張　婷,邢　妮,王　超,劉虎岐

(西北農(nóng)林科技大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院,陜西楊陵 712100)

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小花草玉梅正常和自然變異植株的AP3-3基因研究

張婷,邢妮,王超,劉虎岐*

(西北農(nóng)林科技大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院,陜西楊陵 712100)

摘要:野生小花草玉梅(Anemone rivularis var.flore-minore)正常植株和花被片自然變異植株的外觀形態(tài)差異很大,該研究以二者為材料,利用常規(guī)PCR和高效熱不對稱PCR(Hi-Tail PCR)技術(shù)從其正常和變異植株的基因組中各分離得到1個B類基因。序列分析證明,二者隸屬于B類MADS-box基因AP3家族的旁系同源基因AP3-3分枝,分別命名為NArAP3-3(正常植株)和VArAP3-3(變異植株)。NArAP3-3基因全長3 795 bp,VArAP3-3基因全長3 898 bp,二者均含有1個666 bp的開放閱讀框(ORF),可編碼221個氨基酸,具有典型的植物MADS-box基因結(jié)構(gòu),其編碼肽鏈包含了MADS區(qū)、K區(qū)、Ⅰ區(qū)和C區(qū)。對比NArAP3-3和VArAP3-3基因的全長序列,發(fā)現(xiàn)VArAP3-3基因比NArAP3-3多了1段49 bp的插入,且在ORF序列與NArAP3-3基因相比有4個堿基突變。對二者的全長序列、所編碼的221個氨基酸及插入序列的生物信息學(xué)分析顯示,二者在基因啟動子、蛋白質(zhì)基本性質(zhì)、結(jié)構(gòu)功能域、二級三級預(yù)測結(jié)構(gòu)等方面均有差異,推測這些差異可能是花被片變異產(chǎn)生的原因之一。該研究結(jié)果為進一步探索其變異機制奠定了基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞:小花草玉梅;花被片變異;Hi-Tail PCR;MADS-box基因;NArAP3-3和VArAP3-3基因

花是被子植物獨有的非常重要的觀賞及生殖器官。植物花發(fā)育可分為成花誘導(dǎo)、花的發(fā)端、花器官發(fā)育及花型發(fā)育4個階段,分別由花序分生組織特性基因、花分生組織特征基因[1-2]、同源異型基因[3]和背腹特性基因調(diào)控其表達?；ㄆ鞴侔l(fā)育的ABCDE[4-8]模型及“四因子[9-11]”模型可以很好地解釋其形成過程中各同源異型基因的互作?！癆BCDE[4-8]”模型是以核心真雙子葉模式植物為基礎(chǔ)逐步確立的,其花在形態(tài)上具有典型的萼片、花瓣、雄蕊和雌蕊四輪結(jié)構(gòu);而核心真雙子葉植物的花器官發(fā)育模型在基部真雙子葉植物中并不是嚴(yán)格保守的[12-13],基部真雙子葉植物中B功能基因的表達區(qū)域可能擴展到外層導(dǎo)致花瓣狀器官的分化,使外輪器官與內(nèi)層花瓣在形態(tài)上具有一致性。ABCDE 基因中絕大多數(shù)都屬于MADS-box基因[14-15],所以B類MADS-box基因在整個花器官發(fā)育過程中起著十分關(guān)鍵的作用。被子植物B類基因包含AP3和PI兩個進化系,它們是由一個共同祖先基因復(fù)制而來的水平同源基因,編碼的蛋白質(zhì)之間可形成異二聚體,是多種植物花瓣和雄蕊發(fā)育所必需的,且經(jīng)微陣列技術(shù)研究表明,AP3/PI直接調(diào)節(jié)花瓣和雄蕊細胞形成過程中基因的表達。AP3家族包括AP3-1、AP3-2和AP3-3等3個進化枝。目前關(guān)于AP3-3基因的研究較少且主要集中在毛茛科中。有研究表明,AP3-3基因通常只在花瓣中特異性表達且表達水平一般很高[16-17],在耬斗菜[17]和黑種草[17]中沉默AP3-3基因,僅造成其花瓣向萼片的同源異型轉(zhuǎn)變而其他花器官大部分保持不變,這說明了AP3-3基因在控制花瓣形成過程中的關(guān)鍵作用。所以,AP3-3基因被稱為花瓣身份特征基因,在植物花器官變化的研究中具有重要的價值和意義。

小花草玉梅(Anemonerivularisvar.flore-minore)屬毛茛科銀蓮花屬,是基部真雙子葉植物,多年生草本,其正常花的花部集成二歧聚傘花序,花被無分化,由5(～8)枚花被片組成,雄、雌蕊多數(shù)[18]?；空骐p子葉植物中B功能基因表達區(qū)域的外延現(xiàn)象在小花草玉梅花器官發(fā)育中有一定體現(xiàn),它的花被無分化,花被片花瓣化,白色,行使花瓣的功能,這種在進化過程中形成的極似花瓣的花被片很可能也受花瓣特性基因AP3-3的影響。另Kramer研究[19-20]表明,該基因在毛茛科的多數(shù)類群中只決定花瓣的形成,但在銀蓮花族中對花瓣和雄蕊的形成都具有一定的功能。所以,小花草玉梅花被片和雄蕊的形態(tài)變化都可能與AP3-3基因的改變相關(guān)。本研究中花被片自然變異植株除花被片有很大變化外,雄蕊也有一定改變,因此選擇AP3-3基因作為該物種變異植株研究的目標(biāo)基因。本研究利用常規(guī)PCR和Hi-Tail PCR方法,從小花草玉梅正常和花被片自然變異植株中分別克隆得到了NArAP3-3和VArAP3-3基因,并運用生物信息學(xué)對其序列特征及預(yù)測蛋白進行了綜合對比分析,以期探索該變異植株中花被片變異產(chǎn)生的可能原因,為進一步探究其變異機制奠定基礎(chǔ)。

1材料和方法

1.1材料

2014～2015年6～7月間采集于陜西隴縣關(guān)山地區(qū)的小花草玉梅正常和花被片自然變異植株的花及苞葉,立即凍存于液氮中備用。該花被片自然變異植株命名為綠白相間花變異植株(圖1,B)。

菌株E.coliTop10(Tiangen)、克隆載體PMDl9-T(TaKaRa)、PCR Premix(Takara ExTaqTM、CW EsTaq和Tiangen 2×Taq)、DNA提取試劑盒(Tiangen)和膠回收試劑盒(Tiangen)等分別購自相關(guān)試劑公司;引物合成在上海生工生物工程公司。

1.2方法

1.2.1小花草玉梅正常植株和綠白相間花變異植株的花部形態(tài)學(xué)對比以正常和變異植株的花器官標(biāo)本為材料,將其置于培養(yǎng)皿中的濕潤濾紙上,再覆蓋1層濕潤濾紙,后將培養(yǎng)皿封口,靜置3 h后進行花器官各部分分解。分解得到的花被片、雄蕊及雌蕊在尼康體式顯微鏡下觀察,保存結(jié)果。

1.2.2小花草玉梅NArAP3-3和VArAP3-3基因中間序列的擴增按照天根DNA提取試劑盒說明書提取小花草玉梅正常植株和綠白相間花變異植株的基因組DNA。然后根據(jù)此類基因的保守區(qū)域設(shè)計引物進行普通PCR擴增,以期獲得本材料上此類基因的保守序列。普通PCR擴增引物為F(5′-AT-GGGTAGAGGAAAGATTGAGA-3′)和R(5′-CC-ATTTGACATAGCCATTATAGAT-3′)。反應(yīng)體系為:預(yù)混酶10 μL,F、R引物各1 μL,模板DNA 1 μL,加滅菌去離子水至總體積20 μL。擴增條件為:94 ℃預(yù)變性5 min;94 ℃變性30 s,54.5 ℃退火30 s,72 ℃延伸90 s,35個循環(huán);72 ℃延伸10 min。

PCR產(chǎn)物以1%瓊脂糖凝膠電泳回收后連接到pMD19-T載體上,42 ℃熱激轉(zhuǎn)化大腸桿菌TOP10感受態(tài)細胞,經(jīng)Amp抗性篩選和X-gal/IPTG藍白斑篩選后選取白色菌落進行液體培養(yǎng)。PCR反應(yīng)檢測陽性克隆,送上海英駿生物技術(shù)公司進行測序。

1.2.3NArAP3-3和VArAP3-3基因全長序列的獲得根據(jù)上面擴增產(chǎn)物得到的測序結(jié)果(保守序列)設(shè)計巢式引物進行Hi-Tail PCR反應(yīng)。Hi-Tail PCR擴增引物分簡并引物[21]和特異性引物(表1)。本研究直接使用簡并引物L(fēng)AD1-1～LAD1-4與設(shè)計的特異性引物進行組合擴增,篩選出在小花草玉梅擴增效果較為理想的隨機引物。分別以小花草玉梅正常植株和綠白相間花變異植株的基因組DNA為模板進行Hi-Tail PCR擴增,反應(yīng)體系和反應(yīng)條件參考文獻[21],1%瓊脂糖凝膠電泳檢測擴增結(jié)果。

將Hi-Tail PCR的第三輪產(chǎn)物進行膠回收,經(jīng)連接、轉(zhuǎn)化、篩選和鑒定后送公司測序。測序結(jié)果利用Primer Premier 5.0、Megalign等軟件進行分析,在已知序列的5′端方向上選取3′端與已知片段具有完全相同重疊區(qū)域的候選片段進行拼接,而在已知序列的3′端方向上選取5′端與已知片段具有完全相同重疊區(qū)域的候選片段進行拼接,并根據(jù)所獲得的核苷酸序列繼續(xù)向前步移,直到獲得完整的基因序列為止。本實驗經(jīng)3次步移獲得了已知序列的5′端側(cè)翼序列,經(jīng)2次步移獲得了已知序列的3′端側(cè)翼序列(表1),從而得到了基因全長。

小花草玉梅正常植株NArAP3-3基因和綠白相間花變異植株VArAP3-3基因克隆時所用引物基本相同,僅在獲取5′端側(cè)翼序列的第三次步移中有所不同,前者使用3 R∶SP3-1,而后者使用3 R∶SP3-2;二者進行基因克隆時所用程序也基本相同。

1.2.4NArAP3-3和VArAP3-3基因序列的生物信息學(xué)分析Blast搜索正常和花變異植株AP3-3類基因全長序列的同源基因,與本研究所得序列進行多重比對,確定所得基因的CDS序列,運用Gene Structure Display Server 2.0對所得基因全長進行基因結(jié)構(gòu)分析。利用在線網(wǎng)站Http://www.expasy.ch/tools/中的Translate程序?qū)⑺肅DS序列翻譯成氨基酸序列,Blast搜索其同源氨基酸序列,用DNAMAN 8、Megalign軟件進行氨基酸序列的多重比對。使用MEGA 5.1軟件為該序列與其同源基因在DNA和氨基酸水平上構(gòu)建鄰位相連法的系統(tǒng)發(fā)育樹,進行Bootstrap檢測。選擇EXPASY網(wǎng)站及程序進行以下分析:用ProtParam分析翻譯蛋白的基本性質(zhì);ProtScale對翻譯的蛋白進行疏水性分析;SignalIP對翻譯的蛋白序列進行信號肽預(yù)測分析;TMHMM對翻譯的蛋白序列進行跨膜區(qū)分析;NetPhos對推導(dǎo)的氨基酸序列進行磷酸化位點預(yù)測;應(yīng)用HNN對所推導(dǎo)的氨基酸序列進行二級結(jié)構(gòu)預(yù)測;Phyre2 Server對翻譯蛋白序列進行三級結(jié)構(gòu)的初步預(yù)測。此外,對本研究得到的2個基因全長進行了啟動子分析,所用的分析網(wǎng)站為http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/。

表1　Hi-Tail PCR擴增所用引物

Note:V(g,A,C),B(g,T,C),D(g,A,T),N(A,T,g,C).

2結(jié)果與分析

2.1小花草玉梅正常植株和綠白相間花變異植株的花部形態(tài)學(xué)對比分析

正常和變異植株的花器官分解結(jié)果(圖1)表明,正常植株(圖1,A)的花被片共5枚,一輪,形狀近橢圓,邊緣光滑(圖1,G);雄蕊、雌蕊均正常(圖1,C、E)。綠白相間花變異植株(圖1,B)的花被片共31枚,輪數(shù)多輪,外部(圖1,H)的5枚花被片顏色完全變綠,中間(圖1,I、J)的12枚花被片部分變綠,內(nèi)部(圖1,K、L)的14枚花被片保持白色,這些花被片的形態(tài)發(fā)生變化且由外向里逐漸接近雄蕊;雄蕊數(shù)目減少,部分退化,圖1,D中第二排雄蕊均改變,方框所示的3枚雄蕊花藥發(fā)育不全,其余4枚花絲扁平;雌蕊(圖1,F)無明顯改變。

2.2小花草玉梅NArAP3-3和VArAP3-3基因的克隆

據(jù)保守區(qū)域設(shè)計引物進行普通PCR擴增,獲得部分片段(圖2,A、G),測序分析表明該片段為本材料上AP3-3類基因的部分序列。據(jù)所得序列設(shè)計Hi-Tail PCR反應(yīng)特異性引物(表1)進行擴增,獲得了已知序列5′和3′端的側(cè)翼序列,不斷向前步移并相互拼接得到基因全長,獲得的基因全長經(jīng)多次分段單引物驗證及不同引物系統(tǒng)重復(fù)驗證為正確。

在獲得基因全長的整個過程中每一次步移都要進行隨機引物的篩選,篩選結(jié)果及每一次步移的Tail-PCR電泳分析(圖2)結(jié)果可知:B、C為獲得正常植株NArAP3-3基因3′端側(cè)翼序列的2次步移,篩選得到的最佳隨機引物分別為LAD1-4和LAD1-3,D、E、F為獲得NArAP3-3基因5′端側(cè)翼序列的3次步移,篩選得到的最佳隨機引物分別為LAD1-4、LAD1-2和LAD1-2;獲得綠白相間花變異植株VArAP3-3基因全長的H、I和J、K、L同理。

A.正常花;B.變異花;C.正?；ǖ男廴?D.變異花的雄蕊;E.正常花的雌蕊;F.變異花的雌蕊;

Tail-PCR擴增包括3輪超級PCR反應(yīng),B中2和3分別為第一、二輪PCR的產(chǎn)物,4、5、6分別為不同的第三輪引物下該輪PCR的產(chǎn)物;D中10和11分別為第一、二輪PCR的產(chǎn)物,12和13分別為不同的第三輪引物下該輪PCR的產(chǎn)物;K中30為第二輪PCR的產(chǎn)物,31為第三輪PCR的產(chǎn)物;其余的C、E、F、H、I、J和L中的第1孔均為第二輪超級PCR反應(yīng)的產(chǎn)物,而第2、3孔均為第三輪超級PCR反應(yīng)的產(chǎn)物且第2、3孔的引物均不同;圖中所示的第三輪產(chǎn)物中除箭頭標(biāo)注條帶最終成為拼接基因全長序列所用的片段外,其他條帶的測序結(jié)果均可驗證其相應(yīng)箭頭所標(biāo)注目的帶序列的正確性,以確保能得到較為準(zhǔn)確的實驗結(jié)果。

獲得基因全長的Blast比對結(jié)果表明,兩基因分別與不同植物的AP3-3基因有較高一致性,因此分別命名為NArAP3-3基因(正常植株)和VArAP3-3基因(綠白相間花變異植株)。

2.3NArAP3-3和VArAP3-3基因的結(jié)構(gòu)特征

NArAP3-3基因全長3 795 bp,含有長度為1 188 bp(1 344～2 531)的開放閱讀框,CDS編碼序列為666 bp,編碼221個氨基酸,GenBank登錄號為KU230445;VArAP3-3基因全長3 898 bp,含有長度為1 188 bp(1 396～2 583)的開放閱讀框,CDS編碼序列為666 bp,編碼221個氨基酸,GenBank登錄號為KU230446。

對所得基因全長進行基因結(jié)構(gòu)分析,結(jié)果(圖3)表明,二者5′端側(cè)翼序列分別為1 343和1 395 bp,開放閱讀框均包含7個外顯子和6個內(nèi)含子,外顯子所含堿基數(shù)依次為188、67、62、103、42、45和159,且與其他植物的AP3-3基因相比,前6個外顯子非常保守,所含堿基數(shù)基本不變,僅第7個外顯子有較大變動,7號外顯子構(gòu)成C結(jié)構(gòu)域,保守性差。此外,它們在第1個外顯子上均含有一段120 bp左右DNA結(jié)合位點(圖3中方框所示)。

2.4NArAP3-3和VArAP3-3基因系統(tǒng)進化分析

由AP3-3類基因氨基酸序列的多重比對可以看出,NArAP3-3和VArAP3-3具有MADS-box基因家族B類亞家族中AP3基因的典型特征,180 bp左右高度保守的MADS結(jié)構(gòu)域,中度保守的K區(qū)(植物轉(zhuǎn)錄因子的特征結(jié)構(gòu)),保守性差的I區(qū)、C端結(jié)構(gòu)域,以及PI衍生結(jié)構(gòu)域和PaleoAP3結(jié)構(gòu)域(圖4)。比對18個AP3-3類同源基因DNA全長和氨基酸序列,結(jié)果表明,在DNA水平上,NArAP3-3和VArAP3-3基因與大葉鐵線蓮、長瓣鐵線蓮的AP3-3基因相似性最高,均為77%,與其他毛茛科植物AP3-3基因的平均相似性分別為71%和70.5%;在氨基酸水平上,NArAP3-3和VArAP3-3與大葉鐵線蓮的相似性仍最高,分別為75%和74%,與長瓣鐵線蓮的相似性均為71%,而與其他毛茛科植物AP3-3蛋白的平均相似性分別為66%和64.8%。據(jù)DNA全長和氨基酸多序列比對構(gòu)建系統(tǒng)進化樹,從圖5,A可以看出,NArAP3-3和VArAP3-3聚在一起,同時也和大葉鐵線蓮ChAP3-3、長瓣鐵線蓮CmAP3-3聚在一起且置信度很高,這與相似性結(jié)果一致,也與氨基酸序列比對進化樹(圖5,B)所反映出的基因進化關(guān)系基本一致。因此,NArAP3-3和VArAP3-3蛋白均屬于PaleoAP3系,NArAP3-3和VArAP3-3基因均屬于AP3亞家族中的AP3-3基因。

A～F.獲得NArAP3-3基因全長的PCR擴增結(jié)果;G～L.獲得VArAP3-3基因全長的PCR

方框所示區(qū)域為DNA結(jié)合位點

NArAP3-3(KU230445).小花草玉梅正常植株;VArAP3-3(KU230446).小花草玉梅變異植株;ChAP3-3(AGH39918.1)、

2.5NArAP3-3和VArAP3-3基因的啟動子分析

對NArAP3-3和VArAP3-3基因的5′端側(cè)翼序列進行啟動子分析,可知這2個序列除含有啟動子基本元件,如TATA-BOX、CAAT-BOX外,還含有ABA響應(yīng)元件、真菌誘導(dǎo)應(yīng)答元件、缺氧誘導(dǎo)型增強子樣元件,以及參與生理周期調(diào)控、MYBHv1結(jié)合位點、干旱誘導(dǎo)中的MYB結(jié)合位點和多種光響應(yīng)元件等一些其他的調(diào)控序列,初步推測NArAP3-3和VArAP3-3基因的表達受植物激素、光照、生理周期和MYBHv1轉(zhuǎn)錄因子等的調(diào)控。

比較這2個基因的啟動子分析結(jié)果,結(jié)合二者的序列對比(圖6)可知,NArAP3-3和VArAP3-3基因相比,后者在229～277處有一段49 bp的完全插入序列,與其起始密碼子(1 396)相距1 168 bp,由啟動子分析結(jié)果可知,這段插入序列含有7個CAAT框。CAAT框是存在于啟動子及加強區(qū)的普通順式作用原件,顯然這49 bp插入序列所涵蓋的7個CAAT框位于加強區(qū)中,可調(diào)控基因表達水平。

標(biāo)尺代表遺傳距離,各節(jié)點處數(shù)字表示重復(fù)1 000次分析的Bootstrap值;圖中加框為本研究克隆所得基因,其他基因名稱同圖4

A.VArAP3-3與NArAP3-3基因啟動子分析結(jié)果的差異片段;

2.6NArAP3-3和VArAP3-3基因的氨基酸序列差異及其他相關(guān)性質(zhì)分析

對比二者氨基酸序列知其有2個氨基酸的差異,分別為第3位的R→G(即精氨酸Arg變甘氨酸Gly)和第178位的Y→D(即酪氨酸Tyr變天冬氨酸Asp)。這2個氨基酸的變化直接影響其形成蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)。

使用各種程序?qū)Χ咚g蛋白質(zhì)進行蛋白基本性質(zhì)和疏水性分析及跨膜區(qū)、信號肽和磷酸化位點的預(yù)測分析。結(jié)果表明,二者所翻譯蛋白均無信號肽和跨膜區(qū),非分泌蛋白和膜結(jié)構(gòu)蛋白,蛋白質(zhì)形成后不分泌到胞外而留于細胞內(nèi)在胞質(zhì)或核內(nèi)起作用,這與NArAP3-3和VArAP3-3基因作為MADS-box轉(zhuǎn)錄因子基因家族成員,編碼轉(zhuǎn)錄因子蛋白于細胞核內(nèi)結(jié)合DNA來發(fā)揮功能相一致。二者所翻譯蛋白的磷酸化位點無顯著差別,均為7個Ser位點,8個Thr位點和3個Tyr位點。然而,二者所翻譯蛋白的基本性質(zhì)和疏水性有一定差別:NArAP3-3蛋白分子式為C1121H1824N328O345S11,分子量25.8 KD,預(yù)測等電點為9.48(弱堿性蛋白),負電荷殘基總數(shù)29個,正電荷殘基總數(shù)39個,不穩(wěn)定指數(shù)57.43(可認(rèn)為該蛋白不穩(wěn)定);而VArAP3-3蛋白分子式為C1112H1811N325O346S11,分子量25.6 KD,預(yù)測等電點為9.34(弱堿性蛋白),負電荷殘基總數(shù)30個,正電荷殘基總數(shù)38個,不穩(wěn)定指數(shù)為59.79(可認(rèn)為該蛋白不穩(wěn)定);兩蛋白的疏水性分析顯示,NArAP3-3蛋白的總平均疏水指數(shù)為-0.804,而VArAP3-3蛋白的總平均疏水指數(shù)為-0.795,以0為界,正值表示疏水性,負值表示親水性,疏水指數(shù)越大,蛋白疏水性就越強,顯然二者均為親水性蛋白且前者親水性大于后者。

圖7　NArAP3-3(A)和VArAP3-3(B)蛋白三維結(jié)構(gòu)預(yù)測

2.7NArAP3-3和VArAP3-3蛋白的二級結(jié)構(gòu)及三級結(jié)構(gòu)預(yù)測

對NArAP3-3和VArAP3-3基因所推導(dǎo)的氨基酸序列進行二級結(jié)構(gòu)預(yù)測,結(jié)果有一定差異,即二者的二級結(jié)構(gòu)雖然都只有α螺旋(alpha helix,Hh)、延伸鏈(extended strand,Ee)和隨機卷曲(random coil,Cc)3種結(jié)構(gòu),但含量略有不同,前者3種結(jié)構(gòu)成分的含量分別為54.30%、13.57%和32.13%,而后者則分別為54.75%、13.57%和31.67%。對NArAP3-3和VArAP3-3蛋白序列進行三級結(jié)構(gòu)預(yù)測,其初步的同源建模結(jié)果(圖7)表明,二者所譯蛋白的空間結(jié)構(gòu)明顯不同,所以發(fā)揮功能的程度有一定差別。

3討論

經(jīng)觀察,綠白相間花變異植株與正常植株相比,花被片數(shù)目、輪數(shù)顯著增多,形態(tài)由外向里逐漸接近雄蕊,且顏色由白逐漸轉(zhuǎn)綠;雄蕊退化,數(shù)目減少;雌蕊基本不變。 本研究用常規(guī)PCR和Hi-Tail PCR方法克隆得到了小花草玉梅正常和變異植株的AP3-3類基因,分別命名為NArAP3-3和VArAP3-3。DNA全長和氨基酸序列的多重比對及系統(tǒng)發(fā)育樹分析表明,NArAP3-3和VArAP3-3均與不同植物的AP3-3基因有較高的相似性,都含有典型的MIKC結(jié)構(gòu)且在C末端有PI基序和PaleoAP3基序,故判斷NArAP3-3和VArAP3-3為MADS-box家族AP3-3基因的同源基因,與花器官發(fā)育相關(guān)[14-15]。

VArAP3-3與NArAP3-3基因的序列變化:

(1)VArAP3-3基因在5′上游調(diào)控區(qū)(229～277處)有一段49 bp的完全插入序列,包含7個CAAT框,位于啟動子加強區(qū)。位于啟動子加強區(qū)的插入序列可能直接影響該基因的轉(zhuǎn)錄起始頻率和強度,調(diào)控基因的表達量和表達程度,從而使花器官的表型發(fā)生變化。有研究表明,銀蓮花族鐵線蓮屬內(nèi)的花瓣缺失機制可能是由調(diào)控區(qū)變異引起的[22],耬斗菜族扁果草屬的花瓣缺失現(xiàn)象也是由EnraAP3-3基因調(diào)控序列的缺失引起的[17],說明毛茛科植物的花瓣缺失現(xiàn)象與AP3-3基因的調(diào)控區(qū)有很大關(guān)系。所以小花草玉梅變異植株的花器官變化也可能與VArAP3-3基因的調(diào)控區(qū)序列改變相關(guān),本研究結(jié)果為此提供了一定證據(jù)。

另外,研究表明,在植物致病真菌中,目前所發(fā)現(xiàn)的靶標(biāo)基因上調(diào)均與啟動子區(qū)的插入突變有關(guān)。這些插入序列中僅有櫻桃葉斑病菌和灰霉菌中的插入序列被鑒定為反轉(zhuǎn)座子,而其他植物病原真菌如桃褐腐病菌(65 bp插入),蘋果黑星病菌(553 bp插入)和柑橘綠霉病菌(5個126 bp的串聯(lián)重復(fù)和1個199 bp插入)中插入序列的功能屬性并無相關(guān)信息,調(diào)控機制未知[23]。之后發(fā)現(xiàn),某些柑橘綠霉病菌菌株中PdCYP51B基因啟動子區(qū)199 bp的序列插入,本身能夠作為一個強啟動子來發(fā)揮功能,引起PdCYP51B基因的超表迖而賦予菌株抗藥性[23];且CYP51基因啟動子區(qū)發(fā)生的5個126 bp串聯(lián)重復(fù)插入突變,同樣可使CYP51基因過表達而產(chǎn)生抗藥性[24]。此外,在蘋果中,Espley等發(fā)現(xiàn),調(diào)控花青素的轉(zhuǎn)錄因子基因MYB10上游區(qū)域有5個23 bp的正向重復(fù)插入,該插入序列能增強MYB10基因的表達,使花青素增加而產(chǎn)生果肉為紅色的紅蘋果[25]。所以,同樣地,小花草玉梅自然變異植株的表型變化也可能是由于VArAP3-3基因啟動子區(qū)的序列插入導(dǎo)致基因表達上調(diào)所致。

(2)VArAP3-3的CDS序列與NArAP3-3相比有4個堿基突變位點。VArAP3-3基因CDS序列的堿基突變,造成其推導(dǎo)氨基酸及所譯蛋白結(jié)構(gòu)性質(zhì)的變化,可能在花器官中引起相應(yīng)的表型變化。VArAP3-3基因推導(dǎo)氨基酸序列的第3位和第178位發(fā)生了改變,第3個氨基酸位于MADS結(jié)構(gòu)域中,該區(qū)域高度保守,具有與DNA結(jié)合、蛋白質(zhì)二聚體化及與其他蛋白質(zhì)因子相結(jié)合的功能[26],其變化對所譯蛋白質(zhì)的功能有較大影響。本研究結(jié)果表明:NArAP3-3和VArAP3-3蛋白無信號肽和跨膜區(qū),既不分泌到胞外也不成為膜結(jié)構(gòu)成分,而作為轉(zhuǎn)錄因子蛋白于細胞核內(nèi)結(jié)合DNA來發(fā)揮功能;NArAP3-3和VArAP3-3蛋白的分子量、預(yù)測等電點、所含正負電荷殘基數(shù)目都不同,直接影響二者在胞質(zhì)和核內(nèi)的運動及蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性;不穩(wěn)定指數(shù)顯示二者所譯蛋白都為不穩(wěn)定蛋白,且花變異植株中VArAP3-3蛋白更加不穩(wěn)定;總平均疏水指數(shù)顯示NArAP3-3和VArAP3-3蛋白均為親水性蛋白且花變異植株中VArAP3-3蛋白的親水性較正常株中低,說明二者的親水、疏水性氨基酸含量和分布都不同,直接影響其蛋白質(zhì)的空間結(jié)構(gòu),二、三級結(jié)構(gòu)預(yù)測結(jié)果的差異性可證明這一點。顯然,正常植株NArAP3-3和變異植株VArAP3-3蛋白的理化性質(zhì)、穩(wěn)定性與蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)明顯不同,這可能影響蛋白活性及其在細胞中的運動、與其他蛋白質(zhì)因子的結(jié)合、對DNA結(jié)合位點的識別及與DNA結(jié)合的親和性,進而影響蛋白質(zhì)功能的發(fā)揮而造成花的表型變化。

綜上所述,小花草玉梅變異植株中花被片及雄蕊的變化可能與VArAP3-3基因的改變相關(guān)。AP3-3是控制花瓣形成的關(guān)鍵基因,小花草玉梅在進化過程中形成的極似花瓣的花被片可能也受花瓣特性基因AP3-3的影響,且Kramer研究[19-20]表明,該基因在銀蓮花族中影響花瓣和雄蕊的形成,這說明小花草玉梅的變異植株中,花被片及雄蕊的變化可能均與VArAP3-3基因有一定相關(guān)性。VArAP3-3基因調(diào)控區(qū)和編碼序列的變化,可能造成其表達量上調(diào)及所翻譯蛋白的結(jié)構(gòu)性質(zhì)發(fā)生改變,使雄蕊退化減少,退化的雄蕊可能轉(zhuǎn)變成花被片使花被片輪數(shù)及數(shù)目增多。銀蓮花族植物的花瓣形態(tài)與雄蕊相似而與其他毛茛科植物的花瓣有所區(qū)別[22],且本研究中,變異植株增多的部分花被片形態(tài)極似雄蕊,均說明雄蕊變?yōu)榛ū黄怯锌赡艿?此外,有文獻表明,花被片的起源可能晚于雄蕊和心皮,花瓣可能來源于萼片,也可能來源于退化雄蕊[8,14,27],進一步說明雄蕊轉(zhuǎn)變成花被片是有較大可能的。這種初步形成的猜想還需進一步的研究和驗證,小花草玉梅材料新穎,變化多樣,擁有巨大的探索空間,值得繼續(xù)探索和挖掘。

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(編輯:宋亞珍)

Cloning and Sequence Analysis ofAP3-3 Gene in Normal Plant and Natural Variant fromAnemonerivularisvar.flore-minore

ZHANG Ting,XING Ni,WANG Chao,LIU Huqi*

(College of Life Science,Northwest A&F University,Yangling,Shaanxi 712100,China)

Abstract:The study takes normal plant and tepal natural variant which have big differences in appearance as materials from wild Anemone rivularis var.flore-minore.The class B genes were isolated from genomes of normal plant and natural variant by using conventional and Hi-Tail PCR techniques.They were proved to be AP3-3 branch of paralogs which belong to AP3 gene family from B class MADS-box genes by sequence analysis and named NArAP3-3 (in normal plant) and VArAP3-3 (in natural variant),respectively.The full length of NArAP3-3 gene was 3 795 bp whereas 3 898 bp in VArAP3-3,they both have a 666 bp open reading frame (ORF) and can encode 221 amino acids.The protein showed a typical MADS-box gene structure containing MADS domain,K domain,Ⅰ region and C terminus.The comparison result of full length sequences between NArAP3-3 and VArAP3-3 genes was found to have a 49 bp insertion in VArAP3-3 gene,and there are also 4 base mutations in ORF sequence compared with the NArAP3-3 gene.By bioinformatics analysis of the two’s full length sequences,221 amino acids and insertion sequence,we can find that there are differences in all aspects of gene promoter,basic properties of protein,structure function domain,advanced prediction structure and so on.These differences may be one of the causes of tepals variation,and this study lays the foundation for the further exploration of its variation mechanism.

Key words:Anemone rivularis var.flore-minore;tepals variation;Hi-Tail PCR;MADS-box gene;NArAP3-3 and VArAP3-3 genes

中圖分類號:Q754

文獻標(biāo)志碼:A