陳家逸，蘇　偉，王恩舉

(海南師范大學(xué)化學(xué)與化工學(xué)院，?？?71158)

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基于1，8-萘酰亞胺與羅丹明B間熒光共振能量轉(zhuǎn)移的高選擇性Hg2+比率熒光探針

陳家逸，蘇偉，王恩舉

(海南師范大學(xué)化學(xué)與化工學(xué)院，?？?71158)

摘要以羅丹明B與1，8-萘二甲酰亞胺反應(yīng)合成了1個高選擇性Hg2+比率熒光探針( RN).在甲醇/乙腈/ 4-羥基哌嗪乙磺酸緩沖溶液( pH=7. 2，體積比8∶1∶1)中，RN對Hg2+具有比色和比率熒光雙重響應(yīng).加入Hg2+后，RN的紫外-可見光譜在約556 nm處產(chǎn)生強(qiáng)吸收，溶液由淺綠色變?yōu)槌壬?，其它金屬離子對RN的紫外-可見光譜幾乎無影響.無Hg2+存在時，RN的熒光光譜在540 nm處出現(xiàn)萘二甲酰亞胺熒光團(tuán)的特征峰;加入Hg2+后，540 nm處的發(fā)射帶逐漸消失，同時在580 nm附近產(chǎn)生強(qiáng)熒光，熒光顏色從綠色變?yōu)槌壬?這歸因于從萘酰亞胺到開環(huán)羅丹明B的熒光共振能量轉(zhuǎn)移( FRET)，探針RN對Hg2+的比率熒光響應(yīng)具有高選擇性，不受其它共存金屬離子的干擾.

關(guān)鍵詞羅丹明B; 1，8-萘二甲酰亞胺;熒光共振能量轉(zhuǎn)移; Hg2+;比率熒光探針

汞是最危險的金屬污染物之一，主要通過空氣流動傳播，沉入水中后可通過水生食物鏈快速累積，水生食物鏈頂端捕食者(如鯊魚、金槍魚)體內(nèi)富集的汞可達(dá)水體汞濃度的幾十萬倍.因此，發(fā)展高選擇性、高靈敏度的Hg2+檢測方法對環(huán)境保護(hù)和人體健康至關(guān)重要.近年來已開發(fā)出多種性能優(yōu)異的Hg2+熒光探針［1～4］.與普通熒光探針相比，比率熒光探針涉及2個波長熒光強(qiáng)度的變化，可以更有效地避免來自環(huán)境的干擾.分子內(nèi)電荷轉(zhuǎn)移( ICT)和熒光共振能量轉(zhuǎn)移( FRET)是2種最常用于設(shè)計比率熒光探針的傳感機(jī)制.基于ICT機(jī)制的比率熒光探針，2個熒光發(fā)射帶的波長差一般較小，經(jīng)常出現(xiàn)兩者重疊的現(xiàn)象，可導(dǎo)致熒光強(qiáng)度比率測量的誤差.FRET型比率熒光探針更易避免2個熒光發(fā)射帶的重疊，因此被廣泛應(yīng)用于比率熒光探針的設(shè)計［5～8］.

羅丹明類熒光染料不但具有摩爾消光系數(shù)大、熒光量子產(chǎn)率高、激發(fā)波長和發(fā)射波長均較長的優(yōu)點，而且具有基于開環(huán)-螺環(huán)結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)換的熒光開-關(guān)機(jī)制.當(dāng)羅丹明處于螺環(huán)結(jié)構(gòu)時，無色且無熒光，而在H+或某些金屬陽離子作用下，可形成開環(huán)結(jié)構(gòu)并發(fā)射強(qiáng)熒光，同時在自然光下呈現(xiàn)出顏色.即該類熒光探針既屬于“off-on”型熒光探針，又是肉眼可視的比色探針.因此，羅丹明類分子被廣泛應(yīng)用于金屬離子的檢測［9～13］.近年來，一系列基于羅丹明的高選擇性Hg2+熒光探針被相繼報道［14～21］.萘酰亞胺類物質(zhì)也是一類常見的熒光團(tuán)，其發(fā)射光譜與羅丹明B的吸收光譜有部分重疊，因此兩者間可發(fā)生熒光共振能量轉(zhuǎn)移［22～25］.本文通過1個酰胺鏈將兩者連接起來，合成了以1，8-萘二甲酰亞胺為能量供體，以羅丹明B為能量受體的FRET型熒光探針，并研究了其對Hg2+的傳感行為.

1　實驗部分

1.1試劑與儀器

羅丹明B、1，8-萘二甲酰亞胺、1-羥基苯并三氮唑( HOBT)、1-乙基-( 3-二甲基氨基丙基)碳二亞胺鹽酸鹽( EDCI)和4-羥乙基哌嗪乙磺酸( HEPES)均購自上海晶純試劑有限公司;測試所用金屬離子均為相應(yīng)的硝酸鹽(上海晶純試劑有限公司).

Bruker-400型核磁共振波譜儀( TMS為內(nèi)標(biāo)，CDCl3為溶劑)和Bruker esquire HCT型質(zhì)譜儀(德國Bruker公司) ; Hitachi F-7000型熒光光譜儀(日本Hitachi公司) ; TU-1901型分光光度計(北京普析通用儀器有限責(zé)任公司).

1.2熒光探針RN的合成

熒光探針RN的合成路線見Scheme 1.

Scheme 1　Synthetic approach for RN

參考文獻(xiàn)［26］方法合成化合物1，產(chǎn)率80%.ESI-MS( C30H36N4O2理論值)，m/z: 485. 2( 485. 28) ［M+H］+. ［27，28］方法合成化合物2，產(chǎn)率78%.1H NMR( 400 MHz，DMSO-d6)，δ: 8. 45( d，1H，J=8. 0 Hz)，8. 40( d，1H，J=8. 0 Hz)，8. 36( d，1H，J=8. 0 Hz)，7. 80( t，1H，J=8. 0 Hz)，7. 28( d，1H，J=8. 0 Hz)，4. 71( s，2H)，3. 20( m，4H)，1. 82( m，4H)，1. 66( m，2H) ; ESI-MS( C19H18N2O4理論值)，m/z: 337. 2( 337. 13)［M－H］－.

化合物RN的合成:將化合物1( 0. 17 g，0. 5 mmol)、化合物2( 0. 24 g，0. 5 mmol)和HOBT( 0. 10 g，0. 7 mmol)溶于15 mL二氯甲烷，于0℃攪拌30 min后加入EDCI( 0. 19 g，1. 0 mmol)，在氮氣保護(hù)下繼續(xù)低溫攪拌60 min，逐漸升至室溫再攪拌反應(yīng)10 h.用水洗滌3次，待有機(jī)層干燥后，減壓蒸干得0. 38 g黃色固體，用硅膠柱層析純化［展開劑: V(石油醚)∶V(乙酸乙酯) = 1∶1］得到0. 32 g化合物RN，淡黃色粉末，產(chǎn)率78. 0%.1H NMR( 400 MHz，CDCl3)，δ: 8. 55( d，1H，J = 8. 0 Hz)，8. 47( d，1H，J=8. 0 Hz)，8. 46( d，1H，J=8. 0 Hz)，7. 70( t，1H，J=8. 0 Hz)，7. 42( br，1H)，7. 38( t，1H，J= 8. 0 Hz)，7. 25( t，1H，J=8. 0 Hz)，7. 19( d，1H，J=8. 0 Hz)，7. 01( d，2H，J=8. 0 Hz).6. 37( d，2H，J=8. 8 Hz)，6. 36( s，2H)，6. 29( d，2H，J= 8. 8 Hz)，4. 77( s，2H)，3. 32( q，8H，J= 6. 8 Hz).3. 28 ( m，6H)，1. 92( m，4H)，1. 75( m，4H)，1. 15( t，12H，J=6. 8 Hz) (1H NMR譜圖見本文支持信息圖S1) ;13C NMR( 100 MHz，CDCl3)，δ: 170. 0，167. 5，164. 6，164. 0，157. 5，153. 9，153. 1，149. 0，132. 9，132. 6，131. 2，130. 7，130. 5，129. 9，128. 5，127. 7，126. 4，125. 4，123. 7，123. 4，122. 6，116. 2，114. 8，108. 5，104. 6，97. 7，65. 5，54. 7，44. 4，43. 3，41. 3，39. 1，26. 3，24. 4，12. 6(13C NMR譜圖見本文支持信息圖S2) ; ESI-MS，m/z: 805. 4［M+H］+(圖譜見本文支持信息圖S3).

1.3 Hg2+熒光試紙的制備及應(yīng)用

將普通濾紙( 1 cm×4 cm)浸泡在RN的二氯甲烷溶液( 1×10－3mol/L)中，1 min后取出晾干即得所需試紙.用噴霧小瓶將待檢樣品水溶液均勻噴到濾紙上，在60℃烘箱中加熱5 min，在紫外暗箱中于365 nm紫外光下觀察.

2　結(jié)果與討論

2.1比色法研究RN對Hg2+的選擇性響應(yīng)

在甲醇/乙腈/HEPES緩沖溶液( 50 mmol HEPES，pH=7. 2，體積比為8∶1∶1)中進(jìn)行紫外-可見光譜測試.由Hg2+對RN紫外-可見光譜［圖1( A)］的影響可知，當(dāng)不存在Hg2+時，RN的最大吸收波長為412 nm，隨著Hg2+濃度的增大，在556 nm附近出現(xiàn)1個新的吸收帶.當(dāng)Hg2+濃度在10～80 μmol/L范圍內(nèi)時，吸光度隨著Hg2+濃度線性增加，當(dāng)Hg2+濃度達(dá)到探針RN濃度的10倍時，吸光度達(dá)到最大［圖1( B)］.以吸光度對較低Hg2+濃度作線性相關(guān)圖［圖1( C)］，由公式LOD=3σ/k計算得RN對Hg2+的紫外檢出限為4. 5×10－7mol/L.其它金屬離子( Al3+，Na+，Mn2+，Co2+，Ni2+，Cu2+，Cr3+，Ag+，Pb2+，Zn2+，Cd2+，F(xiàn)e2+和Fe3+)對RN的吸收波長和吸收強(qiáng)度都沒有明顯影響［圖2( A)］，只有Hg2+能使RN溶液的顏色由淡綠色變?yōu)槌壬蹐D2( B)］.RN的吸收光譜和溶液顏色的變化歸因于Hg2+致使羅丹明B螺環(huán)結(jié)構(gòu)開環(huán).

Fig.1　UV-Vis spectra of RN( 10 μmol/L) under different conditions( B) Effect of Hg2+concentration at 556 nm; ( C) with different concentrations of Hg2+( 1，2，3，4 and 5 μmol/L) at 556 nm.

Fig．2　UV-Vis spectra( A) and color changes of RN( 10 μmol /L) ( B)( A) With different metal ions，c( metal ions) =100 μmol /L; ( B) addition of Hg2+under natural light，a． only RN，b． addition of Hg2+( 100 μmol /L) ，c．a(chǎn)ddition of a mixture of Al3+，Na+，Mn2+，Co2+，Ni2+，Cu2+，Cr3+，Ag+，Pb2+，Zn2+，Cd2+，F(xiàn)e2+and Fe3+，each concentration was 100 μmol /L．

2.2比率熒光法檢測Hg2+

在甲醇/乙腈/HEPES緩沖溶液( 50 mmol HEPES，pH= 7. 2，體積比為8∶1∶1)中進(jìn)行熒光測試，激發(fā)波長為440 nm.探針RN對不同濃度Hg2+的熒光響應(yīng)見圖3( A)，當(dāng)不存在Hg2+時，RN的最大發(fā)射波長為540 nm，為探針萘酰亞胺部分的發(fā)射帶.隨著Hg2+的加入，該發(fā)射帶的強(qiáng)度逐漸減小，同時，在580 nm處出現(xiàn)1個新的發(fā)射峰，隨著Hg2+的增多逐漸增強(qiáng).熒光顏色從綠色變?yōu)槌壬?圖3插圖).這歸因于Hg2+引起羅丹明B螺環(huán)結(jié)構(gòu)開環(huán)，開環(huán)的羅丹明B在580 nm產(chǎn)生強(qiáng)熒光，此熒光發(fā)射的激發(fā)光譜(即開環(huán)羅丹明B的吸收光譜，490～580 nm，圖1)與萘酰亞胺的發(fā)射光譜( 500～600 nm)存在部分重疊( 500～580 nm)，發(fā)生了從萘酰亞胺到開環(huán)羅丹明B的熒光共振能量轉(zhuǎn)移.以熒光強(qiáng)度對較低Hg2+濃度作線性相關(guān)圖［圖3( B)］，由公式LOD= 3σ/k計算得RN對Hg2+的熒光檢出限為1. 05×10－8mol/L.實驗發(fā)現(xiàn)，加入Hg2+不能立即引起探針RN的顏色和熒光發(fā)生變化，這可能是由于羅丹明螺環(huán)結(jié)構(gòu)開環(huán)需要一定的反應(yīng)時間所致.為此，測定了熒光比率( F580/F540)隨時間的變化關(guān)系.由圖4可見，加入Hg2+后0～10 min內(nèi)，熒光比率幾乎線性增大，10 min后基本趨于穩(wěn)定，14 min后達(dá)到極大值.升高溫度有利于羅丹明的開環(huán)反應(yīng)，從而可以顯著提高探針的響應(yīng)速度，在50℃下Hg2+引起的顏色和熒光變化在1 min內(nèi)即可完成.

Fig.3　Fluorescence spectra of RN( 10 μmol/L)( A) c( Hg2+) /(μmol·L－1)，a—k: 0，10，20，30，40，50，60，70，80，90，100.λex=440 nm.Inset: a and b represent colors of RN solution( 10 μmol/L) before and after the addition of Hg2+( 100 μmol/L) in dark-box ultraviolet analyzer when excited at 365 nm，respectively; ( B) fluorescent intensities ratio( I580 nm/I540 nm) as a function of Hg2+( 0，1，2，3 and 4 μmol/L).

Fig.4　Time-dependent ratiometric　fluorescence responses of 10 μmol/L RN to 100 μmol/L Hg2+

Fig.5　pH-dependent fluorescence ratios( F580/F540) of RN in the absence( a) and presence( b) of Hg2+

眾所周知，不但某些金屬陽離子可以使羅丹明發(fā)生開環(huán)反應(yīng)，酸性條件下H+也能打開羅丹明的螺環(huán)結(jié)構(gòu)，使其發(fā)出強(qiáng)熒光［10］.因此，有必要考察環(huán)境酸度對RN熒光傳感Hg2+的影響.RN的熒光比率( F580/F540)隨溶液pH變化曲線如圖5所示.在加入Hg2+前，當(dāng)pH＜6時，熒光比率隨pH值的減小而快速增加.這是由于H+導(dǎo)致羅丹明的螺環(huán)結(jié)構(gòu)發(fā)生開環(huán)反應(yīng).加入Hg2+后，當(dāng)pH＞7時，熒光比率隨pH的增加迅速減小，這可能是由于在堿性條件下OH－與RN競爭結(jié)合Hg2+，失去Hg2+后，螺環(huán)開環(huán)的羅丹明B重新關(guān)環(huán)，同時熒光失活.當(dāng)pH≥10時，比率熒光達(dá)到最小值，RN完全失去對Hg2+的傳感能力.可見，RN對Hg2+產(chǎn)生比率熒光響應(yīng)的最佳pH值為6～7，但pH值在6～8的范圍內(nèi)均可產(chǎn)生足夠強(qiáng)的比率熒光信號.

2.3 RN對Hg2+的選擇性

熒光探針RN對各種金屬離子的熒光響應(yīng)如圖6所示.可見，只有加入Hg2+才能引起540 nm處吸收峰的減弱，并在580 nm處產(chǎn)生新的吸收峰，其它金屬離子( Al3+，Na+，Mn2+，Co2+，Ni2+，Cu2+，Cr3+，Ag+，Pb2+，Zn2+，Cd2+，F(xiàn)e2+和Fe3+)對RN的熒光光譜幾乎沒有影響.

為了進(jìn)一步評估探針RN在復(fù)雜環(huán)境中對Hg2+的選擇性，在Hg2+樣品中加入其它金屬離子，考察這些離子對Hg2+測試的干擾.由圖7可知，Hg2+引起的熒光響應(yīng)并沒有受到其它共存離子的干擾，因此，比率熒光探針RN對Hg2+具有特異性響應(yīng).

Fig.7　Selective responses of RN( 10 μmol/L) to Hg2+( 100 μmol/L) in the presence of different cations ( 200 μmol/L)a.None; b.Al3+; c.Na+; d.Mn2+; e.Co2+; f.Ni2+; g.Cu2+; h.Cr3+; i.Ag+; j.Pb2+; k.Zn2+; l.Cd2+; m.Fe3+; n.Fe2+.

Fig.8　ESI-MS of RN in the presence of Hg2+and trace amounts of Cl－Inset: observed( left) and calculated( right) isotopic patterns for the［RN+Hg+Cl］+.

2.4羅丹明的開環(huán)機(jī)制

金屬離子引起羅丹明螺環(huán)開環(huán)從而激活其強(qiáng)熒光主要有3種方式，相應(yīng)地存在以下3類探針: ( 1)反應(yīng)型熒光化學(xué)計量器［29］; ( 2)普通配位型熒光探針［30，31］; ( 3)配位開環(huán)并進(jìn)一步催化酰胺鍵水解［32］.為了探究RN對Hg2+的傳感機(jī)制，測定了Hg2+存在下RN的電噴霧質(zhì)譜.結(jié)果表明，在m/z 500～2000的范圍內(nèi)，最強(qiáng)峰始終是游離態(tài)RN的分子離子峰( m/z=805. 4［RN+1］+)，并未發(fā)現(xiàn)其它強(qiáng)峰.位于m/z 502. 7處的弱峰可能歸屬為結(jié)合常數(shù)較小的雙電荷配合物［RN+Hg］2+(質(zhì)譜圖見本文支持信息中圖S4).為了確證該離子峰的歸屬，向試樣中加入極微量的Cl－，一方面，Cl－可以中和掉Hg2+的1個正電荷，另一方面，兩者的強(qiáng)配位作用使RN與Hg2+的配位作用得到協(xié)同加強(qiáng)，從而得到比較穩(wěn)定的單電核正離子［RN+Hg+Cl］+.在m/z 1041. 5附近較強(qiáng)的離子峰群歸屬為［RN+Hg+Cl］+(理論值為m/z 1041. 34)，模擬圖與實測圖具有較高的吻合度(見圖8).因此，RN與Hg2+形成了1∶1的配合物，但兩者之間的配位作用比較弱.在此基礎(chǔ)上提出了RN與Hg2+作用的可能機(jī)制( Scheme 2).

Scheme 2　Proposed Hg2+-sensing mechanism of RN

2.5 Hg2+試紙的制備及應(yīng)用

為進(jìn)一步拓展該熒光探針的實用性，采用浸漬法將RN負(fù)載到濾紙上制備成試紙，研究了該試紙對Hg2+的檢測性能.在噴涂Hg2+溶液前，試紙在365 nm光照射下呈綠色熒光;噴涂Hg2+溶液后，試紙熒光變?yōu)槌壬?隨著Hg2+濃度的增加，熒光顏色逐漸加深，熒光強(qiáng)度逐漸加強(qiáng)(見圖9).為了評價該試紙對實際環(huán)境樣品的檢測性能，取?？谑屑t城湖的湖水，過濾后用其代替蒸餾水配制Hg2+樣品.結(jié)果表明，在365 nm光照射下，試紙對該樣品呈現(xiàn)類似的橙色熒光響應(yīng)，與蒸餾水Hg2+樣品引起的橙色熒光無明顯區(qū)別(見圖9).

綜上所述，通過酰胺縮合反應(yīng)將2個常用的熒光化合物羅丹明B與1，8-萘酰亞胺連接起來，合成了1個高選擇性的Hg2+比率熒光探針( RN)，其比率熒光的形成基于從萘酰亞胺到開環(huán)羅丹B的分子內(nèi)熒光共振能量轉(zhuǎn)移( FRET)機(jī)制.在甲醇/乙腈/4-羥乙基哌嗪乙磺酸( HEPES)緩沖溶液( pH = 7. 2)中，于440 nm光激發(fā)下探針RN發(fā)射波長為540 nm的綠色熒光，確認(rèn)為探針萘酰亞胺部分的熒光發(fā)射.加入Hg2+后，探針RN發(fā)射波長為580 nm的橙色強(qiáng)熒光，同時萘酰亞胺的綠色熒光逐漸消失，熒光變化不受其它共存離子的干擾.同時，Hg2+的存在可引起探針的紫外-可見光譜在556 nm附近產(chǎn)生強(qiáng)吸收，溶液顏色由淺綠色變?yōu)槌壬?，其它金屬離子對探針RN的吸收光譜幾乎沒有任何影響.因此，RN是一個對Hg2+具有比色和比率熒光雙重響應(yīng)的高選擇性探針.

Fig.9　Test papers after being sprayed with Hg2+in watera.None; b.5. 0×10－5mol/L; c.1. 0×10－4mol/L; d.5. 0× 10－4mol/L; e.1. 0×10－4mol/L in filtered lake water.

支持信息見http: / /www.cjcu.jlu.edu.cn/CN/10.7503/cjcu20150563.

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Highly Selective Ratiometric Fluorescent Probe for Hg2+
Based on Fluorescence Resonance Energy Transfer
Between 1，8-Naphthalimide and Rhodamine B?

CHEN Jiayi，SU Wei，WANG Enju*
( School of Chemistry＆Chemical Engineering，Hainan Normal University，Haikou 571158，China)

?Supported by the National Natural Science Foundation of China( No.21162010).

Abstract A ratiometric fluorescent probe( RN) was developed based on rhodamine B and 1，8-naphthalimide which were linked together by an amido linkage.In CH3OH/CH3CN/HEPES buffer solution( pH=7. 2)，free RN showed absorption maximum at 412 nm.The presence of Hg2+could induce an intensive absorption at 556 nm.The change of absorption spectrum resulted in a color change from light green to orange in response to Hg2+.Significantly，the probe RN gave rise to a ratiometric fluorescent response to Hg2+.Upon the addition of Hg2+，a significant fluorescence enhancement at 580 nm and meanwhile the gradual disappearance of the emission at 540 nm were observed，which were ascribed to the fluorescence resonance energy transfer( FRET) from 1，8-naphthalimide moiety to the ring-opened rhodamine B moiety.Accompanying the change of fluorescence spectra，the significant fluorescence color changed from green to orange occurred，which could be used for naked-eye detection of Hg2+.The ratiometric fluorescence signal for Hg2+was not affected by other coexisting mental ions.

KeywordsRhodamine B; 1，8-Naphthalimide; Fluorescence resonance energy transfer; Hg2+; Ratiometric fluorescent probe

( Ed.: P，H，N，K)

基金項目:國家自然科學(xué)基金(批準(zhǔn)號: 21162010)資助.

收稿日期:2015-07-20.網(wǎng)絡(luò)出版日期: 2015-12-26.

doi:10.7503/cjcu20150563

中圖分類號O657

文獻(xiàn)標(biāo)志碼A

聯(lián)系人簡介:王恩舉，男，博士，教授，主要從事熒光傳感方面的研究.E-mail: enjuwang@ 163.com