吳佩紋，高素萍，張　碩，趙志惠

( 1．四川農(nóng)業(yè)大學風景園林學院，成都611130; 2．四川農(nóng)業(yè)大學園林研究所，成都611130 )

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藍花丹結(jié)實率低的傳粉生物學和繁育系統(tǒng)初探

吳佩紋1，高素萍2*，張碩1，趙志惠1

( 1．四川農(nóng)業(yè)大學風景園林學院，成都611130; 2．四川農(nóng)業(yè)大學園林研究所，成都611130 )

摘要:為解釋藍花丹自然結(jié)實率低的原因，該研究從傳粉生物學和繁育系統(tǒng)入手，采用TTC法與聯(lián)苯胺－過氧化氫法分別測定花粉活力和柱頭可授性的動態(tài)變化;用花粉－胚珠比( P/O比)、雜交指數(shù)( OCI)估算藍花丹繁育系統(tǒng)類型并通過人工控制授粉試驗驗證。結(jié)果表明: ( 1)藍花丹L型雌器官與S型雄器官、L型雄器官與L型雌器官成熟時間重疊區(qū)域較多，雌雄性器官在成熟時間上無顯著差異;而S型雌器官與L型雄器官、S型雌器官與S型雄器官成熟時間重疊區(qū)域較少，但藍花丹持續(xù)開花的模式緩解了雌雄性器官時間差異而引起的生殖隔離。( 2)藍花丹L型花P/O為502．00±52．30，S型花P/O為482．70±87．91，OCI為4，綜合判斷藍花丹的繁育系統(tǒng)屬于專性異交型且具有異型自交不親和的特性。綜上可初步解釋藍花丹自然結(jié)實率低的原因為內(nèi)外因素共同作用的結(jié)果，其中雌雄性器官同熟時間短不是主要原因，而其本身較強的自交不親和性可能是自然結(jié)實率低下的關鍵性內(nèi)因。由于藍花丹的專性異交繁育系統(tǒng)使其成功授粉需要傳粉媒介，但因引種地與原產(chǎn)地環(huán)境存在顯著差異，同時開花模式不集中導致的缺乏傳粉者完成異花授粉或許是引起異交成功率降低的主要外因。因此，提高藍花丹的結(jié)實率應從克服其自身自交不親和性以及適當引入安全傳媒昆蟲入手。

關鍵詞:藍花丹，繁育系統(tǒng)，傳粉生物學，結(jié)實率，自交不親和

吳佩紋，高素萍，張碩，等．藍花丹結(jié)實率低的傳粉生物學和繁育系統(tǒng)初探［J］．廣西植物，2016，36( 1) : 107－113

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異型花柱現(xiàn)象長久以來受到植物學家的關注，包含了二型花柱和三型花柱兩種類型，其中二型花柱更為普遍，為最常見的一種雌雄蕊異位( Barrett et al，2000;陳明林等，2010)。異型花柱植物的自交不親和性被認定為該類型植物的基本特征( Meeus et al，2011; Klein et al，2009)，但也有研究顯示其具有自交親和性( Eckert et al，1994)。因異型花柱植物的型內(nèi)親和與否和其自然結(jié)實率關系密切，故有必要對植物繁育系統(tǒng)中的自交不親和程度及交配系統(tǒng)作進一步研究(張仁波等，2006)。

藍花丹( Plumbago auriculata)為多年生常綠灌木，因富含大量的白花丹素具有較高藥用價值，且花朵顏色獨特，開花周期長，被視為園林景觀材料中的新寵。已有學者(張碩等，2014)對藍花丹的花部形態(tài)特征進行了測定，確定其屬于二型花柱植物，有長短花柱之分(分別記為L型和S型)，初步判定其具有自交不親和特性?；ú啃螒B(tài)有著典型的二態(tài)性，在花筒口直徑，花筒長度，雌蕊高度，雄蕊高度等方面差異極顯著，這些特征是藍花丹對型間互補式雌雄異位的進化適應策略(張碩等，2014)。目前，藍花丹自然結(jié)實率低致使該資源短缺，成為阻礙藍花丹推廣應用的瓶頸問題。植物結(jié)實與傳粉有著密切聯(lián)系，傳粉是種子植物繁殖的必經(jīng)階段(何璐等，2010)?；ǚ鄣倪\動在較大水平上限制了植物個體間的基因流和群體交配方式(黃雙全等，2000)。通常成功的傳粉需要滿足四個條件: ( 1)花粉和花柱都處于成熟狀態(tài); ( 2)成熟且有活性的花粉散出; ( 3)擁有足夠的傳粉媒介及適宜的訪花頻率保證花粉在柱頭的滯落率; ( 4)柱頭和花粉之間能成功地相互識別(陳家寬等，1994)?，F(xiàn)階段國內(nèi)外關于藍花丹以及所在科屬的研究主要集中于觀賞特性，生物學特性、藥用成分的分析以及組織培養(yǎng)上( Gangopadhyay et al，2008; Iyyakkannu et al，2009; Seiichi et al，2012)，F(xiàn)errero et al( 2009)初步研究了藍花丹的傳粉特征，但并未從傳粉生物學的角度結(jié)合其對結(jié)實率的影響進行深入探討，關于其繁育系統(tǒng)的研究也未見報道。因此，藍花丹是否具有典型的自交不親和系統(tǒng)，其傳粉特征與繁育系統(tǒng)是否與自然結(jié)實率低有密切的關系都值得開展深刻的探索。

本實驗通過對藍花丹花粉生活力、柱頭可授性、繁育系統(tǒng)及其親和特性的觀察，試圖探索藍花丹自然結(jié)實率低的主要原因，為擴大該物種資源、促進其應用給予理論指導和奠定應用基礎。

1　材料與方法

1．1材料

為藍花丹5年生實生苗，原產(chǎn)于南非，其柱頭二型分為長花柱型花( L型)和短花柱型花( S型)，現(xiàn)種植在四川農(nóng)業(yè)大學成都校區(qū)苗圃內(nèi)。實生苗種子購至泛美，播種以來長勢強健。

1．2方法

1．2．1花粉活力的測定用TTC法(張志良，2003)進行花粉活力的測定。把長短柱花型( L型和S型)各10朵進行隨機套袋標記，以藍花丹第1枚花瓣伸展初始記為0 h，分別于0、2、4、6、8、24、36、48、72 h時用解剖針將花粉挑出，置于潔凈凹槽載玻片的凹槽內(nèi)，滴入1～2滴0．5%的TTC( 2，3，5-氯化三苯基四氮唑)溶液，使用鑷子把花粉攪拌均勻，于35℃的環(huán)境條件下放置15 min，最后于顯微鏡下觀測花粉被染色的情況(趙興華，2009)。判斷活力的標準:染上深紅色被認為是活性很強的花粉，略淺的紅色表示活性相對低的花粉，未被染上色則表明花粉不存在活性。每張片隨機選擇3個視野，統(tǒng)計染色花粉數(shù)，計算花粉染色率，最后取其平均值為藍花丹花粉活力百分比，重復3次。花粉活力( %) =染紅花粉數(shù)(粒) /花粉總數(shù)(粒)×100%(朱慧等，2009) 1．2．2柱頭可授性的檢測柱頭可授性用聯(lián)苯胺-過氧化氫法(劉林德等，2001)檢測。隨機套袋標記L型花和S型花各10朵，分別于花朵開放后0、2、4、6、8、24、36、48、72 h取下花柱，置于含有1～2滴聯(lián)苯胺-過氧化氫反應液( 1%聯(lián)苯胺∶3%過氧化氫∶水= 4∶11∶22，體積比)的凹槽載玻片內(nèi)。若花柱具有活性，花柱周邊的溶液出現(xiàn)藍色，同時生成較多氣泡，相反，沒有氣泡生成，并且溶液不會變化為藍色的花柱不具備可授能力。

1．2．3花粉-胚珠比( P/O)的測定按Cruden( 1977)的方法對花粉-胚珠比( P/O)進行測定。把未開裂的長、短柱型花各10朵進行隨機采集花藥，從每一朵花上獲取全部花藥，加入1．0 mol·L-1HC1溶液去除花藥壁，配成0．5 mL懸浮液(丙三醇∶冰醋酸=1∶3) (徐榮等，2011)。使用微量移液槍移取10 μL至血球計數(shù)板，在顯微鏡下觀察花粉染色情況并統(tǒng)計數(shù)量，重復操作4次后算其平均值，最后換算出每朵花的花粉粒數(shù)(牟勇等，2007)。

取上述實驗中花朵的雌蕊放入含0．5 mL 75%酒精的15 mL離心管中保存。用刀片在顯微鏡下將雌蕊剖開，挑出胚珠并統(tǒng)計數(shù)量。按Cruden( 1977)的標準計算每朵花的花粉-胚珠比( P/O)，P/O =單花花粉數(shù)/單花胚珠數(shù)(陸婷等，2010)。

1．2．4雜交指數(shù)( OCI)的測定根據(jù)Dafni( 1993)的標準，OCI由三個花部特征(單花直徑、花藥開裂時間和柱頭可授性時間是否一致、花藥和柱頭在空間上的相對位置關系)決定，計算方法如下: ( 1)單花或者花序直徑＜1 mm時記為0; 1～2 mm時記為1; 2 ～6 mm時記為2，＞6 mm時記為3。( 2)雌雄蕊成熟時間的順序，兩者同時成熟或雌蕊先成熟記為0，雄蕊先成熟記為1; ( 3)花藥與柱頭之間的相對位置，處于相同高度記為0，空間存在分離無法接觸記為1。以上三者分值相加為OCI值，判斷標準如下:繁育系統(tǒng)在OCI = 0時為閉花受精型( Cleistogamy) ; OCI= 1時為專性自交型( Obligate autogamy) ; OCI = 2時為兼性自交型( Facultative autogamy)，有發(fā)生異交的幾率; OCI= 3時為兼性異交型( Facultative outcrossing )，可自花授粉，某些品種需媒介傳粉; OCI= 4時為部分自交親和，多數(shù)品種異交，傳粉依賴傳粉媒介(楊艷娟等，2012)。

1．2．5人工控制授粉實驗將花藥未開裂且即將綻放的藍花丹花蕾進行去雄并標記，根據(jù)藍花丹二型花柱的特征，共進行L×L(自然套袋)，S×S(自然套袋)，L×L(人工同型同株授粉)，S×S(人工同型同株授粉)，L×L’(人工同型異株授粉)，S×S’(人工同型異株授粉) ( L’:長花柱異株，S’:短花柱異株)，不套袋自然傳粉，L×S(人工異型花授粉)，S×L(人工異型花授粉) 10種處理方法，每種處理供試花朵數(shù)30朵，重復3次，定期觀察每種處理的結(jié)實情況，計算結(jié)實率。結(jié)種率=成熟種子數(shù)/(成熟種子數(shù)+敗育種子數(shù))×100%(費世民等，2006)。

2　結(jié)果與分析

2．1藍花丹花粉活性的測定結(jié)果

由表1可知，長、短型花粉活力在72 h觀察期間均出現(xiàn)先上升后下降的趨勢。兩型花瓣伸展時的花粉生活力L型大于S型，前者為45．5%，后者28．02%。隨著時間的延長，其生活力呈上升趨勢，但兩者達峰值時間不同(前者95．76%，花瓣伸展后8 h;后者94．67%，6 h)，即L型要滯后S型2 h。

L、S型花柱的花粉活力在花瓣伸展初始存在一定差異。初始S型花粉的活力略低于L型花粉生活力;花瓣伸展后6～24 h內(nèi)，兩種類型的花粉活力都處于高值階段，且這一時期是授粉的最佳時期。24 h后，雖長花柱花粉活力還保持20%～80%之間，但此時短花柱花粉的活力已下降明顯，48 h后已低于12%，此時授粉已難于成功。

2．2藍花丹柱頭可授性的測定結(jié)果

由表1可知，藍花丹L型柱頭在花瓣伸展初始就具有可授性，其可授性隨著時間先上升再下降，在花瓣伸展后6 h時達到最大可授性，一直持續(xù)至24 h，隨后迅速下降，到48 h可授性已十分微弱，直至72 h可授能力完全消失。S型花柱同樣在花瓣伸展初始就具有可授性，在花瓣伸展0～2 h內(nèi)可授性最強，其后迅速下降至6 h時仍具有較弱可授性，但8 h后完全喪失可授能力。

表1　藍花丹花粉活性、柱頭可授性一覽表Table 1 Pollen viability and stigma receptivity of Plumbago auriculata

圖1　藍花丹長、短花柱花粉活力期及柱頭可授期Fig．1 Long and short style pollen viability period and stigma receptivity period of Plumbago auriculata

盡管藍花丹兩型花粉在花瓣展開后0 h就有較強的可授性，對花柱和花粉活力的關注仍集中在散粉以后。根據(jù)觀察，L型材料在花瓣展開后5 h左右開始散粉，S型材料在4 h左右開始散粉。由圖1可知，由于散粉后，兩型柱頭上會同時落滯兩型花粉，因此，花柱與花粉活力的比較分為四種情況。( 1) L柱頭與S花粉活力的比較: S型散粉之后，L型柱頭和S型花粉有44 h均具備可授能力; ( 2) S柱頭與S花粉活力的比較: S型散粉之后，S型柱頭和S型花粉僅有2 h均具備可授能力; ( 3) S柱頭與L花粉活力的比較:當L型散粉之后，S型花柱與L型花粉僅有1 h均具備可授能力; ( 4) L柱頭與L花粉活力的比較:當L型散粉之后，L型花柱與L型花粉有43 h均具備可授能力。

2．3花粉-胚珠比( P/O)的測定結(jié)果

由表2可知，藍花丹L型花平均單花花粉粒為( 502．00±52．30)粒，單花胚珠數(shù)為1，因此可得花粉-胚珠比( P/O)為502．00±52．30; S型花平均單花花粉粒為( 482．70±87．91)粒，單花胚珠數(shù)為1，得其花粉-胚珠比( P/O)為482．70±87．91，按照標準，可判斷藍花丹屬兼性異交類型。

表2　藍花丹花粉胚珠比測定結(jié)果Table 2 Pollen/ovule ratio of Plumbago auriculata

2．4雜交指數(shù)( OCI)的測定結(jié)果

按照Dafni( 1993)的方法對藍花丹進行雜交指數(shù)的測量。藍花丹花冠直徑約為26 mm，計為3;雌蕊先于雄蕊成熟，計為0;雌蕊明顯高于或者低于雄蕊，計為1，統(tǒng)計得出藍花丹的雜交指數(shù)( OCI)為4，其繁育系統(tǒng)為異交型。這樣的結(jié)果與用P/O值測定出的繁育系統(tǒng)類型存在一定差異。

2．5人工控制授粉實驗

通過表3所示的結(jié)果可知，在不去雄自然套袋、人工同型同株自交、人工同型異株自交的處理下，藍花丹的長花柱型花和短花柱型花結(jié)實率都為0;不套袋的自然傳粉處理結(jié)果顯示:長花柱花的自然結(jié)實率為( 3．33±2．72) %，短花柱花的自然結(jié)實率為( 10．00±4．73) %。而人工輔助異型花雜交的處理中，結(jié)實率則分別高達( 90．00±4．71) %( S×L)和( 83．33±2．74) %( L×S)。此結(jié)果表明:藍花丹具有自交不親和性;人工輔助異花雜交能極大程度上提高該植物的結(jié)實率。

3　討論

根據(jù)成功授粉并產(chǎn)生種子的四個條件，本研究從3個層面得出的結(jié)果，在一定程度上對自然條件下藍花丹種子結(jié)實量低的原因給予了解釋。

首先，在性成熟的時間上，本研究表明藍花丹L型雌器官與S型雄器官、L型雄器官與L型雌器官成熟時間重疊區(qū)域較多，雌雄性器官在成熟時間上沒有顯著的差異;而S型雌器官與L型雄器官、S型雌器官與S型雄器官成熟時間重疊區(qū)域較少，存在一定的生殖隔離。趙志惠( 2012)研究表明藍花丹群體的整個開花持續(xù)期為130 d，個體水平振幅為5，開花同步指數(shù)為0．98，呈現(xiàn)一種大量、分散的開放模式。開花不同步性使得整個花期植株周圍總有異型的成熟花柱或花藥，從而保證花期各個時間段都有充足的花粉供給柱頭，在一定程度上緩解了雌雄器官成熟時間上差異帶來的生殖隔離。因此，藍花丹S型雌器官與L型雄器官、S型雌器官與S型雄器官成熟重疊時間短不會影響結(jié)實率。

表3　藍花丹人工輔助授粉的測定結(jié)果Table 3 Determination results of artificial pollination experiment on Plumbago auriculata

其次，傳粉者作為花粉到柱頭的媒介，其到訪頻率和傳粉的有效性顯著影響到植物的生殖成功。本研究結(jié)果顯示，在一致的環(huán)境下，人工型間授粉后的結(jié)實率遠高于自然傳粉后的結(jié)實率，這說明自然條件下，藍花丹存在花粉限制。通常情況，藍花丹昆蟲到訪率很低，F(xiàn)errero et al( 2009)研究表明長喙虻( Philoliche aethiopica)是藍花丹的重要花粉傳播者，達摩蝴蝶( Papilio demodocus)為偶然到訪者，且這類傳粉者傳粉效率不高，由于藍花丹的原產(chǎn)地為南非，大多在中國被引種到華南、華東、西南等地為綠化樹種，其地理位置和氣候狀況與原產(chǎn)地相比具有一定差異。陸寶麟等( 2003)研究表明長喙虻在中國主要分布于西藏，因此推測出藍花丹的花粉限制是因為傳粉媒介的缺乏。同時由于藍花丹開花模式具有不集中，持續(xù)時間長，日均開花量少的特點，與同期的其他物種相比，開花時對傳粉者沒有足夠的吸引力，也使得傳粉者訪問頻率低，導致花粉落滯率低。由此推測缺乏合適的傳粉者及適宜的訪花頻率使得自然條件下藍花丹缺乏植株間的花粉交流，這是藍花丹自然結(jié)實率低的重要原因之一。

花粉成功到達柱頭后，柱頭與花粉是否親和成為限制植物結(jié)實的關鍵。植物繁育系統(tǒng)的測定中常用到P/O、OCI測定和人工控制授粉(何平，2005;周紅軍等，2003;張仁波等，2006;何亞平等，2003;賴家業(yè)等，2008;張文標等，2009，秦墾等，2009)。本研究中，P/O結(jié)果顯示藍花丹為兼性異交，而OCI及人工控制授粉結(jié)果顯示其為專性異交。OCI檢測是從植物形態(tài)適應蟲媒傳粉出發(fā)，相對于P/O正確性更高(張健等，2009)。因此兩者結(jié)果出現(xiàn)差異時，通常取OCI值作為最后判定植物繁育系統(tǒng)的依據(jù)。人工控制授粉試驗則排除了環(huán)境因素和授粉過程的差異，直接關注花柱和花粉的識別對結(jié)實率的影響，為三種方法中最為有效的檢測方式。本研究綜合三種測定的方法結(jié)果，判定藍花丹為專性異交。

人工控制授粉中，長花柱型花和短花柱型花，不論自然套袋、人工同型同株自交、人工同型異株自交均不會結(jié)實。而型間人工授粉后結(jié)實率高達( 83．33 ±2．74) %和( 90．00±4．71) %。型間和型內(nèi)結(jié)實率的巨大懸殊說明自交不親和性在藍花丹的生殖上起著決定性作用。一般認為，在二型花柱植物中，型間的交配是合法的，而型內(nèi)交配則表現(xiàn)出不親和性，如安徽羽葉報春等異型花授粉的結(jié)籽數(shù)均明顯高于自花授粉和同型異花授粉結(jié)籽數(shù)(邵劍文等，2011)。艷麗耳草長/短花柱型花型間異交花粉管生長形態(tài)正常，而長/短花柱型花在自交及型內(nèi)自交下均表現(xiàn)為不親和(劉欣欣等，2012)。作為專性異交植物，因為強烈的自交不親和特性而在自然條件下對花粉有著甄別作用，要想授粉成功要求藍花丹種群有合適的型比，以及型間保持適宜的距離便于生殖。在缺乏某一型的種群中或種群中型間距離過長時，就會因為自交不親和特性而導致較低的自然結(jié)實率。白花丹屬的紫花丹也有相似現(xiàn)象(吳征鎰，2004)。

綜上所述，傳粉者的缺乏和自交不親和的特性共同影響藍花丹的自然結(jié)實率。其中，雌雄性器官成熟期相遇時間短不是主要原因;缺乏有效的傳粉者可能是重要的外因，而較強的自交不親和性則有可能是其結(jié)實率低下的關鍵性內(nèi)因。因此提高外來優(yōu)良物種藍花丹的結(jié)實率，要從引入安全的傳粉昆蟲和克服自交不親和性入手。

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Pollination biology and the breeding system of Plumbago auriculata low seed-setratio

WU Pei-Wen1，GAO Su-Ping2*，ZHANG Shuo1，ZHAO Zhi-Hui1

( 1．College of Landscape Architecture，Sichuan Agricultural Uniersity，Chengdu 611130，China; 2．Landscape Research Institute of Sichuan Agricultural University，Chengdu 611130，China )

Abstract:In order to explain the main reasons for the low natural seed-set ratio of Plumbago auriculata，which can contribute to the large-scale production of P．a(chǎn)uriculata and also help to get rid of the situation that the seeds over-rely on the import from abroad at the same time．We attempted to measured the dynamic changes of the pollen viability by the method of TTC and the stigma receptivity and the method of Benzidine-H2O2in two ways，which respectively focused more on the pollination biology and the breeding system．And we also estimated the type of the breeding system pollenovule ratio ( P/O)，and verified the out-crossing index ( OCI) by the pollination experiments．The results of the experiment were as follows: ( 1) About P．a(chǎn)uriculata，the maturity time of the L-type female organs and the S-type male organs，and also that of the L-type female organs and the L-type male organs overlaped a lot，there was no obvious difference in the maturity time between the female and the male organs．On the other hand，the maturity time of the S-type female organs and the L-type male organs，and also that of the S-type female organs and the S-type male organs overlapedbook=108,ebook=113a little，but the continuous blossoming pattern of P．a(chǎn)uriculata reduced reproductive isolation caused by the different maturity time of the male and the female sexual organs．( 2) The P/O of L-type was 502±52．30，the P/O of S-type 482．7± 87．91，both the out-crossing index of the L-type and that of the S-type are 4．The result of the manual-controlled pollination experiments suggested that the breeding system of P．a(chǎn)uriculata was obligate outcrossing and it had the feature of the heteromorphic incompatibility．To sum up，the reasons for the low natural seed-set ratio of P．a(chǎn)uriculata were the combination of both internal and external factors．Among these factors，the short same maturity time of the male and the female sexual organs was not the main reason，while the strong self-incompatibility of P．a(chǎn)uriculata itself might be the key internal factor to lead to the low natural seed-set ratio．Due to the breeding system of the obligate outcrossing，it was quite necessary for P．a(chǎn)uriculata to had the pollination medium to lead to the successful pollination．However，the introduction environment and the original environment were distinctly different，in addition，the mode of the scattered blooming led to the cross-pollinator，which might be the key external factor of low success rate of outcrossing．In a conclusion，the improvement of the natural seed-set ratio of P．a(chǎn)uriculata should mainly focus on overcoming the incompatibility of P．a(chǎn)uriculata itself，and also properly bringing in some insects as the safe medium．This would provide the theoretical guidance and the application foundation for the expansion of this kind of species resource and also the acceleration of the promotion and the application．

Key words:Plumbago auriculata，breeding system，pollination biology，seed-set ratio，self-incompatibility

*通訊作者:高素萍，博士，教授，主要從事觀賞植物生理生態(tài)研究，( E-mail) supingg@ hotmail．com。

作者簡介:吳佩紋( 1991-)女，四川廣安人，在讀碩士生，主要從事藍花丹繁殖研究，( E-mail) : 76794231@ qq．com。

基金項目:四川省科技支撐計劃項目( 2012FZ0083)［Supported by Science and Technology Support Program of Sichuan( 2012FZ0083)］。

收稿日期:2014-09-29修回日期: 2014-12-27

DOI:10．11931/guihaia．gxzw201409056

中圖分類號:Q945．5

文獻標識碼:A

文章編號:1000-3142( 2016) 01-0107-07