劉芬，李勇，彭菲菲，胡國文，熊加悅，婁遠蕾，曾振國，邵強，錢克儉(、南昌大學第一附屬醫(yī)院重癥醫(yī)學科，江西南昌0006；、南昌大學第一附屬醫(yī)院腫瘤科，江西南昌0006；、南昌大學第二附屬醫(yī)院腦外科，江西南昌0006；、北京大學醫(yī)學部護理學院0級6班，北京009；、南昌大學第一附屬醫(yī)院泌尿外科研究所，江西南昌0006)

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iPSC-MSC來源的外泌體對LPS刺激肺泡巨噬細胞產(chǎn)生炎性因子的影響

劉芬1，李勇2，彭菲菲1，胡國文3，熊加悅4，婁遠蕾5，曾振國1，邵強1，錢克儉1
(1、南昌大學第一附屬醫(yī)院重癥醫(yī)學科，江西南昌330006；2、南昌大學第一附屬醫(yī)院腫瘤科，江西南昌330006；3、南昌大學第二附屬醫(yī)院腦外科，江西南昌330006；4、北京大學醫(yī)學部護理學院2015級6班，北京100191；5、南昌大學第一附屬醫(yī)院泌尿外科研究所，江西南昌330006)

摘要：目的探討iPSC-MSC來源的外泌體（exosome，Exo）對LPS刺激的肺泡巨噬細胞釋放炎性因子的作用。方法采用旋轉(zhuǎn)超濾法提純iPSC-MSC外泌體，以無外泌體培養(yǎng)基培養(yǎng)肺泡巨噬細胞NR8383，分別給予Exo(50μg/ml)、LPS(50ng/ml)、LPS(50ng/ml)+Exo(50μg/ml)培養(yǎng)24h，以不含Exo和LPS培養(yǎng)為對照組，利用酶聯(lián)免疫標記法（ELISA）檢測各組上清液中TNF-α、IL-1β、IL-6蛋白濃度。結(jié)果提取物經(jīng)透射電鏡觀察為圓形或半圓形囊泡，直徑40~100nm，表達Exo標志物CD9和CD63；LPS組上清液中TNF-α、IL-1β和IL-6的濃度（435.38±36.31pg/ml、319.76±39.14pg/ml和408.33±43.44pg/ml）與空白對照組（37.48±8.75pg/ml、33.51±7.88pg/ml和37.73±8.46pg/ml）和Exo組（38.71±9.14pg/ml、32.05±6.81pg/ml和42.84±6.54pg/ml）比較顯著上調(diào)（P<0.01）；LPS+Exo組TNF-α、IL-1β和IL-6的濃度（369.30±32.74pg/ml、249.23±36.77pg/ml和328.91±46. 45pg/ml）與LPS組相比，明顯減少（P<0.05）；空白對照組與Exo組的TNF-α、IL-1β和IL-6的濃度無顯著性差異。結(jié)論成功富集Exo；iPSC-MSC來源的Exo可抑制LPS誘導的肺泡巨噬細胞表達炎性因子。

關(guān)鍵詞：外泌體；肺泡巨噬細胞；膿毒癥肺損傷；炎癥因子；旋轉(zhuǎn)超濾法

膿毒癥肺損傷是臨床危重病患者常見的并發(fā)癥和重要的死亡原因之一，大量巨噬細胞在肺內(nèi)浸潤、聚集、活化，導致炎性介質(zhì)和細胞因子失控性釋放是膿毒癥肺損傷發(fā)生發(fā)展過程的重要因素，調(diào)控肺內(nèi)炎性介質(zhì)和細胞因子的大量釋放是膿毒癥肺損傷治療的關(guān)鍵。

Exo是細胞分泌的一種囊泡狀小體，通過旁分泌或內(nèi)分泌到達受體細胞，如免疫細胞、內(nèi)皮細胞和腫瘤細胞，將所攜帶的內(nèi)容物，包括蛋白、脂質(zhì)或RNA等轉(zhuǎn)移到受體細胞，從而參與細胞信號傳導、免疫調(diào)節(jié)、損傷與修復、物質(zhì)代謝等各種病理生理過程[1-3]。外泌體獨特的生物結(jié)構(gòu)和廣泛的生物學功能日益受到研究者的重視。近來研究發(fā)現(xiàn)，間充質(zhì)干細胞來源的Exo作用于THP-1細胞可明顯增強抗炎因子IL-10、TGF-β的表達，降低促炎因子IL-1、IL-6、TNF-α的表達[4]。間充質(zhì)干細胞來源的Exo也可明顯降低心肌缺血再灌注過程中的炎癥反應，減輕心肌損傷[5]。但間充質(zhì)干細胞外泌體能否作用于肺巨噬細胞發(fā)揮抗炎作用還不清楚。本研究探討誘導性多能干細胞（iPSC）分化而來的間充質(zhì)干細胞（MSC）分泌的Exo對LPS刺激的肺泡巨噬細胞炎癥的影響，以期尋找膿毒癥肺損傷治療的新思路。

1　材料與方法

1.1細胞、試劑和儀器肺泡巨噬細胞株NR8383購自上海中國科學院細胞庫；iPSC-MSC細胞株由上海交通大學附屬第六醫(yī)院四肢顯微外科實驗室惠贈；胎牛血清：Gibco公司；Ham F-12K培養(yǎng)基和LPS（E.coli，O111：B4）均購自Sigma-Aldrich公司；BCA蛋白分析試劑盒：南京諾唯贊生物科技有限公司；兔抗大鼠CD9、CD63單克隆抗體：Abcam公司；辣根過氧化物酶（HRP）標記的羊抗兔IgG：中杉金橋；SuperSignal West Femto化學發(fā)光底物：Thermo；腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、白細胞介素(IL-1β、IL-6)和酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)檢測試劑盒均購自上海依科賽生物制品有限公司；Model8050旋轉(zhuǎn)超濾儀、100000NWCO超濾膜和0.22μm過濾器均購自Millipore公司；H-7650透射電子顯微鏡：Hitachi公司；高分辨率可調(diào)電阻脈沖生物顆粒檢測儀：Izon公司；化學發(fā)光成像分析儀：GE Healthcare公司。

1.2實驗方法

1.2.1外泌體的提取iPSC-MSC以含1ng/ml

bFGF、10%胎牛血清的低糖DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)，收集細胞培養(yǎng)上清液約50ml于離心管中，4℃300×g離心10min，取上清，棄殘余細胞，2000×g離心20min除去細胞碎片，收集上清經(jīng)0.22μm孔徑的過濾器過濾后，將過濾液加入裝有100 000 NWCO超濾膜的Model 8050旋轉(zhuǎn)超濾儀中，接通氮氣，控制最大進氣壓力在517.125kPa以下，啟動磁力攪拌器，使渦旋高度為1/3液體高度。待上清液超濾完畢，加入50ml PBS重復超濾。3次超濾完畢后，用0.5ml PBS懸浮超濾膜上的外泌體，并轉(zhuǎn)移至1.5ml的EP管中，-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2外泌體的形態(tài)特征觀察取20μl外泌體懸液，滴于孔徑為2nm的載樣銅網(wǎng)上，室溫靜置3min，用濾紙從濾網(wǎng)側(cè)邊吸干液體后，滴加3%磷鎢酸溶液30μl，室溫負染5min，用濾紙吸干負染液，室溫干燥，將銅網(wǎng)置于透射電鏡的樣品室內(nèi)，觀察外泌體形態(tài)并拍攝透射電鏡照片。

1.2.3外泌體直徑的檢測使用iZON顆粒分析儀檢測外泌體的直徑。首先使用標準品標準化設(shè)備，然后將樣品用PBS緩沖液稀釋100倍，混勻，按操作要求將100μl稀釋液注入加樣板中，隨后進行檢測樣品顆粒的直徑。

1.2.4外泌體特異性蛋白分析采用RIPA裂解液提取外泌體內(nèi)的蛋白質(zhì)，通過BCA法確定各組蛋白的濃度。取外泌體蛋白30μg經(jīng)電泳分離后轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜，分別加稀釋后兔抗CD9、CD63單克隆抗體，4℃過夜。分別滴加HRP標記的羊抗兔IgG，室溫1h，化學發(fā)光底物檢測雜交信號，化學發(fā)光成像分析儀上觀察條帶顯影并拍照。

1.2.5肺泡巨噬細胞的培養(yǎng)及處理NR8383細胞以含1.5g/L碳酸氫鈉、15%去LPS胎牛血清的Ham F-12K培養(yǎng)基于37℃、5%CO2的溫濕培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，3～4d傳代1次。取生長狀態(tài)良好的細胞隨機分四組：空白對照組（培養(yǎng)基中不含LPS和Exo），Exo組（培養(yǎng)基中含Exo 50μg/ml），LPS組（培養(yǎng)基中含LPS 50ng/ml），LPS+Exo組(培養(yǎng)基中含LPS 50ng/ml和Exo 50μg/ml)，各實驗組以去外泌體血清培養(yǎng)NR8383巨噬細胞，24h后收集細胞上清液，按照ELISA試劑盒說明書檢測各組細胞上清液中TNF-α、IL-1β、IL-6蛋白濃度。細胞培養(yǎng)過程中均使用去熱源的耗材。

1.3統(tǒng)計學處理以上實驗重復三次，實驗數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差表示，采用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件對實驗結(jié)果進行單因素方差分析比較，P<0.05為有統(tǒng)計學意義。

2　結(jié)果

2.1外泌體的形態(tài)學特征透射電子顯微鏡下，iPSCs-MSCs來源的的外泌體為圓形或橢圓形的膜性小囊泡，直徑多為40～90nm之間，可見特征性杯狀囊泡。高分辨率可調(diào)電阻脈沖檢測樣品顆粒直徑，TRPS結(jié)果顯示顆粒直徑的眾數(shù)為90nm，平均直徑為130nm，證實提取物為外泌體（圖1）。

圖1　外泌體形態(tài)學特征和大小

2.2外泌體標志物CD9、CD63蛋白表達情況蛋白免疫印跡實驗結(jié)果顯示，iPSCs-MSCs和iPSCs-MSCs來源的Exo均表達CD9及CD63蛋白，而新鮮培養(yǎng)基中不表達（圖2）。

圖2　外泌體表面標志物CD9、CD63呈陽性表達

2.3外泌體對巨噬細胞炎癥因子表達的影響各實驗組上清液檢測結(jié)果顯示：Exo組肺泡巨噬細胞分泌TNF-α、IL-1β和IL-6的濃度分別為38.71± 9.14pg/ml、32.05±6.81pg/ml和42.84±6.54pg/ml，與空白對照組（37.48±8.75pg/ml、33.51±7.88pg/ml和37.73±8.46pg/ml）比較無顯著性差異；LPS組上清液中TNF-α、IL-1β和IL-6的濃度為435.38± 36.31pg/ml、319.76±39.14pg/ml和408.33±43.44pg /m l，顯著高于空白對照組和Exo組；LPS+Exo組三種因子生成的濃度分別是369.30±32.74g/ml、249.23±36.77g/m l和328.91±46.45g/ml，相比于LPS組明顯減少，表明iPSC-MSC來源的外泌體可以抑制LPS誘導的肺泡巨噬細胞分泌炎性因子的活性，減少炎性因子的產(chǎn)生。

圖3　外泌體作用于LPS刺激大鼠肺泡巨噬細胞24h后上清液中TNF-a、IL-1β和IL-6的表達情況

3　討論

外泌體是細胞內(nèi)晚期內(nèi)泡小體出芽、膜融合的方式形成并分泌到細胞外環(huán)境，由Johnstone等[6]于1987年首次在網(wǎng)織紅細胞培養(yǎng)上清液中分離得到，隨后陸續(xù)報道其他細胞也可以分泌外泌體，如免疫細胞、各種干細胞、腫瘤細胞，并相繼在血液、肺泡灌洗液、唾液、尿液發(fā)現(xiàn)外泌體的存在[7-9]。不同細胞來源的外泌體大多表達雙層膜結(jié)構(gòu)中跨膜蛋白CD9、CD10、CD53、CD63、CD81、熱休克蛋白系Hsp70和Hsp90等保守蛋白[10]。本研究中，我們采用旋轉(zhuǎn)超濾法提取iPSC-MSC上清液中的外泌體。旋轉(zhuǎn)超濾法分離外泌體是利用超濾膜孔徑對不同相對分子質(zhì)量的物質(zhì)進行篩選的原理，將溶劑及部分小分子物質(zhì)與大于膜孔徑的高相對分子質(zhì)量物質(zhì)分開，從而達到分離的目的，與常規(guī)的超速離心法、免疫磁珠法比較，具有可減少外泌體破裂，提高提取量，保護活性，快速高效，便捷等優(yōu)點[11]。通過蛋白免疫印跡檢測顯示外泌體特異性蛋白CD9和CD63陽性，而對照組陰性，說明我們成功提取到iPSC-MSC分泌的外泌體。

外泌體可攜帶多種微小RNA及蛋白活性因子在細胞間穩(wěn)定存在并傳遞信息，在各種生理病理過程中發(fā)揮重要的生物學作用[12，13]。越來越多的研究表明外泌體具有調(diào)控炎癥的作用。研究發(fā)現(xiàn)胎牛血清中的外泌體可以減少LPS誘導的巨噬細胞產(chǎn)生IL-1β[14]；間充質(zhì)干細胞來源的外泌體可以抑制缺氧誘導的小鼠肺動脈高壓模型的肺臟炎癥反應[15]；樹突狀細胞分泌的外泌體可以減輕內(nèi)毒素誘導的小鼠炎癥[16]，但是有關(guān)外泌體影響巨噬細胞分泌活性的報道目前較少[17]。我們的研究結(jié)果顯示，iPSC-MSC來源的外泌體作用于LPS刺激的肺泡巨噬細胞24h，可明顯抑制TNF-α、IL-1β、IL-6蛋白的表達，減少炎性因子的釋放，實驗結(jié)果有助于為臨床干擾膿毒癥病理生理過程中炎性細胞因子分泌失控的研究提供新的線索，我們將在后續(xù)研究中深入探討其作用機制。

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The effect of exosomes derived from iPSC-MSC on secretion of inflammation factor from LPS treated alveolar

macrophage

LIU Fen1，LI Yong2，PENG Feifei1，HU Guowen3，XIONG Jiayue4，LOU Yuanlei5，ZENG Zhenguo1，SHAO Qiang1，QIAN Kejian1.1.Intensive Care Unit of the First Affiliated Hospital of Nanchang University，Nanchang 330006，China；2.Department of Oncology of the First Affiliated Hospital of Nanchang University，Nanchang 330006，China；3.Department of Cerebral Surgery of the Second Affiliated Hospital of Nanchang University，Nanchang 330006，China；4.Class 6，Grade 2015，Nursing College，Health Science Center，Peking University，Beijing 100191，China；5.Institute of Urinary Surgery of the First Affiliated Hospital of Nanchang University，Nanchang 330006，China.

Abstract：Objective To investigate the effect of exosomes secreted by iPSC-MSC on the inflammatory factors release of alveolarmacrophage induced by LPS.M ethods Exosome(Exo)was isolated from supernatant culturemedium of iPSCs-MSCsby ultrafiltrationmethod.Alveolarmacrophage NR8383 was cultured with exosome-free fetal bovine serum，Exo(50μg/ml)，LPS(50ng/ m l)，LPS(50ng/m l)+Exo(50μg/ml)were added into the culturemedium,and these three culturemannerswere defined as Exo group，LPSgroup and LPS+Exo group.After 24h，the TNF-α，IL-1βand IL-6 of the culture supernatantwere detected by ELISA.Result Rounded and oval vesicles were observed by transmission electron microscope，and the diameter was about 40-100nm.CD9 and CD63 proteinswere detected on the vesicles’membrane.In LPSgroup，the concentrations of TNF-α，IL-1βand IL-6(435.38±36. 31，319.76±39.14 and 408.33±43.44pg/m l)were higher than those in control group(37.48±8.75，33.51±7.88 and 37.73±8.46pg/m l) and Exo group(38.71±9.14，32.05±6.81 and 42.84±6.54pg/m l)(P＜0.01).Compared with LPS group，the concentrations of TNF-α，IL-1βand IL-6(369.30±32.74，249.23±36.77 and 328.91±46.45 pg/m l)were significantly reduced in LPS+Exo group(P<0.05)；there was no difference between them in control group and Exo group.Conclusion Exosomeswere successfully enriched，and exosomes derived from iPSC-MSC can alleviate the inflammation effectof alveolarmacrophages induced by LPS.

Key words：Exosomes；Alveolarmacrophage；Sepsis-associated lung injury；Inflammatory factor；Stirring ultrafiltration

通信作者：錢克儉，男，1961年6月生，博士，主任醫(yī)師，重癥醫(yī)學，主要從事膿毒癥肺損傷的基礎(chǔ)和臨床研究，Email：qiankejianicu@163.com

作者簡介：劉芬，女，1975年12月生，博士，主任醫(yī)師，重癥醫(yī)學，主要從事多器官功能障礙的基礎(chǔ)與臨床研究

基金項目：國家自然科學基金（81460292）、國家自然科學基金（81560306）

DOI：10.3969/j.issn.1674-1129.2016.01.002

中圖分類號：R631，R446.62

文獻標識碼：A

文章編號：1674-1129(2016)01-0004-04