米慧娟，王永香，張慶芬，吳 云，王振中，蕭 偉＊＊

（1. 江蘇康緣藥業(yè)股份有限公司 連云港 222001；

2. 中藥制藥過程新技術(shù)國家重點實驗室 連云港 222001）

江西省樟樹縣GAP基地不同采收時間梔子藥材的質(zhì)量研究＊

米慧娟1，2，王永香1，2，張慶芬1，2，吳 云1，2，王振中1，2，蕭 偉1，2＊＊

（1. 江蘇康緣藥業(yè)股份有限公司 連云港 222001；

2. 中藥制藥過程新技術(shù)國家重點實驗室 連云港 222001）

目的：研究江西省樟樹縣 GAP 基地不同采收時間梔子藥材中梔子苷、京尼平龍膽雙糖苷、西紅花苷 I、京尼平苷酸、綠原酸、隱綠原酸 6 種主要藥效成分含量及液相指紋圖譜相似度的變化規(guī)律，為江西省樟樹縣 GAP 基地梔子藥材最佳采收期的確定提供理論依據(jù)。方法：以梔子藥材 6 種主要藥效成分含量及液相指紋圖譜相似度為指標(biāo)，考察 9 個不同采收時間梔子藥材質(zhì)量。結(jié)果：不同采收時間的梔子藥材質(zhì)量有明顯差異。結(jié)論：江西省樟樹縣 GAP 基地的梔子藥材的最佳采收時間為 10 月中旬至 11 月中旬，果實呈紅黃色。

樟樹縣藥材 GAP 基地 梔子 液相指紋圖譜 質(zhì)量

梔子為茜草科植物梔子Gardenia jasminoides Ellis的干燥成熟果實，具有瀉火除煩，清熱利濕，涼血解毒等作用，主要治療熱病心煩，濕熱黃疸，淋證澀痛，血熱吐衄，目赤腫痛，火毒瘡瘍，外治扭挫傷痛[1，2]，為常用的中藥材。伴隨中藥“國際化”的潮流，2003 年9月國家藥品監(jiān)督管理局制訂了中國中藥材生產(chǎn)質(zhì)量管理規(guī)范（GAP），對中藥材生產(chǎn)的基地選定、品種栽培、采收加工、質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)等做出了相應(yīng)規(guī)定[3，4]。江西省樟樹縣的藥材種植源遠流長，總面積18 萬畝，千畝以上基地 18 個，品種以“三子一殼”（梔子、吳茱子、車前子、枳殼）為主，形成江西道地中藥材主產(chǎn)區(qū)[5-7]。梔子藥材生產(chǎn)基地通過了國家 GAP認證，2013 年梔子種植面積已達 11.5 萬畝，約占全國產(chǎn)量的 83%，產(chǎn)值近 10 億元。

現(xiàn)代藥理研究表明，梔子具有抗炎、鎮(zhèn)靜、鎮(zhèn)痛、保肝利膽、抗凝血、抗氧化等作用[8-13]，環(huán)烯醚萜類和二萜色素類化合物是梔子的主要成分，也是其主要生物活性成分[14，15]。為了確定樟樹縣 GAP 基地梔子藥材的最佳采收時間，本文以梔子藥材高效液相指紋圖譜中的梔子苷、京尼平龍膽雙糖苷、西紅花苷I、京尼平苷酸、綠原酸、隱綠原酸 6個主要藥效成分為指標(biāo)，考察江西省樟樹縣 GAP 基地梔子藥材不同采收時間的質(zhì)量變化規(guī)律，確定梔子藥材最佳采收期，為梔子最佳采收時間的確定提供理論依據(jù)。

1 儀器與材料

高效液相色譜儀 Agilent 1100（美國安捷倫公司）；DAD 檢測器（美國安捷倫公司）；LK-200A 100 g 手提式高速中藥粉碎機（浙江溫嶺市創(chuàng)立藥材儀器廠），電子天平（Sartorius公司）；KQ-250B 型數(shù)控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；DHG-9145A 9000 系電熱鼓風(fēng)干燥箱（上海一恒科學(xué)儀器有限公司）；梔子苷對照品（中國食品藥品檢定研究院，批號：110749-200512）；京尼平龍膽雙糖苷（成都曼斯特公司，批號：MUST-111120，純度≥98%）；西紅花苷 I （中國食品藥品檢定研究院，批號：110588-200102）；京尼平苷酸（中國食品藥品檢定研究院，批號：111828-200903 )；綠原酸（中國食品藥品檢定研究院，批號：110753-200914）；隱綠原酸（美國Sigma公司，批號：101245643，純度≥98%）；磷酸（國藥集團化學(xué)試劑有限公司，批號：20120703），甲醇、乙腈為色譜純（Tedia Company），水為重蒸餾水。

本研究中的梔子藥材均經(jīng)康濟大藥房吳舟中藥執(zhí)業(yè)藥師鑒定為茜草科植物梔子Gardenia jasminoides Ellis的干燥成熟果實。

2 方法與結(jié)果

2.1 梔子藥材采收時間分布

2010版一部《中國藥典》對梔子采收期描述為“9-11月果實成熟呈紅黃色時采收”，結(jié)合藥典要求及傳統(tǒng)采收經(jīng)驗，本實驗在江西省樟樹縣梔子藥材GAP 基地同一地塊自2012 年9月10日開始采摘，2012 年11月30日采摘結(jié)束，每間隔10天采摘一次，每次采摘兩份樣品，每份樣品平行檢測兩次。9個不同采收時間樣品均采用相同干燥方法（60℃常壓烘干）獲得干燥樣品。梔子藥材的采收時間及干燥品色澤見表 1。

表1 梔子藥材采收時間及藥材干燥品性狀

2.2 藥效指標(biāo)含量測定方法

含量測定指標(biāo)有梔子苷、京尼平苷龍膽雙糖苷、西紅花苷I、京尼平苷酸、綠原酸、隱綠原酸。

2.2.1 色譜條件

色譜柱：Kromasil C18（250 × 4.6 mm），流動相：乙腈（A）- 0.1%磷酸溶液（B），洗脫梯度：0-10 min，5%-10%（A）；10-20 min，10%-18%（A）；20-30min，18%-20% ( A )；30 -40 min，20%-45% ( A )；40-50 min，45%-5% ( A )。流速：1 mL / min，柱溫：30℃，DAD 檢測器的檢測波長：238 nm、324 nm、440 nm；進樣量：10 μL。

2.2.2 對照品溶液的制備

分別精密稱量梔子苷 14.012 mg、京尼平苷龍膽雙糖苷 2.502 mg、西紅花苷I 0.045 mg、京尼平苷酸 0.160 mg、綠原酸 0.410 mg、隱綠原酸 0.097 mg，置 25 mL 容量瓶中，加50% 甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻后及得質(zhì)量濃度分別為 560.48、100.08、1.80、6.40、16.40、3.88 μg·mL-1混合對照品溶液。見圖1。

2.2.3 供試品溶液的制備

取梔子粉末（過60目篩）0.5 g，精密稱定，置于錐形瓶中，精密加入30%甲醇25 mL，稱定重量，超聲處理40 min，放冷，補足失重，搖勻，過濾。取續(xù)濾液1 mL于5 mL的容量瓶中，用50%甲醇稀釋、定容至刻度，12 000 rpm 離心，取上清液，即得供試品溶液。見圖2。

2.2.4 方法學(xué)考察

（1）線性關(guān)系考察

分別精密稱取梔子苷 50 mg、京尼平苷龍膽雙糖苷 5 mg、西紅花苷I 0.05 mg、京尼平苷酸 1 mg、綠原酸 1 mg、隱綠原酸 0.1 mg，置 25 mL 量瓶中，加 50% 甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得混合對照品溶液。對混合對照品進行 0、2.5、5、10、20、40 倍稀釋，分別精密吸取上述對照品溶液各 10 μL，注入高效液相色譜儀，測定。以對照品質(zhì)量濃度（mg·L-1）為橫坐標(biāo)（X），峰面積為縱坐標(biāo)（Y），繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。梔子苷回歸方程 Y=4.521 X-8.715，r=0.999，線性范圍50-2 000 μg·L-1；京尼平苷龍膽雙糖苷Y=3.987X-3.451，r=0.999 9，線性范圍5-200 μg·L-1；西紅花苷 I 回歸方程 Y = 5.460 X - 4.651，r = 1，線性范圍 0.05-2 μg·L-1；京尼平苷酸回歸方程Y=3.190X-7.623，r = 1，線性范圍-40 μg·L-1；綠原酸回歸方程 Y＝7.512 X-6.132， r = 0.999 9，線性范圍 1-40 μg·L-1；隱綠原酸回歸方程Y=4.765X-2.75，r=0.999 9，線性范圍0.1-4.0 μg·L-1。

圖1 混合對照品高效液相色譜圖

（2）精密度實驗

取上述線性關(guān)系考察的混合對照品溶液（梔子苷56.048 μg·mL-1、京尼平苷龍膽雙糖苷10.008 μg·mL-1、西紅花苷I 0.18 μg·mL-1、京尼平苷酸0.64 μg·mL-1、綠原酸1.64 μg·mL-1、隱綠原酸 0.388 μg·mL-1），按“2.2.2”項下色譜條件，重復(fù)進樣6次，測定梔子苷、京尼平苷龍膽雙糖苷、西紅花苷I、京尼平苷酸、綠原酸、隱綠原酸的峰面積，測定各物質(zhì)峰面積的RSD值分別為0.28%、0.57%、0.83%、0.43%、0.57%和0.54%。結(jié)果表明儀器精密度良好，符合含量測定的要求。

（3）重復(fù)性考察

取同一批梔子藥材（120910），按上述色譜方法平行制備供試品溶液6份，分別測定梔子苷、京尼平苷龍膽雙糖苷、西紅花苷I、京尼平苷酸、綠原酸、隱綠原酸6種物質(zhì)含量，各物質(zhì)含量測定結(jié)果的RSD值分別為0.85%、0.93%、1.21%、0.87%、1.04%、1.63%和1.47%。結(jié)果表明，該法重復(fù)性良好。

（4）穩(wěn)定性考察

取同一供試品溶液，分別放置0、4、8、12、16、24 h，按上述色譜方法測定供試品中梔子苷、京尼平苷龍膽雙糖苷、西紅花苷I、京尼平苷酸、綠原酸、隱綠原酸的峰面積，計算各物質(zhì)的RSD值分別為0.25%、0.35%、0.75%、1.04%、0.84%和0.83%。結(jié)果顯示，供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

圖2 混合對照和樣品HPLC色譜圖

（5）加樣回收率考察

取120910批梔子藥材（梔子苷38.03 mg·g-1、京尼平苷龍膽雙糖苷8.87 mg·g-1、西紅花苷I 0.34 mg·g-1、京尼平苷酸0.64 mg·g-1、綠原酸1.72 mg·g-1、隱綠原酸0.35 mg·g-1）6份，精密稱定，分別精密加入精密度考察項下的混合對照品溶液，按“2.2.1”項下制備供試品溶液，按上述色譜方法進樣測定，計算回收率，結(jié)果分別為99.1%、99.6%、99.4%、101.4%、100.3%和98.7%。結(jié)果表明，該法回收率良好。

該色譜方法經(jīng)過精密度、重復(fù)性、穩(wěn)定性、加樣回收率試驗，結(jié)果顯示該方法穩(wěn)定可重復(fù)，可用于梔子藥材指紋圖譜的測定。

2.3 梔子藥材指紋圖譜測定方法

2.3.1 色譜條件

Agilent 1100 液相色譜儀，色譜柱：Phenomenex luna C18（4.6 × 250 mm，5 μm）；流動相：甲醇（A）- 0.1%磷酸水溶液（B），洗脫程序為：0-50 min，20%-60%（A）；50-60min，60%（A）。流速： 0.8 mL·min-1；檢測波長：225 nm。分別精密吸取參照物溶液與供試品溶液各 10 μL，注入液相色譜儀，測定。按參照物梔子苷的峰面積計算，理論板數(shù)不低于6 000。

參照物溶液的制備：取梔子苷對照品，精密稱定，加甲醇制成每 1 mL含 50 mg的溶液，即得。

2.3.2 供試品溶液的制備

取梔子藥材，粉碎（過60目篩），取細粉約 0.1 g，精密稱定，置 50 mL 錐形瓶中，精密加入甲醇 25 mL，超聲 40 min，過濾，取續(xù)濾液，即得。

2.3.3 方法學(xué)考察

（1）精密度考察

取120901批梔子粉末，按“供試品溶液的制備”方法制備供試品溶液，同一供試品溶液連續(xù)進樣6次，結(jié)果各相對保留時間的RSD值小于3%，相對峰面積的RSD值小于3%。結(jié)果表明，該方法精密度良好。

（2）重復(fù)性考察

取同一批梔子粉末5份，精密稱定，按“供試品溶液的制備”方法制備供試品溶液，進樣檢測，結(jié)果各相對保留時間的RSD值小于3%，相對峰面積的RSD值小于3%。結(jié)果表明，該方法重復(fù)性良好。

（3）穩(wěn)定性考察

取同一供試品溶液，分別于0、4、8、12、16、24 h進樣檢測，結(jié)果各相對保留時間小于3%，相對峰面積小于3%。結(jié)果表明，供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.3.4 梔子藥材標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜

取江西省樟樹縣、新干縣、泰和縣、永豐縣市售梔子藥材各 5 個樣本，共 20 個樣本構(gòu)建梔子藥材標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜。用國家藥典委員會提供的中藥色譜指紋圖譜相似度評價軟件，根據(jù)《中藥指紋圖譜研究的技術(shù)要求》，將 20 批次梔子圖譜數(shù)據(jù)導(dǎo)入《中藥指紋圖譜相似度計算軟件A版》，匹配后圖譜如圖 3。

以這 20 批供試品指紋圖譜為基礎(chǔ)獲得含有 5個 共有峰的“共有模式指紋圖譜”作為標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜，標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜如圖 4。

2.5 實驗結(jié)果

按照“2.2”、“2.3”項下多成分含量測定及液相指紋圖譜方法，測定表 1 中不同采收時間梔子樣本中梔子苷、京尼平龍膽雙糖苷、西紅花苷 I、京尼平苷酸、綠原酸、隱綠原酸的含量及液相指紋相似度，每個時間段分別采收兩個樣本，每個樣本取兩份平行樣進行檢測。本文以各檢測指標(biāo)為觀測變量，采收時間段為控制變量，使用IBM SPSS 20.0 統(tǒng)計分析軟件進行單因素方差分析，判斷不同采收時間段各觀測指標(biāo)檢測值是否存在顯著性差異。各觀測指標(biāo)均值見表2，方差分析結(jié)果見表3，由方差分析結(jié)果可以看出，采收時間對梔子藥材中京尼平苷酸含量無顯著影響，對梔子苷、京尼平龍膽雙糖苷、西紅花苷 I、綠原酸、隱綠原酸和指紋圖譜相似度具有顯著影響。

2.5 實驗結(jié)果聚類分析

圖3 梔子藥材液相指紋匹配后圖譜

圖4 梔子藥材對照指紋圖譜 ( 225 nm )

表2 不同采收時間段梔子藥材中6種藥效成分含量均值/mg·g-1

表3 7個指標(biāo)單因素方差分析結(jié)果

將梔子苷、京尼平龍膽雙糖苷、西紅花苷 I、綠原酸、隱綠原酸、液相指紋相似度共6個結(jié)果數(shù)據(jù)輸入 SPSS 20.0，使用組間聯(lián)接聚類方法，距離的計算方法選擇Euclidean distance，因參與聚類分析的變量存在數(shù)量級上的差異，消除數(shù)量級差的方法選擇全距從 0 到 1 進行系統(tǒng)聚類分析，分析結(jié)果見圖5。120910、120920、120930、121130 聚為一類，此類采收期為 9 月份及 11 月底，9 月梔子果實從色澤上看還是青灰色，果實未完全成熟，梔子苷、綠原酸、液相指紋圖譜相似度均較低，121130 為 11 月30 日采收的樣本外觀觀察為熟過的果實，各成分指標(biāo)均有所降低。121010、121020、121030、121110、11120 聚為一類，此類樣品色澤為黃色或紅黃色，此時主要含測指標(biāo)和液相指紋相似度均達到最高值。聚類結(jié)果顯示，10 月到 11 月中旬為樟樹縣 GAP 基地最佳采收時間。

3 討論

梔子藥材為常用的中藥材之一，已有2 000多年的應(yīng)用歷史。2010 版中國藥典一部梔子項下描述其采收時間為“9-11月果實成熟呈紅黃色時采收”采收時間范圍為 2 個月時間，由于梔子各主要產(chǎn)區(qū)地理氣候均不相同，為了確定江西樟樹縣梔子GAP 基地梔子藥材最佳采收時間，本文根據(jù) 9 個不同采收時間梔子藥材中 6 個藥效成分含量及液相指紋圖譜相似度，使用 SPSS 20.0 軟件中聚類分析方法，確定江西樟樹縣梔子 GAP 基地梔子藥材最佳采收時間。實驗結(jié)果表明梔子藥材不同采收時間梔子苷、京尼平苷酸、京尼平龍膽雙糖苷、綠原酸、隱綠原酸、西紅花苷 I 的含量值及液相指紋相似度均有明顯變化，各指標(biāo)含量穩(wěn)定且處于高峰值的時間范圍為 10 月 10 日 到 11 月 20 日。

圖 5 不同采收時間梔子樣本聚類分析圖

本文在藥典規(guī)定的梔子采收時間范圍內(nèi)進一步確定了江西樟樹縣GAP 基地的梔子藥材的最佳采收時間，為基地梔子藥材采收時間的確定提供了理論依據(jù)。

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Gardenia Quality Research within Different Harvesting Periods in the GAP Base in Zhangshu County of Jiangxi Province

Mi Huijuan1,2, Wang Yongxiang1,2, Zhang Qingfen1,2, Wu Yun1,2, Wang Zhenzhong1,2, Xiao Wei1,2
(1. Jiangsu Kanion Pharmaceutical Co., Ltd., Lianyungang 222001, China;
2. State Key Laboratory of New-Tech for Chinese Medicine Pharmaceutical Process, Lianyungang 222001, China)

This study aimed to determine the best harvest time of gardenias in the GAP base in Zhangshu County, Jiangxi Province of China. Similarities of HPLC fingerprints and the contents of six activity ingredients, including geniposide, genipin 1-gentiobioside, crocin I, geniposidic acid, chlorogenic acid and 4-dicaffeoylquinic acid, were detected from various gardenias of nine separated harvest periods. The contents and similarities of HPLC fingerprints of gardenias were the main indexes. As a result, the nine kinds of gardenias presented different qualities. In conclusion, period from mid-October to mid-November was the best time for gardenia harvest, as the fruit presenting red and yellow.

GAP base of Zhangshu County, gardenia, HPLC fingerprint, quality

10.11842/wst.2016.08.025

R283.6

A

（責(zé)任編輯：馬雅靜，責(zé)任譯審：朱黎婷）

2015-04-02

修回日期：2015-04-04

＊ 科學(xué)技術(shù)部“重大新藥創(chuàng)制”科技重大專項（2013ZX09402203）：現(xiàn)代中藥創(chuàng)新集群與數(shù)字制藥技術(shù)平臺，負責(zé)人：王振中。

＊＊ 通訊作者：蕭偉，本刊編委，博士，研究員級高級工程師，主要研究方向：中藥制劑和創(chuàng)新中藥的研究與開發(fā)。