吳敏，方慶，師忠芳，徐立新，董麗萍，閆旭，楊少華,2，袁芳

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亞甲基藍(lán)對大鼠局灶性腦缺血再灌注后血腦屏障的保護(hù)作用①

吳敏1，方慶1，師忠芳1，徐立新1，董麗萍1，閆旭1，楊少華1,2，袁芳1

[摘要]目的探討亞甲基藍(lán)對大鼠局灶性腦缺血再灌注引起血腦屏障破壞的保護(hù)作用。方法雄性Sprague-Dawley大鼠18只隨機(jī)分為假手術(shù)組(n=6)、模型組(n=6)和亞甲基藍(lán)組(n=6)。用線栓法制備大鼠左側(cè)大腦中動(dòng)脈栓塞1 h再灌注模型。亞甲基藍(lán)組于再灌注即刻及再灌注2 h分別靜脈給予亞甲基藍(lán)3 mg/kg、1.5 mg/kg；模型組給予相同體積的生理鹽水；假手術(shù)組手術(shù)操作與模型組相同，不插入線栓，不靜脈注射藥物。再灌注47 h后HE染色觀察大鼠腦缺血周邊皮層組織學(xué)結(jié)構(gòu)，白蛋白免疫組化染色法檢測血腦屏障通透性的變化，免疫組化染色法和免疫熒光雙標(biāo)染色法檢測膠質(zhì)原纖維酸性蛋白(GFAP)和水通道蛋白-4(AQP-4)的表達(dá)。結(jié)果HE染色顯示，模型組缺血周邊大腦皮層的細(xì)胞和血管形態(tài)不完整，而亞甲基藍(lán)組病理變化減輕；模型組白蛋白、GFAP和AQP-4表達(dá)均明顯高于假手術(shù)組(P<0.01)，亞甲基藍(lán)組白蛋白、GFAP、AQP-4表達(dá)均低于模型組(P<0.05)。免疫熒光雙標(biāo)染色顯示，AQP-4與GFAP在星形膠質(zhì)細(xì)胞上共定位。結(jié)論亞甲基藍(lán)可能是通過減輕膠質(zhì)細(xì)胞增生及下調(diào)AQP-4表達(dá)來改善局灶性腦缺血再灌注損傷引起的血腦屏障破壞。

[關(guān)鍵詞]腦缺血再灌注；亞甲基藍(lán)；血腦屏障；膠質(zhì)原纖維酸性蛋白；水通道蛋白-4；大鼠

[本文著錄格式]吳敏，方慶，師忠芳，等.亞甲基藍(lán)對大鼠局灶性腦缺血再灌注后血腦屏障的保護(hù)作用[J].中國康復(fù)理論與實(shí)踐, 2016, 22(2): 125-131.

CITED AS: Wu M, Fang Q, Shi ZF, et al. Effect of methylene blue on blood-brain barrier after focal cerebral ischemia-reperfusion in rats [J]. Zhongguo Kangfu Lilun Yu Shijian, 2016, 22(2): 125-131.

作者單位：1.首都醫(yī)科大學(xué)北京市神經(jīng)外科研究所病理生理室，首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京天壇醫(yī)院，北京市100050；2.北德克薩斯大學(xué)醫(yī)學(xué)中心神經(jīng)與藥理系，美國德克薩斯州沃思堡76107。作者簡介：吳敏(1986-)，女，漢族，河北曲陽縣人，碩士研究生，主要研究方向：腦水腫的發(fā)病機(jī)制研究。通訊作者：袁芳，女，博士，研究員。E-mail: florayuan@vip.sina.com。

缺血性腦卒中是人類致殘、致死的主要疾病，腦缺血再灌注引起的血腦屏障(blood-brain barrier)破壞加重腦損傷[1]，因此改善血腦屏障功能是缺血性腦卒中治療的關(guān)注重點(diǎn)。亞甲基藍(lán)是1876年合成的藍(lán)色紡織染料，臨床上主要用于高鐵血紅蛋白血癥的治療[2]。近年來一些研究表明亞甲基藍(lán)對缺血性腦卒中有保護(hù)作用，包括改善神經(jīng)功能，減少腦梗死體積和腦水腫[3-7]。然而，到目前為止，僅有一項(xiàng)研究指出亞甲基藍(lán)對腦缺血再灌注損傷引起的血腦屏障破壞有保護(hù)作用，但其應(yīng)用的是豬心臟驟停12 min再灌注模型，且觀察的再灌注最長時(shí)間僅為自主循環(huán)恢復(fù)后6 h[8]。

本實(shí)驗(yàn)利用大鼠局灶性腦缺血1 h再灌注47 h模型，分別從血腦屏障通透性及星形膠質(zhì)細(xì)胞(astrocytes, AST)變化兩個(gè)方面來評價(jià)亞甲基藍(lán)對局部腦缺血再灌注引起血腦屏障損傷的保護(hù)作用，并初步探討其保護(hù)機(jī)制。

1　材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組

18只健康成年雄性SPF級Sprague-Dawley大鼠，體質(zhì)量280～320 g，由北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司提供，許可證號SCXK(京)2012-0001。適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，用隨機(jī)數(shù)字表法將大鼠分為假手術(shù)組、模型組和亞甲基藍(lán)組，每組6只，大鼠術(shù)前禁食12 h。

1.2主要實(shí)驗(yàn)試劑及儀器

亞甲基藍(lán)(M9140)：美國SIGMA-ALDRICH公司。伊紅(ZLI-9613)、蘇木素(ZLI-9610)、羅丹明標(biāo)記山羊抗兔熒光二抗(ZF-0316)、Alexa Fluor 488標(biāo)記山羊抗小鼠熒光二抗(ZF-0512)、抗熒光淬滅封片劑(ZLI-9556)：北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。膠質(zhì)原纖維酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein, GFAP)抗體(Z0334)、EnVision檢測試劑盒(A-K5007)：丹麥DAKO公司。水通道蛋白-4(aquaporin-4, AQP-4)抗體(ab128906, ab9512)、白蛋白抗體(ab106582)及山羊抗雞二抗(ab97135)：美國ABCAM公司。正置熒光顯微鏡(Axio Imager A2)：德國ZEISS公司。

1.3模型制備

大鼠以10%水合氯醛3.5 ml/kg腹腔注射麻醉，參照徐立新等[9]報(bào)道的線栓法制備左側(cè)大腦中動(dòng)脈阻塞再灌注模型，以大鼠手術(shù)麻醉清醒后出現(xiàn)右側(cè)肢體癱瘓、站立不穩(wěn)、提尾時(shí)向一側(cè)轉(zhuǎn)圈為模型成功的判斷標(biāo)準(zhǔn)。

亞甲基藍(lán)組大鼠腦缺血1 h再灌注即刻尾靜脈注射亞甲基藍(lán)3 mg/kg(30 min)，大鼠腦缺血再灌注2 h后再次尾靜脈注射亞甲基藍(lán)1.5 mg/kg(15 min)。

模型組用生理鹽水代替亞甲基藍(lán)等體積注射。

假手術(shù)組手術(shù)操作與模型組相同，不插入線栓，不靜脈注射藥物。

1.4組織學(xué)檢測

大鼠腦缺血1 h再灌注47 h，經(jīng)心臟灌流4%多聚甲醛，取出大腦。腦組織常規(guī)石蠟包埋、切片(片厚5 μm)，行HE染色。

1.5血腦屏障通透性檢查

用白蛋白免疫組化染色法檢查血腦屏障通透性的變化[10]。石蠟切片脫蠟至水，0.01 mol/L檸檬酸鹽緩沖液(pH=6.0)微波熱修復(fù)，自然冷卻至室溫后磷酸鹽緩沖液(phosphate buffered saline, PBS)充分漂洗。3% H2O2溶液中室溫避光孵育10 min，山羊血清室溫封閉1 h，滴加白蛋白一抗(1∶400)，4℃過夜。山羊抗雞二抗(1∶400)室溫孵育1 h，DAB顯色，蘇木素復(fù)染，脫水、透明、封片。正置熒光顯微鏡下觀察并拍照。陰性對照用PBS代替一抗，其余步驟相同。

1.6 GFAP及AQP-4免疫組化染色

免疫組化染色為二步法，應(yīng)用DAKO公司的Envision系統(tǒng)進(jìn)行。GFAP及AQP-4抗體1∶2000稀釋，4℃孵育過夜，然后按Envision系統(tǒng)的A-K5007試劑盒進(jìn)行顯色。陰性對照用PBS代替一抗，其余步驟相同。陽性細(xì)胞的染色為淺至棕褐色。

1.7 GFAP及AQP-4免疫熒光雙標(biāo)

0.01 mol/L檸檬酸鹽緩沖液(pH=6.0)微波熱修復(fù)，山羊血清封閉，分別滴加一抗(GFAP抗體1∶400稀釋、AQP-4抗體1∶100稀釋)，4℃孵育過夜。滴加熒光二抗(羅丹明標(biāo)記的山羊抗兔1∶200，Alexa Fluor 488標(biāo)記的山羊抗小鼠1∶200)，室溫孵育1 h，4', 6-二脒基-2-苯基吲哚(4',6-diamidino-2-phenylindole, DAPI)室溫孵育5 min，PBS洗滌，抗熒光淬滅封片劑封片。正置熒光顯微鏡觀察、拍照。陰性對照用PBS代替一抗，其余步驟相同。

1.8圖像分析

應(yīng)用Image-Pro Plus 6.0圖像分析軟件對免疫組化結(jié)果進(jìn)行圖像分析。1個(gè)標(biāo)本取1張切片，每張切片在鏡下(400×)隨機(jī)選取缺血周邊大腦皮層相鄰的5個(gè)非重疊視野，計(jì)算5個(gè)視野中免疫反應(yīng)陽性細(xì)胞積分光密度值(integrated option density, IOD)的平均值。

1.9統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 17.0軟件進(jìn)行單因素方差分析。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以(±s)表示，組間比較用最小顯著性差異法(least-significant difference, LSD)。顯著性水平α=0.05。

2　結(jié)果

2.1光鏡檢查

假手術(shù)組可見大腦皮層神經(jīng)元、膠質(zhì)細(xì)胞形態(tài)正常，結(jié)構(gòu)完整；神經(jīng)元胞漿豐富、均勻，胞核呈圓形或橢圓形，核仁清晰；血管形態(tài)光滑，彎曲自然，無間質(zhì)水腫。模型組缺血周邊大腦皮層神經(jīng)元、膠質(zhì)細(xì)胞的細(xì)胞間隙增寬，神經(jīng)纖維網(wǎng)呈空泡樣變；神經(jīng)元胞漿及胞膜形態(tài)不規(guī)則，邊界不清，胞核濃縮，部分細(xì)胞呈固縮狀；血管周圍間隙增寬。亞甲基藍(lán)組神經(jīng)元、膠質(zhì)細(xì)胞形態(tài)相對正常，結(jié)構(gòu)相對完整，病理變化輕；血管較光滑，血管周圍間隙增寬現(xiàn)象有明顯改善。見圖1。

圖1　腦缺血周邊皮層組織HE染色(400×)

2.2免疫組化染色

2.2.1白蛋白

假手術(shù)組腦組織無白蛋白漏出，胞漿內(nèi)可見輕微白蛋白陽性染色，呈淺褐色。模型組可見缺血周邊大腦皮層的神經(jīng)纖維網(wǎng)及胞漿內(nèi)均有白蛋白陽性染色，染色增強(qiáng)，神經(jīng)纖維網(wǎng)腫脹，呈海綿狀。經(jīng)亞甲基藍(lán)治療后，神經(jīng)纖維網(wǎng)及胞漿內(nèi)白蛋白陽性染色減少，神經(jīng)纖維網(wǎng)腫脹程度減輕，海綿狀不明顯。見圖2。

模型組白蛋白IOD明顯高于假手術(shù)組，亞甲基藍(lán)組白蛋白IOD明顯低于模型組(P<0.01)。見表1。

2.2.2 GFAP

GFAP為AST的特異性標(biāo)志物[11]。假手術(shù)組GFAP陽性細(xì)胞數(shù)較少，形態(tài)正常，著色為淺褐色；細(xì)胞突起細(xì)長，顯示出蜘蛛狀分支輪廓，細(xì)胞足突包繞血管。模型組缺血周邊大腦皮層的GFAP陽性細(xì)胞體積增大，著色深染；細(xì)胞突起增粗增厚，分支增多，細(xì)胞足突縮短，血管周圍間隙增寬。而亞甲基藍(lán)組缺血周邊大腦皮層的GFAP陽性細(xì)胞體積增大減輕；細(xì)胞突起分支減少，足突縮短情況有所改善，血管周圍間隙較模型組減小。見圖3。

模型組GFAP的IOD明顯高于假手術(shù)組(P< 0.01)，亞甲基藍(lán)組GFAP的IOD低于模型組(P< 0.05)，但仍高于假手術(shù)組(P<0.05)。見表1。

2.2.3 AQP-4

假手術(shù)組在血管周圍的AST足突可見淺棕褐色染色，呈微弱陽性表達(dá)，在胞膜及胞漿上也有少量表達(dá)。模型組可見在缺血周邊大腦皮層的血管周圍AST足突上AQP-4免疫組化染色增強(qiáng)，呈深棕褐色，在胞膜及胞漿內(nèi)的表達(dá)增多。亞甲基藍(lán)組AQP-4在血管周圍AST足突、胞膜及胞漿內(nèi)均有表達(dá)，著色較模型組淺。見圖4。

模型組AQP-4的IOD明顯高于假手術(shù)組(P< 0.01)，亞甲基藍(lán)組AQP-4的IOD明顯低于模型組(P< 0.01)。見表1。

2.2.4免疫熒光雙標(biāo)染色

其中GFAP陽性染色呈紅色，AQP-4陽性染色呈綠色，DAPI陽性為呈藍(lán)色的細(xì)胞核，染色結(jié)果顯示GFAP與AQP-4在AST突起上共表達(dá)，假手術(shù)組AQP-4主要表達(dá)在血管周圍的AST足突，模型組及亞甲基藍(lán)組AQP-4除在血管周圍的AST足突表達(dá)外，在AST胞體及突起也表達(dá)較多。見圖5。

圖2　腦缺血周邊皮層組織白蛋白免疫組化染色(400×)

圖3　腦缺血周邊皮層組織GFAP免疫組化染色(400×)

圖4　腦缺血周邊皮層組織AQP-4免疫組化染色(400×)

圖5　腦缺血周邊皮層組織GFAP與AQP-4免疫熒光雙標(biāo)染色(400×)

表1　腦缺血周邊皮層組織白蛋白、GFAP和AQP-4表達(dá)(IOD)

3　討論

在腦缺血再灌注損傷過程中，血腦屏障作為中樞神經(jīng)系統(tǒng)“守門人”及調(diào)節(jié)器，其結(jié)構(gòu)及功能均會(huì)遭到破壞，是導(dǎo)致腦損傷的關(guān)鍵環(huán)節(jié)[12]，因此改善血腦屏障的結(jié)構(gòu)及功能是腦缺血治療的重點(diǎn)。本實(shí)驗(yàn)利用大鼠局灶性腦缺血1 h再灌注47 h模型，首先通過HE染色證明亞甲基藍(lán)對大鼠腦缺血再灌注損傷有保護(hù)作用，其次通過檢測缺血周邊大腦皮層血腦屏障通透性以及GFAP、AQP-4等蛋白的表達(dá)變化，發(fā)現(xiàn)亞甲基藍(lán)對腦缺血再灌注引起的血腦屏障損傷有保護(hù)作用。

血腦屏障功能障礙表現(xiàn)為血腦屏障通透性增加。血清白蛋白是血液中分子量為65 kDa的內(nèi)源性蛋白質(zhì)，正常生理情況下由于血腦屏障的存在難以漏出到腦實(shí)質(zhì)內(nèi)。血腦屏障遭到破壞，會(huì)導(dǎo)致血清白蛋白從血管漏出到腦實(shí)質(zhì)內(nèi)[13-14]，因此檢測白蛋白漏出成為經(jīng)典的評價(jià)血腦屏障通透性的指標(biāo)[10]。

近些年的研究發(fā)現(xiàn)AQP-4是腦內(nèi)最豐富的水通道蛋白，主要表達(dá)在AST足突上，對維持血腦屏障完整性起重要作用[15]。我們在大鼠自由落體腦損傷模型中也觀察到，腦外傷引起血腦屏障通透性增加時(shí)，AQP-4表達(dá)增強(qiáng)[16]。因此AQP-4也被認(rèn)為是反映血腦屏障血管通透性的特異性標(biāo)志物[17]。

本實(shí)驗(yàn)分別利用白蛋白及AQP-4免疫組化染色法評估血腦屏障通透性的改變，發(fā)現(xiàn)腦缺血再灌注損傷引起血腦屏障通透性增加，亞甲基藍(lán)治療可以顯著減少白蛋白漏出及AQP-4表達(dá)增強(qiáng)，提示亞甲基藍(lán)能夠改善腦缺血再灌注損傷引起的血腦屏障破壞，與Miclescu等在豬的心臟驟停再灌注模型中觀察到的亞甲基藍(lán)對血腦屏障的保護(hù)作用一致[8]。

血腦屏障由毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞、細(xì)胞外基質(zhì)、AST足突和周細(xì)胞組成，阻止有毒物質(zhì)擴(kuò)散進(jìn)入腦組織，從而保護(hù)腦內(nèi)微環(huán)境穩(wěn)定?，F(xiàn)有的研究表明AST足突為血腦屏障提供結(jié)構(gòu)和功能支持[18]，與血腦屏障的形成及通透性密切相關(guān)[19]。Miclescu等的研究表明亞甲基藍(lán)對血腦屏障的改善作用可能是通過減少腦組織內(nèi)的一氧化氮代謝產(chǎn)物實(shí)現(xiàn)的[8]，本研究從AST角度探討亞甲基藍(lán)對血腦屏障的保護(hù)機(jī)制。

近年來的研究發(fā)現(xiàn)AST反應(yīng)性增生與血腦屏障通透性增加有關(guān)[20]。本實(shí)驗(yàn)中我們用GFAP免疫組化染色法檢測AST，觀察到大鼠局灶性腦缺血再灌注引起GFAP表達(dá)增加，AST形態(tài)發(fā)生改變，表現(xiàn)為增生、肥大，說明腦缺血再灌注引起AST反應(yīng)性增生。金媛媛等[21]、李德潔等[22]在大鼠腦缺血再灌注損傷模型中對GFAP表達(dá)變化的描述與我們的研究結(jié)果一致。Argaw等的研究表明，反應(yīng)性增生的AST分泌血管內(nèi)皮生長因子A(vascular endothelial growth factor- A, VEGF-A)增多，VEGF-A能夠增加血腦屏障的通透性從而導(dǎo)致血腦屏障破壞[23]。本實(shí)驗(yàn)中我們同時(shí)觀察到正常情況下AST突起細(xì)長，足突包繞毛細(xì)血管，而腦缺血再灌注引起的AST反應(yīng)性增生，導(dǎo)致AST突起增粗增厚，足突縮短，血管周圍間隙增寬。Mani等利用VEGF誘導(dǎo)AST反應(yīng)性增生也觀察到AST足突從血管處縮回的現(xiàn)象[24]。有研究表明毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞之間的緊密連接由AST足突與血管接觸誘導(dǎo)產(chǎn)生[25-26]，因此我們推測反應(yīng)性增生的AST足突從血管處縮回也可能是大鼠局灶性腦缺血再灌注引起血腦屏障通透性增加的原因之一。

值得注意的是，近些年的研究發(fā)現(xiàn)AQP-4表達(dá)增加與AST反應(yīng)性增生有直接關(guān)系[17]，本實(shí)驗(yàn)也觀察到相同的現(xiàn)象。我們應(yīng)用GFAP與AQP-4免疫熒光雙標(biāo)染色發(fā)現(xiàn)正常情況下AQP-4主要表達(dá)在血管周圍的AST足突，大鼠局灶性腦缺血再灌注引起AQP-4在AST足突及胞體表達(dá)增多，與GFAP表達(dá)增加一致。

因此，腦缺血再灌注引起AST增生(包括AST足突縮回)以及AQP-4表達(dá)增加可能導(dǎo)致血腦屏障功能破壞，亞甲基藍(lán)干預(yù)減輕了大鼠局灶性腦缺血再灌注引起的AST過度增生及AQP-4表達(dá)增加，可能與亞甲基藍(lán)對血腦屏障的保護(hù)作用有關(guān)。

我們已有的研究結(jié)果表明，亞甲基藍(lán)是一種線粒體電子載體的替代物[27]，能夠改善局灶性腦缺血1 h再灌注47 h引起的腦水腫[4]。本實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)亞甲基藍(lán)對腦缺血再灌注引起的血腦屏障障礙有改善作用，推測亞甲基藍(lán)對血腦屏障的保護(hù)作用可能是通過減輕AST反應(yīng)性增生及下調(diào)AQP-4表達(dá)實(shí)現(xiàn)的，但其分子機(jī)制還有待深入研究。本研究結(jié)果為缺血性腦卒中的治療提供了新的思路。

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Effect of Methylene Blue on Blood-brain Barrier after Focal Cerebral Ischemia-reperfusion in Rats

WU Min1, FANG Qing1, SHI Zhong-fang1, XU Li-xin1, DONG Li-ping1, YAN Xu1, YANG Shao-hua1,2, YUAN Fang1
1. Department of Pathophysiology, Beijing Neurosurgical Institute, Beijing Tiantan Hospital, Capital Medical University, Beijing 100050, China; 2. Department of Pharmacology and Neuroscience, University of North Texas Health Science Center, Fort Worth, Texas 76107, USA

Correspondence to YUAN Fang. E-mail: florayuan@vip.sina.com

Abstract:Objective To investigate the protective effect of methylene blue (MB) on blood-brain barrier (BBB) injury after focal cerebral ischemia-reperfusion in rats. Methods 18 male Sprague-Dawley rats were randomly divided into sham-operated group (n=6), model group (n=6) and MB treatment group (n=6). The left middle cerebral arteries were occluded for 1 hour and reperfused. MB was infused intravenously immediately after reperfusion (3 mg/kg) and again 2 hours post-reperfusion (1.5 mg/kg), while normal saline was administered in the model group. The sham-operated group was treated as same as the model group without occlusion and infusion. HE staining was used to observe the histological injury in the cortex around the infarcted region 47 hours after reperfusion, while albumin immunohistochemistry was used to evaluate the permeability of the BBB, and immunohistochemistry and double immunofluorescence staining were used to examine the expressions of glial fibrillary acidic protein (GFAP) and aquaporin-4 (AQP-4). Results HE staining showed that cells and blood vessels were not intact in the cortex around the infarcted region in the model group and they were better in the MB treatment group. The expressions of the albumin, GFAP and AQP-4 were higher in the model group than in the sham-operated group (P<0.01), and were lower in MB treatment group than in the model group (P<0.05). The double immunofluorescence staining showed the colocalization of GFAP and AQP-4 in the astrocytes. Conclusion MB may ameliorate the BBB disruption induced by focal cerebral ischemia-reperfusion through reducing gliocyte proliferation and down-regulation of AQP-4 expression in rats.

Key words:cerebral ischemia-reperfusion; methylene blue; blood-brain barrier; glial fibrillary acidic protein; aquaporin-4; rats

(收稿日期：2015-12-01修回日期：2015-12-11)

基金項(xiàng)目：國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(No. 81271286; No. 81228009)。

DOI:10.3969/j.issn.1006-9771.2016.02.001

[中圖分類號]R743.3

[文獻(xiàn)標(biāo)識碼]A

[文章編號]1006-9771(2016)02-0125-07