Mai Tong Fang guided by Bushen Xiezhuo Method.Methods:Setting up diabetic rats model by high-sugar and high-fat diet，and intraperitoneal injection of streptozotocin.Intragastric administration for 8 weeks，Observe the following indicators:general situation;FBG，F(xiàn)INS，ISI，TC，TG，HDL-C，LDL-C;urinary protein of 24 h;kidney coefficient calculation(K/W)，CREA，BUN.The pathological structure changes of kidney were observed.Results:Compared with the group before treatment，high-dose group of Mai Tong Fang could improve the weight of type II diabetic rats decreased symptoms，reduce the amount of urine，reduce FBG.Insulin sensitivity were improved.There are obvious response to hyperinsulinemia.Mai Tong Fang can significantly lower triglyceride levels and low-density lipoprotein in a certain extent.Mai Tong Fang can significantly reduce the symptoms of kidney hypertrophy，24 h urine protein and CREA.Conclusion:Mai Tong Fang have positive effect on diabetic mice’s glucose and fat metabolism，and can improve the symptom and protect the kidney function.

Mai Tong Fang;Type 2 diabete rat;Metabolism of glucose and lipid;Kidney function

R587.1

:B

:1006-3250(2016)04-0480-04

2015-08-20

2012年度重慶市衛(wèi)生局中醫(yī)藥科研計劃項目(2012-2-163)-補(bǔ)腎瀉濁法對糖尿病大鼠腎臟組織氧化應(yīng)激損害的研究;張西儉名老中醫(yī)專家工作室研究項目;重慶市中醫(yī)特色診療研究項目

費(fèi) 曜(1979-)，女，四川仁壽人，副教授，醫(yī)學(xué)博士，從事中藥材GAP及品質(zhì)評價、民族藥物的研究。

△通訊作者:陳中沛(1977-)，男，重慶人，副主任醫(yī)師，全國第五批名老中醫(yī)藥專家繼承人，從事中醫(yī)脈診理論與中醫(yī)藥治療內(nèi)分泌系統(tǒng)疾病的相關(guān)研究，Tel:13678413988，E-mail: 13678413988@126.com。