朱　蕾，李　娟，郭　磊，于曉麗，武丹威，陳　瑋，陳　晨，杜曉婉，張德昌，葉菜英

中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院　北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院　基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所藥理系，北京 100005

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·論著·

羧胺三唑?qū)Υ笫笞魟┬躁P(guān)節(jié)炎的治療作用

朱蕾，李娟，郭磊，于曉麗，武丹威，陳瑋，陳晨，杜曉婉，張德昌，葉菜英

中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所藥理系，北京 100005

葉菜英電話：010- 65597159，電子郵件：caiyingye@126.com

摘要：目的研究羧胺三唑(CAI)對大鼠佐劑性關(guān)節(jié)炎(AA)的治療作用。方法大鼠隨機分為正常對照組、溶劑對照組(聚乙二醇 400組和生理鹽水組)、CAI 3個劑量(10、20、40 mg/kg)組和陽性藥地塞米松(Dex)組。采用弗氏完全佐劑誘導(dǎo)大鼠AA模型，進行關(guān)節(jié)炎評分、后肢X線攝片和組織病理學(xué)檢查，檢測大鼠炎癥足爪組織中腫瘤壞死因子(TNF)-α、白細胞介素(IL)- 1β和IL- 6水平。結(jié)果CAI能明顯降低AA大鼠的關(guān)節(jié)炎指數(shù)，促進其體重的恢復(fù)，改善AA大鼠后肢關(guān)節(jié)放射學(xué)和組織病理學(xué)損傷(P<0.05或P<0.01)。CAI低、中、高劑量組和Dex組可顯著降低TNF-α和IL- 1β水平，CAI中、高劑量和Dex可顯著降低IL- 6水平(P<0.05或P<0.01)。結(jié)論CAI對AA大鼠具有明顯的治療作用，其作用機制可能與其降低炎癥部位的促炎細胞因子有關(guān)。

關(guān)鍵詞：羧胺三唑；佐劑性關(guān)節(jié)炎；細胞因子

ActaAcadMedSin，2016,38(1)：49-54

類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(rheumatoid arthritis，RA)是一種慢性、炎性和系統(tǒng)性的自身免疫性疾病，其主要病理改變是增生性滑膜炎，繼而引起軟骨和骨組織破壞，最終導(dǎo)致關(guān)節(jié)畸形和功能障礙。由于RA的病因和發(fā)病機制迄今未明，目前臨床尚無理想的治療方法[1]。羧胺三唑(carboxyamidotriazole，CAI)是一種非細胞毒類的抗癌藥物，能夠抑制多種腫瘤細胞系的增殖和侵襲，抑制內(nèi)皮細胞增生和腫瘤血管生成[2- 3]。本課題組以往研究發(fā)現(xiàn)，CAI不僅具有抗癌作用，還具有較強的抗炎鎮(zhèn)痛作用[4- 5]，但其能否用于自身免疫性疾病如RA的治療尚未見文獻報道。本課題組前期研究結(jié)果顯示，CAI能夠減輕RA實驗?zāi)Ｐ汀笫笞魟┬躁P(guān)節(jié)炎(adjuvant arthritis，AA)模型的足爪腫脹[4]，在此基礎(chǔ)上，本研究觀察了CAI對AA大鼠的治療作用，探討了其可能的作用機制。

材料和方法

試劑CAI由中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥物研究所合成，以聚乙二醇400(polyethylene glycol 400，PEG 400)配制成所需濃度。地塞米松(dexamethasone，Dex)購自天津金耀氨基酸有限公司，用生理鹽水(normal sodium，NS)稀釋至所需濃度?？ń槊?北京生物制品研究所)，腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor，TNF)-α、白細胞介素(interleukin，IL)- 1β和IL- 6 ELISA檢測試劑盒(上海依科賽生物制品有限公司)。

實驗動物及分組清潔級雄性Lewis大鼠98只，體重180～200 g，購自北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司，常溫環(huán)境飼養(yǎng)[溫度(22±2)℃，濕度40%～70%]，每天照明12 h。動物自由攝食、飲水。采用隨機數(shù)字表方法將大鼠隨機分為7組，每組14只，分別為正常對照(normal control，NC)組，溶劑對照組(PEG 400組和NS組)，CAI低、中、高劑量(10、20、40 mg/kg，灌胃給藥)組和陽性藥Dex(0.2 mg/kg，腹腔注射)組。大鼠于致炎后12 d即炎癥開始出現(xiàn)時給藥，連續(xù)14 d，每日1次，PEG 400組和NS組給予等容量的相應(yīng)溶劑。

AA模型制備將卡介苗置于80℃水浴滅活1 h，以高壓滅菌的液體石蠟配成10 mg/ml乳劑，充分研磨、混勻，即得弗氏完全佐劑(Freund’s complete adjuvant，F(xiàn)CA)。除NC組大鼠，每只大鼠在尾根部2～3點皮內(nèi)注射0.1 ml FCA致炎。NC組大鼠注射等體積的液體石蠟[6]。

關(guān)節(jié)炎評分致炎后12、18、22、26 d，采用關(guān)節(jié)炎評分法觀察多發(fā)性關(guān)節(jié)炎的病變程度，具體如下：(1)0分：正常；(2)1分：輕度紅腫；(3)2分：中度紅腫；(4)3分：嚴重紅腫；(5)4分：腫脹明顯并伴有關(guān)節(jié)強直。每肢最高分數(shù)為4分，四肢之和代表每只大鼠的關(guān)節(jié)炎指數(shù)(arthritis index，AI)，最高值為16分[7]。

關(guān)節(jié)X線檢查致炎后27 d，將大鼠麻醉后進行兩后肢X線攝片，并分別對骨質(zhì)疏松、關(guān)節(jié)間隙狹窄和骨侵蝕3個參數(shù)進行放射學(xué)評分，具體為：(1)0分：正常；(2)1分：輕度改變；(3)2分：中度改變；(4)3分：嚴重改變。計算兩后肢的分數(shù)之和，最高值為6分[6]。

組織病理學(xué)檢查X線檢查后處死大鼠，關(guān)節(jié)組織取材，10%甲醛固定、5%HNO3脫鈣、不同濃度梯度乙醇逐級脫水，石蠟包埋，切片，HE染色，顯微鏡下觀察病理改變并進行評分，具體為：(1)0分：正常；(2)1分：關(guān)節(jié)組織中有少量炎細胞浸潤；(3)2分：滑膜輕度增生，并伴有局灶性炎細胞浸潤；(4)3分：滑膜增厚，排列疏松、紊亂，炎細胞大量浸潤，新生血管明顯增加，伴有少量關(guān)節(jié)軟骨破壞；(5)4分：滑膜增生明顯，血管翳形成，關(guān)節(jié)軟骨和骨組織被嚴重破壞或由纖維結(jié)締組織取代[7]。

足爪組織中細胞因子含量測定大鼠處死后，分離足踝關(guān)節(jié)周圍的皮下組織，制備組織均漿，按照試劑盒說明書采用ELISA方法檢測TNF-α、IL- 1β和IL- 6含量。

統(tǒng)計學(xué)處理采用SPSS 11.5統(tǒng)計軟件，實驗數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準誤表示，采用單因素方差分析后Dunnett’s檢驗進行統(tǒng)計學(xué)處理，P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié)果

CAI對AA大鼠體重的影響致炎前和致炎后12、18、22、26 d分別測量各鼠體重，以致炎前、后體重的差值表示體重的增加(△g=致炎后體重-致炎前體重)。結(jié)果顯示，NC組大鼠的體重在實驗期間持續(xù)增長；與NC組相比，PEG 400組和NS組大鼠于炎癥反應(yīng)期間食欲明顯減退，體重明顯減輕(P均<0.01)；CAI中劑量組在22和26 d，CAI高劑量組在18、22和26 d可緩解AA大鼠體重的減輕(P<0.05或P<0.01)；Dex對AA大鼠體重的減輕無明顯影響(P>0.05)(圖1)。

CAI對AA大鼠AI的影響AA大鼠在致炎后12 d四肢關(guān)節(jié)開始出現(xiàn)炎癥癥狀，AI開始升高，至22 d達高峰(P均<0.01)，表現(xiàn)為四肢關(guān)節(jié)紅腫、變形，并伴有關(guān)節(jié)強直，大部分AA大鼠還可觀察到耳部紅斑和尾部串珠樣結(jié)節(jié)突起。CAI低劑量在22、26 d，CAI中、高劑量和Dex在18、22、26 d可明顯降低AA大鼠的AI(P均<0.01)，減輕全身關(guān)節(jié)病變程度(圖2)。

CAI：羧胺三唑；AA：佐劑性關(guān)節(jié)炎；NS：生理鹽水；Dex：地塞米松；與NC組比較，aP<0.01；與溶劑對照組比較，bP<0.05，cP<0.01

CAI：carboxyamidotriazole；AA：adjuvant arthritis；NS：normal sodium；Dex：dexamethasone；aP<0.01 compared with NC group；bP<0.05，cP<0.01 compared with the vehicle-treated control group

圖1CAI對AA大鼠體重增加的影響

Fig1Effect of CAI on the increase in body weight in AA rats

與NC組比較，aP<0.01；與溶劑對照組比較，bP<0.01

aP<0.01 compared with NC group；bP<0.01 compared with the vehicle-treated control group

圖2CAI對AA大鼠關(guān)節(jié)炎指數(shù)的影響

Fig2Effect of CAI on arthritis index in AA rats

CAI對AA大鼠關(guān)節(jié)放射學(xué)改變的影響與NC組相比，AA大鼠出現(xiàn)明顯骨質(zhì)疏松、關(guān)節(jié)間隙狹窄和骨侵蝕(P均<0.01)，踝及跖趾關(guān)節(jié)邊緣模糊甚至融合，軟組織腫脹明顯。CAI中、高劑量對骨質(zhì)疏松、關(guān)節(jié)間隙狹窄和骨侵蝕均有顯著改善作用(P<0.05或P<0.01)；Dex可減輕關(guān)節(jié)間隙狹窄和骨侵蝕(P<0.05或P<0.01)，但對骨質(zhì)疏松無影響(圖3、表1)。

CAI對AA大鼠關(guān)節(jié)組織病理學(xué)的影響與NC組相比，AA大鼠關(guān)節(jié)HE染色切片可見大量炎細胞浸潤，滑膜組織和纖維組織增生明顯，新生血管明顯增加，增生的滑膜和血管侵入軟骨、骨組織形成特征性血管翳，關(guān)節(jié)軟骨及骨組織被破壞。CAI中、高劑量和Dex可顯著改善上述病理損傷(P<0.05或P<0.01)，表現(xiàn)為滑膜組織增生受抑制，炎細胞浸潤減少，新生血管生成減少，軟骨和骨組織破壞程度減輕(圖4、表1)。

CAI對AA大鼠足爪組織中TNF-α、IL- 1β和IL- 6含量的影響與NC組相比，AA大鼠足爪組織中TNF-α、IL- 1β和IL- 6水平顯著升高(P均<0.01)。CAI低、中、高劑量和Dex可顯著降低TNF-α和IL- 1β水平，CAI中、高劑量和Dex可顯著降低IL- 6水平(P<0.05或P<0.01)(圖5)。

A.NC組；B.PEG 400組；C.NS組；D.CAI中劑量組；E.CAI高劑量組；F.Dex組

A.NC group；B.PEG 400 group；C.NS group；D.CAI middle-dose group；E.CAI high-dose group；F.Dex group

圖3CAI對AA大鼠關(guān)節(jié)放射學(xué)改變的影響

Fig3Effect of CAI on the radiological changes in AA rats

A.NC組；B.PEG 400組；C.NS組；D.CAI中劑量組；E.CAI高劑量組；F.Dex組

A.NC group；B.PEG 400 group；C.NS group；D.CAI middle-dose group；E.CAI high-dose group；F.Dex group

圖4CAI對AA大鼠關(guān)節(jié)組織病理學(xué)的影響(HE，×200)

Fig4Effect of CAI on histopathology in AA rats (HE，×200)

表 1　CAI對AA大鼠放射學(xué)分數(shù)和病理學(xué)分數(shù)的影響

CAI：羧胺三唑；AA：佐劑性關(guān)節(jié)炎；NS：生理鹽水；Dex：地塞米松；與NC組比較，aP<0.01；與溶劑對照組比較，bP<0.05，cP<0.01

CAI：carboxyamidotriazole；AA：adjuvant arthritis；NS：normal sodium；Dex：dexamethasone；aP<0.01 compared with NC group；bP<0.05，cP<0.01 compared with the vehicle-treated control group

TNF：腫瘤壞死因子；IL：白細胞介素；與NC組比較，aP<0.01；與溶劑對照組比較，bP<0.05，cP<0.01

TNF：tumor necrosis factor；IL：interleukin；aP<0.01 compared with NC group；bP<0.05，cP<0.01 compared with the vehicle-treated control group

圖5CAI對AA大鼠足爪組織中TNF-α、IL- 1β和IL- 6水平的影響

Fig5Effect of CAI on TNF-α，IL- 1β，and IL- 6 levels in the paw tissues of AA rats

討論

AA模型是一種免疫性炎癥模型，其組織病理學(xué)改變和實驗室指標與人RA相似，因此是篩選和研究治療RA藥物的理想模型[8]。本研究觀察到，AA大鼠在致炎后12 d開始出現(xiàn)關(guān)節(jié)炎癥狀，22 d病變達高峰，關(guān)節(jié)紅腫、變形，并伴有關(guān)節(jié)強直。疾病過程中，動物還出現(xiàn)體重下降。大鼠后肢X線檢查結(jié)果顯示，AA大鼠出現(xiàn)明顯骨質(zhì)疏松和骨侵蝕，關(guān)節(jié)間隙狹窄甚至消失。病理結(jié)果顯示，AA大鼠關(guān)節(jié)滑膜增厚，炎細胞浸潤，血管翳形成，軟骨及骨組織被破壞。為探討CAI對大鼠AA的治療作用，于炎癥開始出現(xiàn)時(即致炎后12 d)灌胃給藥，連續(xù)14 d，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，CAI可降低AA大鼠的AI，促進AA大鼠體重的恢復(fù)，減輕AA大鼠關(guān)節(jié)放射學(xué)和組織病理學(xué)的損傷，表明CAI對大鼠AA有明顯改善作用。

細胞因子網(wǎng)絡(luò)失調(diào)與RA發(fā)病及病程進展密切相關(guān)[9]，在RA關(guān)節(jié)損傷的病理過程中，TNF-α和IL- 1β是起主導(dǎo)作用的促炎細胞因子，他們相互作用，誘導(dǎo)更多的細胞因子和炎癥介質(zhì)產(chǎn)生；增強內(nèi)皮細胞黏附分子表達，協(xié)助炎癥細胞遷徙至關(guān)節(jié)腔；促進滑膜增生和微血管新生，形成血管翳；減少蛋白聚糖和膠原合成，增加基質(zhì)降解酶產(chǎn)生，導(dǎo)致軟骨基質(zhì)降解；促進破骨細胞分化和成熟，引起骨質(zhì)破壞等。臨床研究表明，針對TNF-α或IL- 1β的阻斷劑，能有效改善RA患者的關(guān)節(jié)炎癥狀，阻止病情發(fā)展，顯示出良好的應(yīng)用前景[9- 10]。IL- 6也是RA關(guān)節(jié)炎癥中重要的促炎細胞因子，在RA患者的血清和關(guān)節(jié)滑液中明顯升高[11]。本研究結(jié)果顯示，AA大鼠炎癥足爪組織中TNF-α、IL- 1β和IL- 6水平明顯升高，CAI可以降低IL- 1β、TNF-α和IL- 6水平。在RA關(guān)節(jié)部位，高水平的促炎細胞因子來源于大量浸潤的炎細胞和增生的滑膜細胞的分泌[12]。組織病理學(xué)結(jié)果顯示，CAI可以減少炎細胞浸潤，抑制滑膜增生，這可能是CAI能夠減少IL- 1β、TNF-α和IL- 6等促炎細胞因子的原因。另一方面，鑒于促炎細胞因子在RA關(guān)節(jié)損傷中的重要作用，CAI可能通過降低促炎細胞因子，從而減輕AA大鼠關(guān)節(jié)炎癥以及關(guān)節(jié)放射學(xué)和組織病理學(xué)的損傷，發(fā)揮對AA大鼠的治療作用。

目前，臨床常用的治療RA的藥物包括糖皮質(zhì)激素、非甾體類抗炎藥和免疫抑制藥等，但長期使用這些藥物易引起嚴重不良反應(yīng)。在本研究中，陽性藥Dex能夠顯著降低AA大鼠的AI，但對AA大鼠體重降低以及放射學(xué)檢查所表現(xiàn)出的骨質(zhì)疏松無影響，同時大鼠出現(xiàn)激惹和煩躁等癥狀。CAI對大鼠AI的抑制作用雖然弱于Dex，但CAI高劑量組在18、22、26 d對AI的降低作用亦很顯著，而且，CAI在給藥期間可以促進AA大鼠體重的恢復(fù)，改善AA大鼠放射學(xué)檢測中的骨質(zhì)疏松評分。同時，CAI能夠明顯降低AA大鼠放射學(xué)檢測中的關(guān)節(jié)間隙狹窄和骨侵蝕評分、病理學(xué)評分、以及AA大鼠炎癥足爪中升高的促炎細胞因子TNF-α、IL- 1β和IL- 6水平，且CAI在高劑量時對上述指標的的抑制作用與Dex相當(dāng)。另外，CAI在用于抗腫瘤的臨床試驗中，嚴重不良反應(yīng)少見，常見的不良反應(yīng)為輕度的惡心、嘔吐等胃腸道反應(yīng)以及眩暈等中樞神經(jīng)系統(tǒng)反應(yīng)[13- 14]。提示CAI有可能成為一種新型的相對安全的治療RA的藥物。

綜上，CAI能有效緩解AA大鼠體重的降低，減輕關(guān)節(jié)炎程度，改善關(guān)節(jié)放射學(xué)和組織病理學(xué)損傷，降低炎癥足爪中IL- 1β、TNF-α和IL- 6水平。提示CAI對AA大鼠具有明顯的治療作用，其作用機制可能與其降低炎癥部位的促炎細胞因子有關(guān)，這為CAI發(fā)展成為治療RA的新藥提供依據(jù)。

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Therapeutic Effect of Carboxyamidotriazole on Adjuvant Arthritis in Rats

ZHU Lei，LI Juan，GUO Lei，YU Xiao-li，WU Dan-wei，CHEN Wei，CHEN Chen，DU Xiao-wan，ZHANG De-chang，YE Cai-ying

Department of Pharmacology，Institute of Basic Medical Sciences，CAMS and PUMC, Beijing 100005，China Corresponding author：ZHANG De-changTel：010- 69156401，E-mail：zhangdechang45@vip.sina.com； YE Cai-yingTel：010- 65597159，E-mail：caiyingye@126.com

ABSTRACT：ObjectiveTo study the effect of carboxyamidotriazole (CAI) on adjuvant arthritis (AA) in rats.MethodsThe rats were randomly divided into normal group，two vehicle groups (polyethylene glycol 400 control and normal sodium control group)，CAI-treated groups (10，20，and 40 mg/kg) and positive control dexamethasone group. Freund’s completed adjuvant was used to induce AA in rats. The arthritis index (AI) was scored，and X-ray check of the hind limbs and histopathological examination were performed. The levels of tumor necrosis factor (TNF)-α，interleukin (IL)- 1β，and IL- 6 in the inflamed paw tissues were measured.ResultsThe administration of CAI significantly decreased the AI，restored the body weights，and ameliorated the radiological and histopathological features of joint destruction in AA rats (P<0.05，P<0.01). In addition，CAI reduced the TNF-α，IL- 1β，and IL- 6 levels in the inflamed paw tissues (P<0.05，P<0.01).ConclusionCAI has therapeutic effect on AA rats，which may be achieved by decreasing the pro-inflammatory cytokines at the site of inflammation.

Key words：carboxyamidotriazole；adjuvant arthritis；cytokines

(收稿日期：2015- 03- 25)

DOI：10.3881/j.issn.1000- 503X.2016.01.009

中圖分類號:R961

文獻標志碼:A

文章編號：1000- 503X(2016)01- 0049- 06

通信作者：張德昌電話：010- 69156401，電子郵件：zhangdechang45@vip.sina.com；

基金項目：國家自然科學(xué)基金(81102454、81201728、81402943)和“重大新藥創(chuàng)制”科技重大專項(2014ZX09507003- 003) Supported by the National Natural Sciences Foundation of China (81102454，81201728，81402943) and the Special Program for Key Basic Research of the Ministry of Science and Technology of China (2014ZX09507003- 003)