杜楊建,李瑞民,程思妍,張劍俠,王躍進

(西北農(nóng)林科技大學 園藝學院,旱區(qū)作物逆境生物學國家重點實驗室,農(nóng)業(yè)部西北地區(qū)園藝作物生物學與種質(zhì)創(chuàng)制重點實驗室,陜西楊陵 712100)

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中國野生毛葡萄‘丹鳳-2’3個芪合酶基因表達與功能分析

杜楊建,李瑞民,程思妍,張劍俠,王躍進*

(西北農(nóng)林科技大學 園藝學院,旱區(qū)作物逆境生物學國家重點實驗室,農(nóng)業(yè)部西北地區(qū)園藝作物生物學與種質(zhì)創(chuàng)制重點實驗室,陜西楊陵 712100)

摘要:為了研究中國野生毛葡萄(Vitis quinquangularis Rehd.)‘丹鳳-2’ 3個芪合酶基因的表達與功能,該研究采用同源克隆技術(shù)分離了毛葡萄‘丹鳳-2’3個芪合酶基因VqSTS21、VqSTS30和VqSTS32(GenBank登錄號分別為JQ868677、JQ868668和JQ868666),3個基因的cDNA全長均為1 179 bp,編碼392個氨基酸。以抗葡萄白粉病(Uncinula necator)的毛葡萄‘丹鳳-2’和不抗病的歐洲葡萄‘赤霞珠’為材料分別進行接種白粉菌和ABA、SA、MeJA、高溫、低溫和高鹽脅迫處理,利用實時定量PCR檢測這3個基因在脅迫處理下的表達情況;同時利用農(nóng)桿菌介導法將這3個基因分別轉(zhuǎn)入模式植物煙草中,檢測這3個基因在煙草中的表達產(chǎn)物,分析比較這3個基因的表達功能。結(jié)果顯示:在2個供試材料中,葡萄白粉菌脅迫下芪合成酶VqSTS32誘導表達量高于VqSTS21和VqSTS30;在非生物脅迫處理下,芪合酶基因VqSTS32對高溫處理反應(yīng)最敏感。采用高效液相色譜分析檢測轉(zhuǎn)3個基因煙草的結(jié)果顯示,轉(zhuǎn)VqSTS32基因煙草比轉(zhuǎn)VqSTS30基因煙草植株中白藜蘆醇的累積量高。研究表明,3個基因中VqSTS32具有較高的抗葡萄白粉菌特性并能在轉(zhuǎn)基因煙草中表達出較高的反式云杉新苷產(chǎn)物,這為進一步利用VqSTS32轉(zhuǎn)目的植物葡萄基因研究提供了依據(jù)。

關(guān)鍵詞:葡萄;中國野生葡萄;芪合酶基因;白藜蘆醇;表達分析

歐洲葡萄(VitisviniferaL.)栽培品種由于其優(yōu)質(zhì)、高產(chǎn)與用途多樣,在全球被廣泛栽培。但其突出缺點是抗病、抗逆性差,特別是易感白粉病[1-3],葡萄白粉病[Uncinulanecator(Schw.) Burr.]是嚴重危害葡萄的一種真菌病害,它不僅造成產(chǎn)量的降低,而且影響果實品質(zhì)。

芪合成酶的表達產(chǎn)物白藜蘆醇不僅在植物體內(nèi)是一種植保素,參與植物對外界病原入侵的防御反應(yīng)。而且迄今研究報道葡萄中白藜蘆醇的含量較高,白藜蘆醇不僅在植物體內(nèi)表現(xiàn)抗病,而且葡萄果實及其制品還有抗氧化、抗衰老、抗癌作用[4]。2006年美國科學家又發(fā)現(xiàn)葡萄果實的白藜蘆醇具有防治心血管疾病、防癌的保健作用[5]。當植物在受到真菌侵染、紫外線照射或處于病理狀態(tài)時,白藜蘆醇被誘導積累[6]。白藜蘆醇在葡萄的體細胞中誘導病程相關(guān)蛋白大量累積,提高葡萄的抗病性[7];對心血管代謝及糖尿病人的血管炎癥具有很大改善作用[8-9],此外它還具有控制血小板的聚集[10],有效地抑制低密度脂蛋白的氧化[11]、抑制癌細胞[12]、抗炎活性[13]、抗腫瘤[14]和植物雌性激素作用[15]等功能。

芪合酶是白藜蘆醇代謝中的關(guān)鍵酶[16],能夠促使香豆酸輔酶A和丙二酰輔酶A反應(yīng)形成芪類化合物白藜蘆醇。多數(shù)植物如煙草[17]、小麥[18]、大麥[19]等,在轉(zhuǎn)入外源芪合酶基因后可提高白藜蘆醇積累量,并且能增強自身對一些真菌病害的抗性。

中國作為葡萄屬植物重要的起源地之一,擁有豐富的抗性種質(zhì)資源[1-3],研究這些資源中的抗性基因有重要的研究和利用價值。本課題組段朝輝等2002年利用高效液相色譜法(HPLC)對中國葡萄野生種中11個種或變種共36個株系漿果中的白藜蘆醇含量進行研究[20],其中抗白粉病的毛葡萄‘丹鳳-2’白藜蘆醇的含量很高,可達7.518 μg·g-1,此后史江莉等[21]的研究也發(fā)現(xiàn),毛葡萄‘丹鳳-2’漿果中的白藜蘆積累量較高。

基于芪合酶在白藜蘆醇代謝過程中的重要作用,本研究在史江莉研究的41個芪合成酶基因中,選取了VqSTS21、VqSTS30和VqSTS32這3個芪合成酶基因,利用同源克隆技術(shù)分離獲得了這3個基因cDNA全長;利用生物與非生物因素脅迫處理,研究VqSTS21、VqSTS30和VqSTS32基因的表達差異與功能,進一步通過農(nóng)桿菌介導法將這3個基因轉(zhuǎn)入煙草中,通過HPLC檢測3個轉(zhuǎn)芪合酶基因煙草植株中芪類物質(zhì)表達的含量,以確定毛葡萄3個芪合酶基因VqSTS21、VqSTS30和VqSTS32的表達與功能,篩選芪合酶活性表達較高的基因,為定向改良歐洲葡萄抗病性提供依據(jù)。

1材料和方法

1.1材料與處理

供試材料為西北農(nóng)林科技大學葡萄種質(zhì)資源圃中保存的抗白粉病毛葡萄‘丹鳳-2’與感白粉病歐洲葡萄‘赤霞珠’。生物脅迫是田間選取受葡萄白粉病菌感染的葡萄葉片,利用壓片法[22]將白粉病接種于未感病的‘丹鳳-2’與‘赤霞珠’葉片上,在接種后0、6、24、48、72、96和120 h分別取樣,收集葉片立即置于液氮中冷凍,并于-80 ℃保存,用于提取RNA和獲得芪合成酶cDNA全長分析。

非生物脅迫分別用100 μmol/L水楊酸(SA)、50 μmol/L脫落酸(ABA)和50 μmol/L茉莉酸甲酯(MeJA)以及4 ℃低溫、42 ℃高溫和200 mmol/L NaCl溶液對生長健康的‘丹鳳-2’與‘赤霞珠’進行脅迫,激素誘導后于0、0.5、1、3、6、12和24 h取樣,其余在處理后0、3、6、12、24、48和72 h取樣,收集葉片立即置液氮中速凍,并于-80 ℃保存。

按照前期提交NCBI公布的芪合酶基因VqSTS21、VqSTS30和VqSTS32(GenBank登錄號JQ868677、JQ868668和JQ868666)的cDNA序列,設(shè)計引物擴增和實時定量PCR引物,引物由北京奧科公司合成(表1)。

1.2實驗方法

1.2.1葡萄葉片總RNA提取及其芪合酶基因cDNA全長克隆參照張今今等改良的SDS/酚法[23],提取‘丹鳳-2’幼葉總RNA,參照王西平的方法進行總RNA純化[24],利用瓊脂糖凝膠電泳和Nano Drop檢測總RNA的質(zhì)量與濃度,參照PrimeScriptTMRT reagent Kit試劑盒說明書上的試驗步驟對總RNA進行反轉(zhuǎn)錄。

以毛葡萄‘丹鳳-2’cDNA為模板進行擴增,PCR反應(yīng)條件為:98 ℃預變性10 s,55 ℃變性15 s,72 ℃退火2 min,30個循環(huán);72 ℃延伸5 min,4 ℃保存。瓊脂糖凝膠電泳檢測反應(yīng)產(chǎn)物,利用天根公司DNA回收試劑盒回收后,連接至pGEM-T-easy(大連TaKaRa)并轉(zhuǎn)化Top10感受態(tài)細胞中,在含X-gal和IPTG的100 mg/L Amp平板上藍白斑篩選后,將陽性的重組菌送北京奧科鼎盛測序部測序。

1.2.2實時熒光定量PCR分析分別采取不同時間接種葡萄白粉菌、外源施用ABA、SA、MeJA與高溫、低溫和高鹽非生物因素脅迫下的毛葡萄‘丹鳳-2’和‘赤霞珠’葉片組織總RNA,參照RevertAidTMFirst Strand cDNA Synthesis Kit說明書反轉(zhuǎn)錄為cDNA。根據(jù)VqSTS21、VqSTS30和VqSTS32基因的cDNA序列設(shè)計定量PCR分析引物,葡萄18S rRNA作為內(nèi)參基因(表1)。按照SYBR Premix ExTaqⅡ說明書進行實時定量PCR擴增實驗。

1.2.3植物表達載體構(gòu)建依據(jù)3個基因VqSTS21、VqSTS30和VqSTS32的開放閱讀框兩端序列設(shè)計引物,分別引入SacⅠ與XbaⅠ酶切位點,并分別構(gòu)建到pBI121植物表達載體中,將這3種表達載體利用電轉(zhuǎn)化的方法轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌菌株GV3101,挑取陽性克隆于LB液體培養(yǎng)基培養(yǎng)至對數(shù)生長期,用MS重懸至OD600值為0.4,用作農(nóng)桿菌介導的遺傳轉(zhuǎn)化侵染。

1.2.4農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化煙草及轉(zhuǎn)基因苗的獲得采用農(nóng)桿菌介導的葉盤法轉(zhuǎn)化煙草植株NC89,分別用含有這3個目的基因的農(nóng)桿菌侵染無菌煙草葉片,將侵染過的葉片置于共培養(yǎng)基(MS+200 mg/L NAA+2 mg/L 6-BA)28 ℃黑暗條件下培養(yǎng)2～3 d,而后轉(zhuǎn)移至篩選培養(yǎng)基(MS+200 mg/L NAA+2 mg/L 6-BA+200 mg/L Kan+400 mg/L Carb)進行抗性芽篩選分化,當長出比較明顯的抗性芽時,切下抗性芽再生成苗,此后,轉(zhuǎn)移至生根培養(yǎng)基(MS+200 mg/L Kan+400 mg/L Carb)誘導轉(zhuǎn)基因煙草植株生根,獲得轉(zhuǎn)基因煙草植株。提取轉(zhuǎn)基因煙草基因組DNA,用于PCR分析檢測轉(zhuǎn)基因植株。

表1　本實驗所用引物

1.2.5轉(zhuǎn)基因煙草中的芪類物質(zhì)測定取轉(zhuǎn)基因煙草幼葉1 g,參照周起的方法[25]進行樣品制備與高效液相色譜分析?；旌蠘藰又懈鳂藰油ㄟ^標準曲線保留時間的不同區(qū)分與鑒定,同時通過對比相同保留時間內(nèi)標樣的峰面積與樣品峰面積的比值,計算測定樣品芪合成酶表達產(chǎn)物的含量。芪合成酶基因表達白藜蘆醇產(chǎn)物的不同存在形式與順序是:葡萄素、紫檀芪、反式白藜蘆醇和反式云杉新苷。

2結(jié)果與分析

2.1毛葡萄‘丹鳳-2’VqSTS21、VqSTS30和VqSTS32基因的克隆與序列分析

對提取‘丹鳳-2’葉的總RNA檢測,結(jié)果顯示,提取的RNA沒有發(fā)生降解,純度較高,可用于后期同源克隆以及RT-PCR反應(yīng)(圖1,A)。根據(jù)Gen-Bank中已登錄的毛葡萄‘丹鳳-2’芪合酶基因序列(表2),設(shè)計引物(表1),利用反轉(zhuǎn)錄cDNA作為模板,進行PCR 擴增,獲得約1 200 bp大小的擴增產(chǎn)物(圖1,B),經(jīng)測序分析,獲得了與早期cDNA全長序列一致結(jié)果[21]。

M.Marker Trans 2K Plus;1～3.‘丹鳳-2’幼葉RNA;

通過NCBI(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)網(wǎng)站Blastn對所獲得的基因序列進行比對分析,獲得了目的基因VqSTS21、VqSTS30和VqSTS32全長序列(表2)。通過序列分析,這3個基因均編碼392 bp氨基酸。對這3個基因的氨基酸序列進行同源比對分析(圖2),發(fā)現(xiàn)三者之間同源性很高,其中VqSTS21與VqSTS32的同源性為98.0%,VqSTS21與VqSTS30 以及VqSTS30與VqSTS32間同源性分別為96.7%與97.4%。

2.2葡萄白粉菌誘導后毛葡萄3個芪合酶基因表達分析

經(jīng)接種白粉菌誘導毛葡萄‘丹鳳-2’和‘赤霞珠’后,這3個基因VqSTS21、VqSTS30和VqSTS32,表達方式不同,VqSTS21與VqSTS30雖誘導表達,但表達量較低,而VqSTS32基因表達量隨時間的延長而升高,其表達量在‘赤霞珠’中低于毛葡萄中VqSTS32基因的表達,而VvSTS21、VvSTS30和VvSTS32三者的表達趨勢一致(圖3)。

2.3毛葡萄‘丹鳳-2’的3個芪合酶基因在施用不同外源激素誘導下的表達分析

外源施用ABA、SA和MeJA作為非生物脅迫處理,毛葡萄‘丹鳳-2’3個基因VqSTS21、VqSTS30和VqSTS32的表達隨處理時間的不同而上下波動:ABA處理后6 h,在‘丹鳳-2’中基因VqSTS21受誘導表達最顯著,其表達量在處理6 h后達到最高(圖4,A);而在‘赤霞珠’中,則VvSTS30基因受誘導表達相對略微顯著,其表達量在處理3 h后達到最高,VvSTS32與VvSTS21基因均在處理6 h后表達量達到最高(圖4,B);經(jīng)SA處理,毛葡萄‘丹鳳-2’中的VqSTS21、VqSTS30和VqSTS32基因均誘導表達明顯,三者的表達量在處理12 h后達到最高(圖5,A),此后下降;而在‘赤霞珠’中,3個基因的表達量沒有發(fā)生明顯變化,呈現(xiàn)雙峰,在處理1 h和12 h后其表達量均達到高值(圖5,B);經(jīng)MeJA處理,在‘丹鳳-2’中VqSTS21與VqSTS30的表達量均呈現(xiàn)先升后降的趨勢,在處理后6 h其表達量達到最高,而VqSTS32表達處于相對較低水平(圖6,A);在對照‘赤霞珠’中,VvSTS30與VvSTS32基因均呈現(xiàn)出先下降后上升再下降的表達趨勢,VvSTS21基因的表達較低,但三者的表達量在處理后6 h達到最高(圖6,B)。

表2　毛葡萄‘丹鳳-2’芪合酶基因序列分析

氨基酸序列相同的部分用黑色陰影表示

2.43個芪合酶基因在高鹽、低溫和高溫脅迫處理下的表達模式分析

在高鹽、低溫和高溫的脅迫下,毛葡萄‘丹鳳-2’的3個基因VqSTS21、VqSTS30和VqSTS32的表達水平隨處理時間的不同而不同。在高鹽處理下,基因VqSTS21的表達水平波動最顯著,未處理時表達量最高(圖7,A),經(jīng)處理表達量減少,處理6 h后,處于低水平表達;在 ‘赤霞珠’中,表達量變化最顯著的是VvSTS30基因,在處理12 h后其表達量達到最高(圖7,B)。在高溫處理下,毛葡萄‘丹鳳-2’3個基因中,VqSTS32基因表達較顯著,在處理后48 h,其表達量持續(xù)上調(diào),在48 h達到最高值(圖8,A);在 ‘赤霞珠’中,3個VvSTS基因的表達趨勢不一(圖8,B)。在低溫處理后,毛葡萄‘丹鳳-2’中,3個基因表達量呈現(xiàn)表達增加;在 ‘赤霞珠’中,VvSTS21基因與在‘丹鳳-2’中的表達大體一致,均為逐漸增加,表達量均在處理后72 h達到最高,VvSTS30基因的表達情況也與在‘丹鳳-2’中相一致,即在處理后24～72 h均處于高水平表達,VqSTS32基因則在處理后12～72 h表達較高(圖9)。

圖3　接種白粉病誘導后3個基因在毛葡萄‘丹鳳-2’(A)和‘赤霞珠’(B)中的表達

圖4　外源施用脫落酸誘導后3個基因在毛葡萄‘丹鳳-2’(A)和‘赤霞珠’(B)的表達

圖5　外源施用水楊酸誘導后3個基因在毛葡萄‘丹鳳-2’(A)和‘赤霞珠’(B)中的表達

2.5轉(zhuǎn)芪合酶基因煙草NC89植株的PCR檢測與芪類物質(zhì)含量的測定

3個VqSTS基因利用農(nóng)桿菌介導葉盤法獲得抗卡那霉素的轉(zhuǎn)芪合酶基因煙草NC89植株(圖10),隨機選取10株以及1株陰性對照煙草NC89的嫩葉,以重組載體作為陽性對照,利用PCR分析檢測(圖11);在陽性對照及轉(zhuǎn)基因植株中均可擴增出647 bp的新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶基因NPTII,而陰性對照未擴增出647 bp片段,PCR檢測初步說明3個毛葡萄芪合成酶基因VqSTS已經(jīng)轉(zhuǎn)入了煙草NC89中。

HPLC標準檢測結(jié)果如下:4種芪類化合物(Viniferin,8.776 min;pterostilbene,14.119 min;trans-resveratrol,17.087 min;trans-piceid,26.58 min)均被檢測到(圖12);在轉(zhuǎn)入VqSTS30與VqSTS32的轉(zhuǎn)基因煙草NC89植株中均檢測到反式云杉新苷的存在,其他3種芪類物種均未檢測到(圖13)。在轉(zhuǎn)入VqSTS32基因的轉(zhuǎn)基因煙草NC89植株中反式云杉新苷含量最高,為26.371 μg/g;在轉(zhuǎn)入VqSTS30基因的轉(zhuǎn)基因煙草,反式云杉新苷含量為26.087 μg/g(表3);而在陰性對照和轉(zhuǎn)VqSTS21的轉(zhuǎn)基因煙草NC89植株中均沒有檢測到上述4種芪類物質(zhì)的積累(表3)。

圖6　外源施用茉莉酸甲酯誘導后3個基因在毛葡萄‘丹鳳-2’(A)和‘赤霞珠’(B)中的表達

圖7　高鹽處理下3個基因在毛葡萄‘丹鳳-2’(A)和‘赤霞珠’(B)的表達

圖8　高溫處理下3個基因在毛葡萄‘丹鳳-2’(A)和‘赤霞珠’(B)中的表達

圖9　低溫處理后3個基因在毛葡萄‘丹鳳-2’(A)和‘赤霞珠’(B)中的表達

A.煙草子葉于MS培養(yǎng)基上預培養(yǎng)3 d;B.煙草子盤和農(nóng)桿菌在分化培養(yǎng)基上進行共培養(yǎng);C.1個星期后煙草子葉生長出愈傷;

NT.野生型煙草NC89;T1～T3.轉(zhuǎn)入VqSTS21的煙草NC89株系;

1.葡萄素,保留時間為8.776 min;2.紫檀芪,保留時間為

A.野生型煙草NC89;B.3株轉(zhuǎn)入VqSTS30的煙草NC89株系;C.3株轉(zhuǎn)入VqSTS21的

株系Line葡萄素ε-Viniferin/(μg/g)紫檀芪Pterostilbene/(μg/g)反式白藜蘆醇Trans-resveratrol/(μg/g)反式云杉新苷Trans-piceid/(μg/g)WT----VqSTS21----VqSTS30---26.087VqSTS32---26.371

3討論

改進與提高歐洲葡萄的抗病性是世界葡萄育種者研究的重要課題之一,培育歐洲葡萄品種抗白粉病可以通過雜交育種獲得抗性種質(zhì)[2-3],也可以通過轉(zhuǎn)基因途徑定向改良歐洲葡萄的抗病性[2-4]。自1997年首次報道芪合成酶表達產(chǎn)物白藜蘆醇對人體的健康作用[4]和植物抗病性以來[17-19],研究芪合成酶基因及其表達功能一直是研究的重要方向與領(lǐng)域[21-22]。芪合酶是白藜蘆醇代謝中的關(guān)鍵酶[13],芪類化合物的合成與累積增加了植物的抗病性,這也是近年來國內(nèi)外學者研究植物抗病防御機制和反應(yīng)的核心所在[1-3,17-21,23-24,26-27]。本研究就是根據(jù)芪合成酶基因在植物中具有抗病作用,對人體具有保健作用,毛葡萄‘丹鳳-2’存在著芪合酶基因[21],并且可以在目的植物中表達的特點[22],我們克隆了中國野毛葡萄‘丹鳳-2’3個芪合酶基因VqSTS21、VqSTS30和VqSTS32;通過接種葡萄白粉菌誘導、外源施用ABA、SA、MeJA處理及采用非生物的高溫、低溫和高鹽脅迫處理,研究毛葡萄這3個VqSTS基因的表達特性,進一步將這3個芪合酶基因轉(zhuǎn)入模式煙草中,檢測轉(zhuǎn)基因植物的表達產(chǎn)物與基因功能。研究結(jié)果表明,VqSTS32相較于VqSTS21和VqSTS30在葡萄白粉菌誘導下表達顯著,且VqSTS32轉(zhuǎn)基因煙草NC89植株中芪類化合物反式云杉新苷累積量較高,表明VqSTS32積極參與了葡萄早期的防御反應(yīng),這與Fung等在葡萄中研究白粉菌入侵時,芪合酶基因參與葡萄防御反應(yīng)的基因的表達量會上調(diào)結(jié)果相一致[25]。另一方面,國內(nèi)外學者對生物信號分子ABA、SA 和 MeJA積極的參與植物的生長發(fā)育和防御反應(yīng)也進行了研究[28-29]。植物在受到病原微生物入侵時能夠啟動復雜的信號傳導網(wǎng)絡(luò)來獲得局部和系統(tǒng)性抗性[30],植物信號傳導網(wǎng)絡(luò)中的SA、MeJA 等抗病信號分子被認為是病原菌侵染的次級信號,能提高許多病源菌響應(yīng)基因的表達[31],對模式植物擬南芥的研究表明,SA 信號途徑主要參與抵御生物類脅迫中活體營養(yǎng)型病原物如霜霉病菌、白粉病菌、假單孢桿菌的防衛(wèi)反應(yīng)[32-33],MeJA信號途徑主要參與抵御生物類脅迫中對壞死營養(yǎng)型病原物如灰霉菌、腐霉病菌和土傳病菌等的防衛(wèi)反應(yīng)[34],ABA則廣泛地參與調(diào)控植物生長發(fā)育以及抵抗逆境脅迫的多個方面[35-36]。在植物體內(nèi),各種抗病信號途徑相互拮抗或相互協(xié)同形成一個復雜的信號傳遞網(wǎng)絡(luò)來增加植物的防衛(wèi)能力[37]。植物在生長發(fā)育過程中也常常遭受諸如高溫、低溫和鹽脅迫等逆境脅迫,均會造成對生長發(fā)育的傷害[38]。逆境脅迫諸如高溫、低溫和鹽脅迫均能誘導ABA的合成來增加植物對逆境脅迫的抗性[39-41],植物內(nèi)源ABA能促進能夠充當?shù)诙攀箙⑴c植物脅迫響應(yīng)H2O2產(chǎn)生[42]。本研究表明在 ‘丹鳳-2’與‘赤霞珠’中受到逆境脅迫高溫、低溫和鹽脅迫處理下這3個VqSTS基因均存在誘導,其中VqSTS21基因?qū)Ω啕}的表達明顯,VqSTS32基因?qū)Ω邷氐谋磉_較高,而這3個毛葡萄‘丹鳳-2’芪合酶基因VqSTS基因在高溫、低溫和高鹽的脅迫表現(xiàn)了不同的反應(yīng)與表達。

綜上所述,通過對中國野生毛葡萄‘丹鳳-2’的3個基因VqSTS21、VqSTS30和VqSTS32在接種葡萄白粉病、外源施用小分子物質(zhì)和非生物高鹽、高溫與低溫的脅迫處理下基因表達的比較,篩選出中國野生華毛葡萄‘丹鳳-2’芪合酶基因VqSTS32,該基因受白粉菌誘導表達。我們下一步是將該基因VqSTS32轉(zhuǎn)入優(yōu)質(zhì)不抗病的歐洲葡萄品種中,鑒定該基因的抗白粉病與抗病機理,為今后通過雜交育種和轉(zhuǎn)基因技術(shù),實施定向改良歐洲葡萄的抗白粉病性提供依據(jù)。

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(編輯:宋亞珍)

Expression and Function Analysis of Three Stilbene Synthase Genes fromVitisquinquangularisRehd.Accession ‘Danfeng-2’

DU Yangjian,LI Ruimin,CHENG Siyan,ZHANG Jianxia,WANG Yuejin*

(College of Horticulture,Northwest A&F University,State Key Laboratory of Crop Stress Biology in Arid Areas,Key Laboratory of Biology and Genetic Improvement of Horticultural Crops,Ministry of Agriculture,Yangling,Shaanxi 712100,China)

Abstract:The purpose of this paper is to study the expression and function of VqSTS21,VqSTS30 and VqSTS32 genes,which cloned from powdery mildew-resistant Chinese wild Vitis quinquangularis accession ‘Danfeng-2’.Sequence analysis indicated that their cDNA has equal length of 1 179 bp and encodes 392 amino acid residues (GenBank accession No.JQ868677,JQ868668 and JQ868666).qRT-PCR showed the expression patterns of VqSTS21,VqSTS30 and VqSTS32 in ‘Danfeng-2’ and powdery mildew-susceptible Cabernet Sauvignon (Vitis vinifera L.) under biotic stress (Uncinula necator) and abiotic stress (ABA,SA,MeJA,heat,low temperature and NaCl).HPLC was employed to analysis resveratrol contents of these three genes overexpressed in transgenic tobacco plants.The results showed that the expression of VqSTS32 was higher than that of other two genes in two grape germplasms tested after treated with biotic stress and heat.Compared with the VqSTS21 and VqSTS30-overexpressed lines,trans-resveratrol was the highest accumulation in the VqSTS32-overexpressed lines of transgenic tobacco plants.Our results suggested that VqSTS32 gene was involved in the resveratrol synthesis pathway in grapes,and played an important role in response to U.necator.

Key words:grapevine;Chinese wild Vitis;stilbene synthase gene;resveratrol;expression pattern

中圖分類號:Q789

文獻標志碼:A

作者簡介:杜楊建(1989-),碩士,主要從事果樹育種及生物技術(shù)研究。E-mail:1017066017@qq.com*通信作者:王躍進,教授,博士生導師,主要從事葡萄種質(zhì)資源與生物技術(shù)育種研究工作。E-mail:wangyj@nwsuaf.edu.cn

基金項目:國家自然科學基金(31372039)

收稿日期:2015-10-13;修改稿收到日期:2016-01-24

文章編號:1000-4025(2016)02-0215-10

doi:10.7606/j.issn.1000-4025.2016.02.0215