劉建麗，趙　吉，武琳慧（內蒙古大學環(huán)境與資源學院，呼和浩特010021）

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烏梁素海湖濱濕地硫酸鹽還原菌種群分布

劉建麗，趙吉，武琳慧*
（內蒙古大學環(huán)境與資源學院，呼和浩特010021）

摘要：采用克隆文庫構建和實時定量PCR技術，對烏梁素海湖濱濕地小河口陸向演化蘆葦沉積物、湖濱沼澤水蔥沉積物、湖濱堿蓬鹽堿化草甸土壤、湖岸白刺荒漠化土壤等環(huán)境中硫酸鹽還原菌（Sulfate reducting bacteria，SRB）多樣性及其豐度進行了研究。結果顯示：上述沉積物和土壤環(huán)境中硫酸鹽還原菌功能基因apsA豐度存在顯著差異，每克土壤中基因豐度（拷貝數）分別為1.34×107、8.07×105、5.27×106和2.37×104；系統發(fā)育樹分析表明，硫酸鹽還原菌屬于變形桿菌門（Proteobacteria）中的五個科，分別為Acidithiobacillales、Desulfurella、Chromatiales、Desulfovibrionaceae和Desulfobacteriaceae，其中Chromatiales、Desulfovibrionaceae和Desulfobacteriaceae為優(yōu)勢菌群。沉積物和土壤環(huán)境中硫酸鹽還原菌群落及apsA基因豐度存在顯著差異，硫酸鹽還原菌多樣性與土壤總鹽量、含水率及硫酸鹽濃度之間存在顯著相關（P＜0.05）關系。

關鍵詞：湖濱濕地；硫酸鹽還原菌；群落結構；功能基因apsA

劉建麗，趙吉，武琳慧.烏梁素海湖濱濕地硫酸鹽還原菌種群分布[J].農業(yè)環(huán)境科學學報, 2016, 35（2）：358-363.

烏梁素海作為典型的淺草型湖泊濕地，在調節(jié)周圍氣候、維持生物多樣性等方面起著至關重要的作用。近年來大量農灌退水和工業(yè)及生活污水的排入，導致水體呈現重度富營養(yǎng)化[1]。大型水生植物異常生長，湖泊周圍土壤鹽堿化現象嚴重，而且湖泊沼澤化趨勢明顯，水體生境受到破壞，水生態(tài)系統良性循環(huán)受阻[2]。面對烏梁素海濕地嚴重的水體富營養(yǎng)化及土壤鹽堿化等問題，探究該環(huán)境中微生物群落結構變化及其多樣性是目前研究熱點之一。

硫酸鹽還原菌（Sulfate reducting bacteria，SRB）的存在代表了厭氧環(huán)境的發(fā)生，其種群數量的多少一定程度上反映了厭氧程度的高低。水體富營養(yǎng)化及土壤鹽堿化極易導致水體深層溶解氧降低和土壤結塊，形成還原狀態(tài)有機物無機化不完全，硫酸鹽還原形成硫化氫氣體，因此硫酸鹽還原菌種群數量多少在一定程度上有指示作用[3]。隨著生物學技術的不斷發(fā)展，研究發(fā)現SRB形態(tài)各異、營養(yǎng)類型多樣，在厭氧及微氧環(huán)境中都可以將硫化物作為電子受體進行新陳代謝[4-6]。但烏梁素海湖濱濕地環(huán)境中SRB功能菌群的分布和基因豐度目前知之甚少，硫酸鹽還原菌功能基因apsA能夠編碼腺苷酰硫酸還原酶的α-亞基（αsubunit of adenosine -5' -phosphosulfate reductase reductase），該酶能將SO2-4還原為SO2-3[7]，在硫循環(huán)過程中起主導作用。故本研究通過克隆文庫構建和實時定量PCR技術分子手段，對烏梁素海湖濱濕地陸向分布梯度上SRB群落結構及功能基因apsA豐度進行研究，探究在沉積物和土壤環(huán)境中的SRB的多樣性分布及豐度變化，旨在為研究烏梁素海濕地生態(tài)與環(huán)境提供理論基礎，為濕地生態(tài)系統生物評估及生物修復提供數據基礎。

1　材料與方法

1.1研究區(qū)概況及樣品采集

研究區(qū)烏梁素海（108。43'～108。57'E，40。46'～41。03'N）是內蒙古高原干旱區(qū)最典型的淺草型湖泊，它的形成與黃河主流改道有關，是國際關注的濕地生態(tài)系統生物多樣性的重點保護區(qū)之一。研究區(qū)屬典型的溫帶大陸性季風氣候，年均降雨量為215 mm，平均氣溫6.6℃，水生植物共6科6屬11種，植被類型包括：挺水植物蘆葦（Phragmites communis）、寬葉香蒲（Typhaphalatifolia）；沉水植物菹草（Potamogetonerispus）、龍須眼子菜（Potamogeton pectinatus）和藻類；陸生植物以堿蓬和白刺為主[1]。小河口作為接納來自總排干、通濟渠和八排干等農灌退水和工業(yè)及生活污水的污水口，水體富營養(yǎng)化程度明顯，且周邊土壤鹽堿化及荒漠化現象嚴重。因此，以烏梁素海濕地小河口為研究區(qū)域，按照該區(qū)域沉積物、鹽堿化及荒漠化的地域分布特征設置一條陸向分布樣帶，選擇具有代表性的4種類型植物土壤：湖中蘆葦沉積物（108。54'649″E，40。46'367″N）、湖濱沼澤水蔥（Scirpus validus Vahl）沉積物（108。56'692″E，40。456'861″N）、湖濱堿蓬（Suaeda salsa)鹽堿化草甸土壤（108。56'682″E，40。56'863″N）和湖岸白刺（Nitraria tangutorum）荒漠化土壤（108。56'682″E，40。56'863″N），分別采集周圍表層土樣（0～20 cm），相應標記為A1、A2、A3、A4，每個樣點按照“S”型分別設置三個平行樣。樣點分布示意圖如圖1所示。土壤理化性質的測定主要是根據《土壤農化分析實驗教材》[8]和《土壤·水·植物理化分析教程》[9]。

樣品內外做好標記后用封口袋密封，立即用冰袋保鮮，帶回室內分別混勻并分裝，分別于-20℃和-80℃保存。-20℃樣品用于土壤理化性質的測定，-80℃樣品用于分子生物學分析。

圖1烏梁素海采樣點示意圖

Figure 1 Sampling locations in Wuliangsuhai

1.2樣品DNA的提取及PCR擴增

1.3硫酸鹽還原菌克隆文庫的構建

本研究中選取APS7-F和APS8-R引物對硫酸鹽還原菌功能基因apsA的保守片段進行擴增，采用菌落PCR方法鑒定陽性克隆子。將鑒定好的陽性克隆子接種于LB/AMP液體培養(yǎng)基中，37℃過夜培養(yǎng)。菌液保存，送華大基因測序，引物為M13R Forward Primer和M13F Reverse Prime（r

1.4實時定量分析

Illumina EcoTM實時熒光定量PCR儀用于定量分析，引物[11]RH1-aps-F：5'-CGCGAAGACCTKATCTTCGAC-3'和RH2-aps-R：5'-ATCATGATCTGCCAGCGGCCGGA-3'用于樣品的定量擴增，片段大小為190 bp。SYBRRPremix Ex TaqTMⅡ（TRAN，BEIJING）試劑用于定量分析。經優(yōu)化后的SYBRRGreenⅠ檢測反應體系：SYBRRPremix Ex TaqTMⅡ（2×）10.0 μL，上下游引物（10 mmol·L-1）各0.8 μL，DNA模板0.5 μL，加ddH2O至20 μL。反應條件：預變性95℃30 s，35個循環(huán)PCR反應擴增（95℃15 s，63℃31 s）。溶解曲線分析條件為95℃15 s，63℃15 s，95℃15 s。

1.5數據處理及分析

本研究獲得的序列均已通過Sequenin軟件整理并提交，獲取登錄號為：KP337769-KP337883。

運用DOTUR軟件對序列在相似性97%的基礎上進行可分類單元操作（Operational taxonomic units，簡稱OTU），同時獲得Rarefaction等指數。選取代表性的克隆序列，與NCBI在線數據庫（http：//www.ncbi. nlm.nih.gov/）進行比對，選擇覆蓋度和相似度都比較高的序列作為參考序列，通過Cluster W對齊序列，再用MEGA 5.2軟件構建系統發(fā)育樹。

2　結果與分析

2.1基質環(huán)境基本性質

四個樣點土壤性質各不相同，數據表明（表1）：有機碳、總氮和總磷的含量在A3樣地含量最低；水溶性鹽總量按照演化梯度總體上呈上升趨勢；四個樣點土壤pH值均大于8.0，偏堿性；硫酸根的含量介于3.80～7.49 g·kg-1之間；土壤含水率在陸向分布樣帶上呈下降趨勢。

表1　土壤樣品的基本理化性質Table 1 Physical and chemical properties of soil samples

2.2硫酸鹽還原菌群落多樣性

陽性克隆子測序后，共獲得了121條有效序列。在給定的98%的相似水平上將所有獲得的序列通過Dotur軟件來進行OTU的分類，共分為34個OTUs。Rarefaction分析表明，本研究所獲得SRB的生物信息在種水平上，還不能完全地代表真實環(huán)境中硫酸鹽還原菌的多樣性，說明這些樣品中還包含著更多的有待于進一步挖掘的硫酸鹽還原菌，增加取樣量可能會得到更大的多樣性，見圖2。Shannon和Simpon多樣性指數表明，克隆文庫A3的多樣性最高，而A4的多樣性最低。

圖2　 apsA序列Rarefaction曲線Figure 2 Rarefaction curves of apsA gene sequence

本研究所得到的SRB apsA序列分布于5個科（圖3）：Chromatiaceae、Acidithiobacillales、Desulfovibrionaceae、Desulfobacteriaceae和Desulfurella，Desulfobacteriaceae科是主要的分布菌群。Acidithiobacillales屬于Gammaproteobacteria（γ-變形菌綱），其他四個科都屬于Deltaproteobacteria（δ-變形桿菌綱）。然而還有大部分序列沒有高度相似的可培養(yǎng)SRB apsA序列作參考，推測各樣點中可能存在新的硫酸鹽還原菌種群。

2.3硫酸鹽還原菌功能基因apsA豐度

采用實時定量PCR技術對四個樣地中SRB功能基因apsA豐度進行檢測（圖4），結果顯示四個樣地（A1、A2、A3、A4）中硫酸鹽還原菌功能基因apsA豐度存在顯著差異，每克土樣中apsA拷貝數分別為：1.34×107、8.07×105、5.27×106和2.37×104。因為apsA是硫酸鹽還原酶α-亞基的編碼基因，在每個細胞內僅有一個拷貝[12]，所以本實驗測定的aspA豐度能夠確切地反映實際環(huán)境中硫酸鹽還原菌的豐度。apsA豐度的最大值出現在A1，其后依次為A3、A2和A4。

圖3　基于硫酸鹽還原菌功能基因apsA的系統進化樹Figure 3 Phylogenetic tree based on functional apsA gene of sulfate-reducing bacteria

圖4　定量PCR分析功能基因apsA拷貝數Figure 4 Copy number of functional gene apsA in four samples

2.4烏梁素海濕地土壤理化性質與SRB多樣性的相關性分析

以SRB在優(yōu)勢菌群的相對豐度為參數，通過SPSS軟件計算Pearson相關系數，分析土壤理化性質對SRB多樣性的影響（表2）。發(fā)現Desulfobacteriaceae科的相對豐度與土壤總鹽量及含水率之間存在顯著相關（P＜0.05），與其他理化性質相關性不顯著；Desulfurella與硫酸鹽濃度存在顯著相關，與其他理化參數相關性不顯著。

表2　烏梁素海濕地土壤理化性質與SRB多樣性的相關性Table 2 Correlation coefficients between soil physic-chemical properties and SRB relative abundance in Wuliangsuhai wetland

3　討論

硫酸鹽還原菌在土壤、海洋沉積物、淹水稻田土壤、河流、湖泊及一些泥沼等自然環(huán)境中分布廣泛，主要屬于Proteobateria、Nitrospirae、Firmicutes、Thermodesulfobacteria和Euryarchaeota門。目前參與硫酸鹽還原過程的微生物主要有革蘭氏陽性/陰性硫酸鹽還原細菌或古菌，還有部分能將含氮有機物分解為氨并將有機物脫硫后形成H2S。

功能基因apsA定量分析顯示，烏梁素海湖濱濕地陸向分布帶不同植被下，每克沉積物和土壤樣品中apsA基因豐度為2.37×104～1.34×107個拷貝。根據圖3的定量結果，A1功能基因apsA豐度最大（SO2-4濃度7.49 g·kg-1），A4功能基因apsA豐度最?。⊿O2-4濃度7.32 g·kg-1），可以看出硫酸鹽濃度并不是唯一影響apsA基因豐度的因素。

本研究所獲得的SRB屬于變形桿菌門（Proteobac teria）中的五個科：Acidithiobacillales、Desulfurella、Chromatiales、Desulfovibrionaceae和Desulfob-acteriaceae，其中Chromatiales是變形菌門下的一類能夠進行光合作用的細菌。研究發(fā)現硫酸鹽還原菌可以與光營養(yǎng)型微生物共生，硫在這種共生關系中起著電子載體的作用[13]。Desulfovibrionaceae和Desulfoba-cteriaceae都屬于革蘭氏陰性嗜溫不產芽孢型的變形菌門δ-變形菌綱，最早分離的SRB也屬于這一類群，與ε-變形菌關系最近，主要分布于淡水、淡咸水或海水下的污泥或沉積物中，且多數菌株含氫化酶，部分菌株可以利用乙酸和CO2作碳源，通過氫的氧化和以SO2-4作末端電子受體來獲取能量，少數菌株還有生物固氮能力[14]。湖區(qū)沉積物中的硫酸鹽還原菌優(yōu)勢菌群為Desulfovibrionaceae和Desulfobacteriaceae，而在退水區(qū)及荒漠化樣點中優(yōu)勢菌群為Chromatiales。初步推測，隨著濕地的橫向演化，使得湖心與湖岸生態(tài)系統產生差異，進而導致各自環(huán)境中硫酸鹽還原菌類群的差異性，土壤總鹽量、含水率及硫酸鹽濃度可能是造成這一現象的主導因素（P＜0.05）。研究發(fā)現在淹水稻田土壤環(huán)境中，Synthrophobacter、Desulforhabdus和Desulfobacterium sp.為優(yōu)勢物種，鹽沼環(huán)境中由于Cl-和SO2-4的地球化學性質相似，常利用二者的摩爾比對硫酸鹽還原菌進行定性及半定量推測，導致SRB的多樣性較高[15-16]。硫酸鹽還原菌對生態(tài)環(huán)境擾動所做出的快速響應，通過調查環(huán)境中SRB的群落結構，對濕地、礦山廢水污染及油藏等環(huán)境的管理及評估，治理SRB引起的生物腐蝕都有一定的意義。

4　結論

烏梁素海湖濱濕地沉積物環(huán)境中硫酸鹽還原菌群落多樣性高于土壤環(huán)境中硫酸鹽還原菌群落多樣性，荒漠化土壤環(huán)境中群落多樣性和apsA基因豐度都最低。土壤總鹽量、含水率及硫酸鹽濃度對SRB群落分布影響顯著。

參考文獻：

[1]李哲,王平.烏梁素海的環(huán)境問題及對策[J].環(huán)境與發(fā)展, 2014, 26（1）：96-98. LI Zhe, WANG Ping. Environmental problems and solutions Wuliangsuhai[J]. Environment and Development, 2014, 26（1）：96-98.

[2] Emadi M, Baghernejad M. Comparison of spatial interpolation techniques for mapping soil pH and salinity in agricultural coastal areas, Northern Iran[J]. Archives of Agronomy and Soil Science, 2014, 60（9）：1315-1327.

[3] Xiao H. Studies on bacteriology of coastal water in Bohai Bay and the application of bacteria on assessment of the quality of coastal environment[D]. Qingdao：China Ocean University, 2005.

[4] Brioukhanov A, Pieulle L, Dolla A. Antioxidative defense systems of anaerobic sulfate-reducing microorganisms[J]. Current Research, Technology and Education Topics in Applied Microbiology and Microbial Biotechnology, 2010（1）：148-159.

[5] Yu H, Chen C, Ma J, et al. Microbial community functional structure in response to micro-aerobic conditions in sulfate-reducing sulfur-producing bioreactor[J]. Journal of Environmental Sciences, 2014, 26（5）：1099-1107.

[6] Pachiadaki M G, Lykousis V, Stefanou E G, et al. Prokaryotic community structure and diversity in the sediments of an active submarine mud volcano（Kazan mud volcano, East Mediterranean Sea）[J]. FEMS Microbiology Ecology, 2010, 72（3）：429-444.

[7] Suzuki I. Oxidation of elemental sulfur by an enzyme system of Thiobacil-lus thiooxidans[J]. Biochimica et Biophysica Acta, 1965, 104（2）：359-371.

[8]鮑士旦.土壤農化分析[M].北京：中國農業(yè)出版社, 2008. BAO Shi-dan. Soil agro-chemistrical analysis[M]. Beijing：China Agriculture Press, 2008.

[9]張韞.土壤·水·植物理化分析教程[M].北京：中國林業(yè)出版社, 2011. ZHANG Yun. Soil, water and plant physical and chemical analysis[M]. Beijing：China Forestry Publishing House, 2011.

[10] Hiibel S R, Pereyra L P, Breazeal M V R, et al. Effect of organic substrate on the microbial community structure in pilot-scale sulfate-reducing biochemical reactors treating mine drainage[J]. Environmental Engineering Science, 2011, 28（8）：563-572.

[11] Xu X M, Fu S Y, Zhu Q, et al. Depth-related coupling relation between methane-oxidizing bacteria（MOBs）and sulfate-reducing bacteria （SRBs）in a marine sediment core from the Dongsha region, the South China Sea[J]. Applied Microbiology and Biotechnology, 2014, 98（24）：10223-10230.

[12] Aktas D F, Lee J S, Little B J, et al. Effects of oxygen on biodegradation of fuels in a corroding environment[J]. International Biodeterioration and Biodegradation, 2013, 81：114-126.

[13]李永峰,劉曉燁,楊傳平.硫酸鹽還原菌細菌學[M].哈爾濱：東北林業(yè)大學出版社, 2013. LI Yong-feng, LIU Xiao-ye, YANG Chuan-ping. Sulfate reducing bacteria bacteriology[M]. Harbin：Northeast Forestry University Press, 2013.

[14]周德慶,徐士菊.微生物學詞典[M].天津：天津科學技術出版社, 2005. ZHOU De-qing, XU Shi-ju. Microbiology dictionary[M]. Tianjin：Tianjin Science and Technology Press, 2005.

[15] Stubner S. Quantification of Gram-negative sulphate-reducing bacteria in rice field soil by 16S rRNA gene-targeted real-time PCR [J]. J Microbiol Methods, 2004, 57（2）：219-30.

[16]陳慶強,唐媛,楊艷,等.長江口鹽沼硫酸鹽還原菌的分布特征與環(huán)境機制[J].沉積學報, 2012, 30（6）：1088-1098. CHEN Qing-qiang, TANG Yuan, YANG Yan, et al. Distribution pattern of sulfate-reducing bacteria and its environmental mechanism in the saltmarsh of the Yangtze estuary[J]. Acta Sedimentologica Sinica, 2012, 30（6）：1088-1098.

LIU Jian-li, ZHAO Ji, WU Lin-hui.Abundance and diversity of sulfate-reducing bacteria in littoral wetland of Wuliangsuhai[J]. Journal of Agro-Environment Science, 2016, 35（2）:358-363.

Abundance and diversity of sulfate-reducing bacteria in littoral wetland of Wuliangsuhai

LIU Jian-li, ZHAO Ji, WU Lin-hui*
（College of Environment & Resources of Inner Mongolia University, Huhhot 010021, China）

Abstract：Abundance and diversity of sulfate-reducing bacteria（SRB）in sediments and soils from landward transect of Wuliangsuhai were investigated using clone library construction and real-time quantitative PCR（q-PCR）techniques. The abundance of apsA gene was significantly different among four studied samples. It was 1.34×107, 8.07×105, 5.27×106, and 1.34×107copies per gram of sample for landward evolved Phragmites australis sediments, lakeside Scirpus validus Vah sediments, lakeside Suaeda salsa salinized meadow soil, and lakeshore desertificated Nitraria tangutorum soil, respectively. Phylogenetic tree analysis showed that SRB communities in Wuliangsuhai consisted of five families. They were Acidithiobacillales, Desulfurella, Chromatiales, Desulfovibrionaceae and Desulfobacteriaceae in the Proteobacteria phylum. Among them, Chromatiales, Desulfovibrionaceae and Desulfobacteriaceae were dominant. The diversity of SRB was closely correlated with total water soluble salt, moisture content, and sulfate content（P＜0.05）.

Keywords：littoral wetland; sulfate-reducing bacteria（SRB）; community structure; functional gene apsA

*通信作者：武琳慧E-mail：happyleis@sina.com

作者簡介：劉建麗（1988—），女，山西呂梁人，碩士研究生，主要從事環(huán)境微生物學研究。E-mail：ljl2489@sina.com

基金項目：國家自然科學基金項目“蒙古高原沼澤化濕地甲烷及氨氧化菌的空間異質性與環(huán)境功能性研究”（31160129）；內蒙古自然科學基金“蒙古高原濕地參與甲烷循環(huán)微生物群落結構與功能研究”（2012MS0610）

收稿日期：2015-09-18

中圖分類號：X52

文獻標志碼：A

文章編號：1672-2043（2016）02-0358-06

doi:10.11654/jaes.2016.02.021