黃　偉,魯　敏,張　起,安華明*

(1 貴州省園藝研究所,貴陽 550006;2 貴州大學(xué) 農(nóng)學(xué)院,貴陽 550025)

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利用SRAP標(biāo)記分析貴州砂梨資源遺傳多樣性

黃偉1,2,魯敏2,張起2,安華明2*

(1 貴州省園藝研究所,貴陽 550006;2 貴州大學(xué) 農(nóng)學(xué)院,貴陽 550025)

摘要:采用SRAP標(biāo)記技術(shù),對貴州59份砂梨種質(zhì)的遺傳多樣性進(jìn)行分析。結(jié)果表明:(1)篩選的15對SRAP引物共擴(kuò)增出151個位點,其中120個是多態(tài)性位點,多態(tài)百分率為79.47%。(2)POPGENE分析表明,貴州砂梨資源在物種水平上有效等位基因數(shù)(Ne)為1.355 9,Nei’s基因多樣性指數(shù)(H)為0.216 9,Shannon’s信息指數(shù)(I)為0.336 2;在區(qū)域品種群水平Ne=1.261 1,H=0.155 5,I=0.235 2,以黔西南地區(qū)資源的遺傳多樣性最高,六盤水市最低。(3)聚類分析顯示,在遺傳相似系數(shù)0.75處,可將59份砂梨資源分為6個組,聚類分析結(jié)果具有一定的地理區(qū)域特性。研究認(rèn)為,貴州砂梨種質(zhì)具有較為豐富的遺傳多樣性,并表現(xiàn)出明顯的地理區(qū)域特性;SRAP標(biāo)記與ISSR標(biāo)記在揭示貴州砂梨種質(zhì)遺傳多樣性上具有高度的一致性,但SRAP標(biāo)記能在更小的變異范圍內(nèi)揭示更多的遺傳信息。

關(guān)鍵詞:砂梨;種質(zhì)資源;遺傳多樣性;SRAP

梨屬于薔薇科(Rosaceae)梨亞科(Pomoideae)梨屬(PyrusL.)植物,全世界約30多個種[1]。通常認(rèn)為梨屬植物的原種(stock species)起源于第三紀(jì)中國西部或西南部的山區(qū)[2]。貴州位于中國西南部,其雨量充沛、立體氣候明顯、小氣候區(qū)域眾多等獨特的氣候和生態(tài)條件,為梨樹的分布演化提供了多樣的生態(tài)環(huán)境,孕育出了豐富的梨屬植物資源,尤其是極為豐富的砂梨(PyruspyrifoliaNakai)資源[3-6]。本課題組前期工作中基于部分品質(zhì)指標(biāo)及ISSR標(biāo)記,已對貴州部分砂梨種質(zhì)進(jìn)行了初步的遺傳多樣性評價[5-6]。但品質(zhì)指標(biāo)受環(huán)境影響較大,而ISSR作為顯性分子標(biāo)記,其揭示的遺傳信息量相對有限。SRAP分子標(biāo)記技術(shù)[7]針對基因外顯子中GC含量豐富而啟動子、內(nèi)含子中AT含量豐富的特點來設(shè)計引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增,因不同個體的內(nèi)含子、啟動子與間隔區(qū)長度不等而產(chǎn)生多態(tài)性。SRAP技術(shù)簡便、快速、穩(wěn)定并具有高頻率的共顯性,它有效地克服了RAPD技術(shù)重復(fù)性差、SSR引物開發(fā)費時費力以及AFLP技術(shù)復(fù)雜、成本昂貴等缺點。近年來SRAP技術(shù)在果樹遺傳多樣性分析和比較基因組學(xué)研究等方面得到廣泛應(yīng)用[8-11],但在梨屬植物上的應(yīng)用還不多。本研究以廣泛收集的59份貴州砂梨資源為試驗材料,采用SRAP標(biāo)記對其遺傳多樣性及親緣關(guān)系進(jìn)行分析,可與之前ISSR結(jié)果相互印證,為進(jìn)一步促進(jìn)貴州砂梨種質(zhì)資源的科學(xué)保存與合理利用提供依據(jù)。

1材料和方法

1.1材料

59份砂梨種質(zhì)資源(表1)的收集與保存同文獻(xiàn)[6]。材料采自于貴州省梨資源分布較多的縣市,采集一年生枝條進(jìn)行嫁接保存于貴州大學(xué)農(nóng)學(xué)院實驗農(nóng)場。

1.2方法

1.2.1SRAP擴(kuò)增體系優(yōu)化采用改良CTAB法[12]提取各材料幼嫩葉片基因組DNA,樣品質(zhì)量和濃度的檢測參考文獻(xiàn)[6]的方法,并將DNA樣品稀釋至濃度50 ng·μL-1之后用于SRAP擴(kuò)增。

表1　供試材料的信息

續(xù)表1Continued Table 1

編號Code資源名稱Name采樣地點Origin29安順箐口梨ASqingkouli安順市西秀區(qū)XixiuDistrict,AnshunCity30福泉葫蘆梨FQhululi黔南州福泉市FuquanCity,QiannanPrefecture31威寧-1WN-1畢節(jié)地區(qū)威寧縣WeiningCounty,BijiePrefecture32威寧-2WN-2畢節(jié)地區(qū)威寧縣WeiningCounty,BijiePrefecture33威寧大黃梨WNdahuangli畢節(jié)地區(qū)威寧縣WeiningCounty,BijiePrefecture34威寧-3WN-3畢節(jié)地區(qū)威寧縣WeiningCounty,BijiePrefecture35威寧-4WN-4畢節(jié)地區(qū)威寧縣WeiningCounty,BijiePrefecture36黃平-1HP-1黔東南州黃平縣HuangpingCounty,QiandongnanPrefecture37黃平-2HP-2黔東南州黃平縣HuangpingCounty,QiandongnanPrefecture38黃平-3HP-3黔東南州黃平縣HuangpingCounty,QiandongnanPrefecture39黃平-4HP-4黔東南州黃平縣HuangpingCounty,QiandongnanPrefecture40黃平-5HP-5黔東南州黃平縣HuangpingCounty,QiandongnanPrefecture41黃平-6HP-6黔東南州黃平縣HuangpingCounty,QiandongnanPrefecture42臺江-1TJ-1黔東南州臺江縣TaijiangCounty,QiandongnanPrefecture43仁懷-1RH-1遵義仁懷市RenhuaiCounty,ZunyiCity44仁懷-2RH-2遵義仁懷市RenhuaiCounty,ZunyiCity45仁懷-3RH-3遵義仁懷市RenhuaiCounty,ZunyiCity46仁懷-4RH-4遵義仁懷市RenhuaiCounty,ZunyiCity47仁懷-5RH-5遵義仁懷市RenhuaiCounty,ZunyiCity48荔波-6LB-6黔南州荔波縣LiboCounty,QiannanPrefecture49荔波-1LB-1黔南州荔波縣LiboCounty,QiannanPrefecture50荔波-2LB-2黔南州荔波縣LiboCounty,QiannanPrefecture51荔波-3LB-3黔南州荔波縣LiboCounty,QiannanPrefecture52荔波-4LB-4黔南州荔波縣LiboCounty,QiannanPrefecture53荔波-5LB-5黔南州荔波縣LiboCounty,QiannanPrefecture54印江-1YJ-1銅仁地區(qū)印江縣YinjiangCounty,TongrenPrefecture55印江-2YJ-2銅仁地區(qū)印江縣YinjiangCounty,TongrenPrefecture56印江-3YJ-3銅仁地區(qū)印江縣YinjiangCounty,TongrenPrefecture57印江-4YJ-4銅仁地區(qū)印江縣YinjiangCounty,TongrenPrefecture58赫章-1HZ-1畢節(jié)地區(qū)赫章縣HezhangCounty,BijiePrefecture59野生砂梨Pyruspyrifolia黔西南州興義市XingyiCity,QianxinanPrefecture

采用單因素試驗設(shè)計梯度進(jìn)行SRAP體系優(yōu)化,將2×HotMaster PCR Master Mix(北京天根生化科技有限公司,其中包含 20 mmol·L-1Tris-HCl pH 8.3,100 mmol·L-1KCl,3 mmol·L-1MgCl2,500 μmol·L-1dNTP,0.1 U·μL-1Taq聚合酶,以及其他增強(qiáng)劑和穩(wěn)定劑)、引物和DNA模板3因素設(shè)5個水平,各因素水平分別為Master Mix 9.5、10.5、11.5、12.5和13.5 μL;正反向引物各0.6、0.8、1.0、1.2和1.4 μmol·L-1;DNA模板30、40、50、60和70 ng。依據(jù)比較因素梯度的變動,調(diào)整ddH2O量以保證反應(yīng)體系為25 μL。

1.2.2SRAP擴(kuò)增優(yōu)化后的梨SRAP反應(yīng)體系為:25 μL體系中含模板DNA 40 ng,正反向引物濃度各1.2 μmol·L-1,Master Mix 12.5 μL。PCR擴(kuò)增程序為:94 ℃預(yù)變性5 min;94 ℃變性1 min,35 ℃退火1min,72 ℃延伸1 min,共5個循環(huán);再94 ℃變性1 min,52 ℃退火1 min,72 ℃延伸1 min,35個循環(huán);最后72 ℃延伸10 min,4 ℃保存。擴(kuò)增產(chǎn)物用1.8%瓊脂糖凝膠在1×TAE緩沖液中電泳分離,Bio-Rad凝膠成像系統(tǒng)掃描分析。對部分比較模糊的擴(kuò)增產(chǎn)物用6%聚丙烯酰胺凝膠電泳進(jìn)行驗證后記帶。

選用表型差異較大的‘威寧大黃梨’、‘福泉葫蘆梨’和‘興義海子梨-1’作為篩選引物的材料,按照已篩選出來的體系,參照SRAP反應(yīng)程序,從64對引物組合中篩選出帶型好、多態(tài)性高、穩(wěn)定性和重復(fù)性好的引物作為本試驗的SRAP擴(kuò)增引物。

1.2.3數(shù)據(jù)處理與分析按照Clark的方法[13],根據(jù)SRAP擴(kuò)增結(jié)果電泳圖譜中DNA條帶的有無,無帶記為0,有帶記為1,并構(gòu)建二元數(shù)據(jù)矩陣。應(yīng)用POPGENE 1.31[14]軟件進(jìn)行遺傳多樣性參數(shù)分析,計算多態(tài)性引物的多態(tài)位點百分率(PPB)、總等位基因數(shù)(Na)、有效等位基因數(shù)(Ne)、Shannon’s信息指數(shù)(I)、Nei’s基因多樣性指數(shù)(H),并對各參數(shù)進(jìn)行t檢驗來評價SRAP標(biāo)記與ISSR標(biāo)記的差異顯著性,在DPSv7.05軟件中進(jìn)行。用NTSYSpc2.1[15]軟件以Dice相似系數(shù)采用非加權(quán)類平均法(UPGMA)進(jìn)行聚類分析,并進(jìn)行遺傳距離之間的Mantel 相關(guān)性檢驗。

2結(jié)果與分析

2.1引物篩選及多態(tài)性分析

從64對SRAP上下游組合引物中(表2),篩選出15對條帶清晰、多態(tài)性豐富、重復(fù)性好的SRAP引物組合,對59份貴州砂梨種質(zhì)基因組DNA進(jìn)行擴(kuò)增,統(tǒng)計結(jié)果見表3。15對SRAP引物共擴(kuò)增出151條帶,其中多態(tài)性帶120條,多態(tài)百分率為79.47%,說明貴州砂梨種質(zhì)資源遺傳多樣性較為豐富,個體間遺傳差異較大。不同引物組合擴(kuò)增條帶的多態(tài)性百分率不同,引物組合EM2-me6多態(tài)位點百分率最高,為92.25%,而引物組合EM2-me5的多態(tài)位點百分率最低,為 63.64%。64對引物組合對‘興義海子梨-1’的擴(kuò)增產(chǎn)物電泳結(jié)果如圖1所示。

2.2聚類分析

根據(jù)15對SRAP引物對供試材料的擴(kuò)增數(shù)據(jù),以Dice相似系數(shù)采用UPGMA聚類,得到的梨系統(tǒng)關(guān)系樹如圖2所示。在遺傳相似系數(shù)0.75處,可將59份砂梨資源分為6組,其聚類結(jié)果具有一定的地理區(qū)域特性。第Ⅰ組僅有1份黔西南州晴隆縣梨資源;第Ⅱ組包含晴隆‘瓢把梨-2’、‘興義海子梨’、‘安順箐口梨’、‘福泉葫蘆梨’以及‘冊亨金蓋梨’等在內(nèi)的28份梨資源;第Ⅲ組以黔東南州臺江縣以及黃平縣的梨資源為主,此外,還包括來自仁懷市的3份資源以及‘威寧-4’,共11份梨資源;第Ⅳ組以荔波縣以及印江縣的梨資源為主,還包括2份仁懷的梨種質(zhì),以及1份赫章的梨資源,從興義市取材的野生砂梨資源也歸在此類。第Ⅴ組包含‘晴隆-3’、‘晴隆響水梨’以及‘晴隆瓢把梨-1’等3份梨資源;第Ⅵ組為‘威寧大黃梨’和‘威寧-3’。

2.3遺傳多樣性分析

根據(jù)POPGENE軟件對不同區(qū)域品種材料各項遺傳多樣性參數(shù)進(jìn)行分析,結(jié)果(表4)表明,在物種水平上,多態(tài)位點百分率(PPB)為79.47%,有效等位基因數(shù)(Ne)1.355 9,Nei’s遺傳多樣性指數(shù)(H)0.261 9,Shannon’s信息指數(shù)(I)0.336 2。在區(qū)域品種群水平上,以黔西南州遺傳多樣性最高(PPB=70.20%,Ne=1.330 0,H=0.201 9,I=0.312 2),六盤水市最低(PPB=27.15%,Ne=1.178 8,H=0.103 8,I=0.153 8)。

表2　SRAP引物序列

表3　SRAP引物組合的擴(kuò)增結(jié)果及多態(tài)性

M.DL2000;1～64.64對SRAP引物組合

圖2　基于SRAP的59份砂梨種質(zhì)資源的分子聚類分析

區(qū)域品種群Population樣本數(shù)No.ofindividuals有效等位基因數(shù)Meanobservednumberofalleles(Ne)Nei’s遺傳多樣性指數(shù)Nei’sgeneticdiversity(H)Shannon’s信息指數(shù)Shannon’sindexofdiversity(I)多態(tài)位點百分率Percentageofpolymorphicloci(PPB)/%黔西南州Qianxi’nanPrefecture261.33000.20190.312270.20黔東南州QiandongnanPrefecture71.30480.18290.277956.29銅仁地區(qū)TongrenPrefecture41.18380.10800.161529.80遵義市ZunyiCity51.19350.11870.181836.42黔南州QiannanPrefecture71.30850.17780.263948.34六盤水市LiupanshuiCity31.17880.10380.153827.15畢節(jié)地區(qū)BijiePrefecture61.32840.19560.295156.95區(qū)域品種群水平Populationlevel1.26110.15550.235246.45物種水平Specieslevel591.35590.21690.336279.47

表5　基于SRAP砂梨種質(zhì)各區(qū)域的遺傳相似性系數(shù)和遺傳距離

注:上三角為遺傳相似性系數(shù),下三角為遺傳距離。

Note:Nei’s genetic identity(above diagonal) and genetic distance(below diagonal).

2.4區(qū)域品種群分化趨勢和親緣關(guān)系

根據(jù)POPGENE軟件計算的各區(qū)域品種群之間遺傳距離和遺傳相似性系數(shù)結(jié)果(表5),以黔西南州和六盤水市砂梨種質(zhì)資源的遺傳距離最近(0.037 8),相似系數(shù)最高(0.962 9);黔東南州和銅仁地區(qū)的遺傳距離最遠(yuǎn)(0.253 1),遺傳相似系數(shù)最低(0.776 4)。貴州砂梨種質(zhì)在不同區(qū)域品種群之間的平均遺傳距離為0.107 6,平均遺傳相似系數(shù)為0.889 5。

3討論

3.1貴州砂梨種質(zhì)資源的遺傳多樣性

用篩選到的15對引物對貴州59份砂梨種質(zhì)進(jìn)行SRAP-PCR擴(kuò)增,共擴(kuò)增出151條帶,其中多態(tài)性帶120條,平均多態(tài)百分率為79.47%,低于玉蘇甫等[16]的研究結(jié)果(96.95%),但高于趙廣等[17](36.2%)以及齊丹等[18](56.6%)的研究結(jié)果,這與不同研究者所選材料的數(shù)量以及遺傳背景有關(guān),貴州砂梨種質(zhì)資源雖不及新疆梨遺傳背景復(fù)雜[16],但經(jīng)過長期的地理隔離與進(jìn)化,也具有較高的遺傳多樣性,保護(hù)和利用這些地方砂梨種質(zhì)對培育或改良新品種具有重要意義。

將貴州59份砂梨種質(zhì)分為7個區(qū)域品種群采用POPGENE進(jìn)行遺傳多樣性分析,結(jié)果表明黔西南地區(qū)砂梨種質(zhì)遺傳多樣性最高,六盤水市相對較低。將SRAP分析結(jié)果與ISSR結(jié)果[6]進(jìn)行t測驗,發(fā)現(xiàn)二者在多態(tài)性位點百分率(PPB)、有效等位基因數(shù)(Ne)、Nei’s基因多樣性指數(shù)(H)及Shannon’s信息指數(shù)(I)上都沒有顯著性差異(P>0.05),表明SRAP標(biāo)記與ISSR標(biāo)記在揭示貴州砂梨種質(zhì)遺傳多樣性上具有高度的一致性。

3.2貴州砂梨種質(zhì)資源的親緣關(guān)系

通過NTSYSpc2.1對貴州59份砂梨資源進(jìn)行聚類分析,與ISSR聚類結(jié)果類似[6],生態(tài)環(huán)境相似、地理來源相鄰地區(qū)的砂梨種質(zhì)遺傳關(guān)系較近,往往劃分為同一組,具有明顯的地域分布規(guī)律,但‘威寧大黃梨’和‘威寧-3’在SRAP分析中單獨聚為第Ⅵ組,而在ISSR分析中則并未與黃平縣的梨分開;而從遺傳距離看,ISSR標(biāo)記的遺傳距離(0.65～0.88)卻比SRAP標(biāo)記(0.72～0.93)更大;表明相較于ISSR標(biāo)記而言,SRAP標(biāo)記能在更小的變異范圍內(nèi)揭示更多的遺傳信息。這可能是由于SRAP標(biāo)記檢測的是表達(dá)區(qū)域序列ORFs[7],其中外顯子是轉(zhuǎn)錄序列,因此能夠提供比檢測重復(fù)序列間片段的ISSR標(biāo)記更為準(zhǔn)確的信息。

在區(qū)域品種群分化趨勢及親緣關(guān)系分析中,SRAP與ISSR結(jié)果也出現(xiàn)了分歧,表現(xiàn)為:SRAP標(biāo)記結(jié)果認(rèn)為黔西南州與六盤水市砂梨種質(zhì)資源的遺傳距離最近(0.037 8),黔東南州與銅仁地區(qū)的遺傳距離最遠(yuǎn)(0.253 1);而ISSR結(jié)果則支持黔西南州與畢節(jié)地區(qū)遺傳距離最近(0.046 5),黔東南州與安順市的遺傳距離最遠(yuǎn)(0.345 3);且2種標(biāo)記產(chǎn)生的遺傳距離矩陣之間并不存在顯著相關(guān)性(r=-0.065 95,P=0.422 3)。用不同的標(biāo)記技術(shù)從不同的水平和角度分析種質(zhì)間的遺傳差異,其結(jié)果就不可能是簡單的重復(fù)或完全的一致,在某些情況下獲得的結(jié)果甚至相互沖突[19-20]。以一種方法代替另一種方法,或以一種方法解釋另一種方法是不妥的,將2種方法結(jié)合起來分析,可以獲得更合理的研究結(jié)果[21]。本研究表明,僅從遺傳距離與地理距離的相互關(guān)系看,SRAP標(biāo)記計算的區(qū)域品種群間遺傳距離大小與地理距離遠(yuǎn)近具有更好的一致性。

本試驗采用SRAP標(biāo)記對貴州59份砂梨種質(zhì)進(jìn)行遺傳多樣性分析,認(rèn)為貴州砂梨資源遺傳多樣性水平高,并表現(xiàn)出明顯的地理區(qū)域特性。SRAP標(biāo)記與ISSR標(biāo)記在揭示貴州砂梨種質(zhì)遺傳多樣性上具有高度的一致性,但SRAP標(biāo)記能在更小的變異范圍內(nèi)揭示更多的遺傳信息。

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(編輯:宋亞珍)

Introduction of the Plant Front Cover:PrimulafilchneraeKnuth

PrimulafilchneraeKnuth is an annual herbal plant belonging to Primulaceae,with a height from 8 to 40 cm.The whole plant is densely covered by white multicellular hairs.Aerial stem short or absent,fibrous root more or less.Leaves forming a rosette,ovate or ovate-lanceolate,with petiole 3.5-15 cm long,2-5 cm wide,obtuse at apex,margin sinuate-crenate,with grey short hair on both sides;petiole 2.5-5.5 cm,obtuse at base.Scapes 8-40 cm,with dense white multicellular hairs,hollow,one to many arising from the rosette.Umbel 3-10(-12) flowered,pedicel 1.5-2.5 cm;bract linear-lanceolate,8-10 mm long;calyx coniform,5-10 mm long,ca.4 mm wide,glandular,parted nearly to the middle,lobes lanceolate,inflated at fruit;corolla purple to pink,tube 5-8 mm,limb 1.5-2.5 cm wide;5-parted at the top,lobes obcordate,apex slightly 2-lobed,pink with violet,colored by obcordate saffron yellow to purple plague.Flowers heterostylous.Pin flowers: stamens at middle of corolla tube;filament short or absent,stamens yellow,style 6-8 mm,slightly higher than annulus.Thrum flowers: style 4-5 mm,stigma green,hidden in stamens.Ovary spherical,ovule multiple,free-central placentation.Capsule subglobose,exocarp membranous,indehiscent or dehiscent at top.Seeds globose,1.5 mm in diam.,brownish-black when maturity,surface wrinkled.Flowers February to April,fruits March to May.

Primulafilchneraeis endemic to China,and is listed as one of the keystone protective species of Shaanxi Province.The species usually grows on moist sandstone soils near natural secondary broad-leaved deciduous forest,900-1 000 m in elevation,with its distribution area somewhat limited.SincePrimulafilchneraeKnuth (Primulaceae) was firstly collected by W.Filchner in 1904,no extant wild population was found in more than one hundred years,which made people believe this species to be extinct.At the present time,only two populations were rediscovered in Hubei Province in 2006,and one population was found in Shaanxi province in 2015.

(Photographed and introduced by ZHANG Jianqiang)

Genetic Diversity ofPyruspyrifoliaResources in Guizhou Province Using SRAP Markers

HUANG Wei1,2,LU Min2,ZHANG Qi2,AN Huaming2*

(1 Guizhou Horticultural Insitute,Guiyang 550006,China;2 Agricultural College,Guizhou University,Guiyang 550025,China)

Abstract:Genetic diversity and genetic relationship of 59 Pyrus pyrifolia germplasm resources distributed in Guizhou Province were analyzed using SRAP markers.The results showed that:(1)15 SRAP primer pairs generated 151 bands and 120 presented polymorphic loci.(2)A relatively high level of genetic diversity was revealed by Ne (mean observed number of alleles) 1.355 9,H(Nei’s genetic diversity) 0.216 9,I (Shannon’s information index)=0.336 2 at species level and by Ne=1.261 1,H=0.155 5,I=0.235 2 at population level.Pear resource in Qianxinan Prefecture showed the highest genetic diversity and that in Liupanshui City showed the lowest.(3)Cluster analysis with UPGMA method showed that 59 P.pyrifolia germplasms could be grouped into six groups at genetic coefficient of 0.75.The result also indicated that P.pyrifolia resources distributed in Guizhou Province had abundant genetic diversity with obvious geographical feature.The genetic diversity and genetic relationship of the P.pyrifolia germplasms could be revealed effectively by SRAP markers,which provided more genetic information in a smaller range of variation as compared to ISSR.

Key words:Pyrus pyrifolia;germplasm resources;genetic diversity;SRAP

中圖分類號:Q343+.5;Q789

文獻(xiàn)標(biāo)志碼:A

作者簡介:黃偉(1983-),男,碩士,主要從事果樹種質(zhì)資源與遺傳育種研究。E-mail:chinacqhw@163.com*通信作者:安華明,博士,教授,主要從事果樹生物技術(shù)與遺傳育種研究。E-mail:anhuaming@hotmail.com

基金項目:貴州省科技攻關(guān)項目[黔科合農(nóng)G字(2009)4003]

收稿日期:2015-07-29;修改稿收到日期:2015-10-09

文章編號:1000-4025(2016)02-0280-08

doi:10.7606/j.issn.1000-4025.2016.02.0280