沈宏偉，楊曉兵，龔志偉，靳國杰，趙宗保

（中國科學(xué)院大連化學(xué)物理研究所，遼寧 大連116023）

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基于消耗碳氮比進行底物分配和油脂得率預(yù)測

沈宏偉，楊曉兵，龔志偉，靳國杰，趙宗保

（中國科學(xué)院大連化學(xué)物理研究所，遼寧 大連116023）

摘要：微生物油脂作為胞內(nèi)代謝產(chǎn)物，其脂肪酸組成和植物油類似，是生物柴油和油脂工業(yè)理想替代原料。為了進一步了解底物中碳氮比對油脂合成的影響，通過恒化培養(yǎng)的方法，研究了圓紅冬孢酵母在不同稀釋率條件下，消耗碳氮比和底物在油脂和非油生物量之間的分配以及和油脂得率之間的關(guān)系。通過碳、氫、氧和氮的化學(xué)反應(yīng)計量學(xué)分析，并根據(jù)不同稀釋率穩(wěn)態(tài)時所消耗C/N比，構(gòu)建了底物碳在油脂和非油生物量之間的分配模型。利用實驗數(shù)據(jù)確定了模型參數(shù)：最大油脂碳得率，最大菌體碳得率為0.52 mol C·(mol C)-1，促使油脂合成的臨界C/N比為12.1 mol C·(mol C)-1。利用該分配模型預(yù)測不同消耗C/N比的油脂得率，預(yù)測值為實驗值的 95.2%～116.7%，表明模型可靠性較好。

關(guān)鍵詞：發(fā)酵；生物過程；模型；參數(shù)估值；碳氮比；微生物油脂

2015-04-13收到初稿，2015-06-05收到修改稿。

聯(lián)系人：趙宗保。第一作者：沈宏偉（1976—），男，博士，助理研究員。

Received date: 2015-04-13.

引 言

一些產(chǎn)油微生物在營養(yǎng)成分限制和碳源過量的條件下，將過量碳源轉(zhuǎn)化合成甘油三酯，并儲存在細胞內(nèi)部，這些油脂被稱為微生物油脂，也稱單細胞油脂[1]。大部分微生物油脂的脂肪酸組成和植物油類似，主要為十六碳和十八碳脂肪酸，是生物柴油潛在的理想替代原料。微生物油脂生產(chǎn)具有周期短，不受時間、地點等條件的限制，底物利用范圍廣等優(yōu)點[2]。目前，國內(nèi)外的研究人員已經(jīng)對微生物油脂生產(chǎn)進行了大量研究。

氮[3-5]、磷[6]和硫[7]等限制均可促進油脂積累，特別是在氮源限制下胞內(nèi)油脂含量可超過細胞干重的70%[8]，并且油脂得率最大[9-11]。碳氮比是決定油脂含量和生物量的一個關(guān)鍵因素。一些研究表明：提高培養(yǎng)基中碳氮比，有利于提高胞內(nèi)油脂含量[12-13]；在氮源限制條件下，油脂產(chǎn)量和生物量均隨著碳氮比增大而提高，但是在初始碳氮比非常高的培養(yǎng)基中，培養(yǎng)后期仍會有一些底物不能夠被利用[14]。研究也表明：葡萄糖濃度不變，通過改變氮源濃度來調(diào)節(jié)碳氮比，隨著碳氮比增大，油脂得率逐漸增加達到最大值，然后隨著碳氮比進一步增大，油脂得率會有輕微下降[15]。

碳氮比對油脂合成至關(guān)重要，而且碳源和氮源便于監(jiān)測分析。研究碳氮比和油脂得率之間關(guān)系，對進一步認識和理解油脂生產(chǎn)過程，以及提高油脂生產(chǎn)過程經(jīng)濟性具有重要意義。Ykema等[16]在考慮中間代謝產(chǎn)物的情況下構(gòu)建油脂發(fā)酵過程經(jīng)濟性評價模型，Granger等[17]通過對實驗結(jié)果分析，利用數(shù)學(xué)方法構(gòu)建了預(yù)測脂肪含量和得率的數(shù)學(xué)模型。然而模型過于復(fù)雜，且在模型中沒有考慮氮源對細胞得率隨胞內(nèi)油脂含量的變化而變化。圓紅冬孢酵母在油脂合成的研究中被廣泛使用，它具有油脂含量高[8]、對木質(zhì)纖維素水解副產(chǎn)物抗逆性好[18]、底物利用寬泛[19-21]等優(yōu)點。并且已完成基因組學(xué)、轉(zhuǎn)錄組學(xué)和蛋白質(zhì)組學(xué)分析[22]。因此，本文以圓紅冬孢酵母為模式菌株，通過對碳、氫、氧和氮的化學(xué)計量學(xué)分析，并采用恒化培養(yǎng)的方法，研究不同稀釋率穩(wěn)態(tài)時消耗碳氮比和底物碳在非油菌體和油脂之間的分配關(guān)系，并對不同消耗碳比時的油脂得率進行預(yù)測，希望通過本研究能夠進一步加深對微生物油脂合成過程的理解，為油脂發(fā)酵過程的調(diào)控提供參考。

1 實驗材料和方法

1.1 供試菌株

圓紅冬孢酵母菌（Rhodosporidium toruloides AS2.1389）購自中國普通微生物菌種保藏管理中心(CGMCC)。

1.2 培養(yǎng)基

YEPD液體培養(yǎng)基（g·L-1）：葡萄糖20，酵母粉10，蛋白胨10，培養(yǎng)基初始pH用1 mol·L-1NaOH調(diào)至6.0。固體培養(yǎng)基在YEPD液體培養(yǎng)基基礎(chǔ)上加入20 g·L-1瓊脂粉。

合成培養(yǎng)基（g·L-1）：葡萄糖 18，硫酸銨 5，磷酸二氫鉀 1.0，磷酸氫二鈉1.0，七水硫酸鎂 1.5，10 ml的微量元素母液。

微量元素母液（g·L-1）：氯化鈣 4.0，硫酸亞鐵 0.55，硫酸鋅 0.10，硫酸錳 0.076 和 0.1 ml 18 mol·L-1硫酸。合成培養(yǎng)基和微量元素分別在121℃滅菌18 min，冷卻到室溫后混合在一起。

限氮培養(yǎng)基（g·L-1）：葡萄糖 36，硫酸銨 1，磷酸二氫鉀 1.0，磷酸氫二鈉1.0，七水硫酸鎂 1.5，10 ml的微量元素母液。

1.3 培養(yǎng)方法

種子液培養(yǎng)：將新鮮斜面圓紅冬孢酵母接種于50 ml YEPD液體培養(yǎng)基中，于30℃、200 r·min-1搖床上培養(yǎng)，培養(yǎng)24 h后，取20 ml轉(zhuǎn)接到180 ml YEPD液體培養(yǎng)基中，培養(yǎng)24 h。

批式培養(yǎng)：將培養(yǎng)24 h種子接種裝有1.8 L合成培養(yǎng)基的3 L發(fā)酵罐（上海保興3-BG）中，接種量為10%，接種后體積為2 L。培養(yǎng)溫度30℃，pH通過自動補加2 mol·L-1NaOH控制在5.6，通氣量0.8 vvm，發(fā)酵時調(diào)整攪拌轉(zhuǎn)數(shù)控制溶解氧在40%以上。

恒化培養(yǎng)：將培養(yǎng)到對數(shù)后期的批式培養(yǎng)通過補加限氮培養(yǎng)基開始恒化培養(yǎng)。工作體積1.85 L，攪拌500 r·min-1，培養(yǎng)溫度30℃，pH通過自動補加2 mol·L-1NaOH控制在5.6，通氣量0.8 vvm，發(fā)酵時調(diào)整攪拌轉(zhuǎn)數(shù)控制溶解氧在40%以上。調(diào)整稀釋率后連續(xù)流加5個工作體積，12 h內(nèi)溶氧的波動小于3%（發(fā)酵系統(tǒng)內(nèi)溶氧波動小于3%），則假設(shè)培養(yǎng)進入穩(wěn)態(tài)[23]。在每個穩(wěn)態(tài)下每間隔3 h在溢流口取樣，共獲得4個樣品，每個樣品40 ml。恒化培養(yǎng)稀釋率：0.02、0.04、0.06、0.08、0.10、0.12 和0.14 h-1。

1.4 分析方法

（1）菌體生物量測定：使用50 ml的離心管于冰水浴中收集一定量的發(fā)酵液，取樣后立即在6200g、4℃下離心5 min，將所得的含油菌體用去離子水清洗兩次，然后在105 oC下烘干至恒重，冷卻后稱重，差值法計算生物量。

（2）菌體油脂抽提：將烘干至恒重的菌體，按比例加入4 mol·L-1的鹽酸 （按照1 g菌體加入濃度為4 mol·L-1的鹽酸6 ml計算），在78℃水浴搖床中，200 r·min-1下消化1.5～2 h，然后加入與鹽酸等體積的三氯甲烷和甲醇，充分振蕩后，在6200g下離心5 min，抽取三氯甲烷相，再加入等體積三氯甲烷提取一次。將兩次所得的三氯甲烷相合并，用等體積0.1%的氯化鈉溶液洗滌后，抽取三氯甲烷相，用無水硫酸鈉過濾，最后旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)去除三氯甲烷，將所得的油脂于105℃過夜稱重，差值法計算油脂。油脂含量為油脂占生物量的質(zhì)量百分比[19]。

（3）非油生物量測定：采用差值測定，生物量減去油脂量。

（4）殘?zhí)菧y定：采用山東省科學(xué)院生產(chǎn)的SBA-50B生物傳感分析儀。

（5）殘氮測定：凱氏定氮法。

（6）元素分析：采用Elementar Vario EL 3元素分析儀，熱解段溫度為850℃，燃燒段溫度為1150℃，所有樣品均為直接分析，分析兩次，氧的含量為差值法獲得。

1.5 模型構(gòu)建

在產(chǎn)油微生物培養(yǎng)中，根據(jù)碳、氮、氫、氧元素的計量學(xué)平衡關(guān)系，且假設(shè)在產(chǎn)油微生物的培養(yǎng)過程中除油脂、菌體和二氧化碳外，其他產(chǎn)物可忽略不計。構(gòu)建如下等式

根據(jù)碳元素平衡有

假設(shè)消耗的底物全部用來生成菌體，而沒有用于油脂合成，則此時底物對菌體的得率為最大得率，表示為。假設(shè)消耗的底物全部用于合成油脂，而沒有菌體生成，則此時底物對油脂的得率為最大得率，表示為。則

或

假設(shè)產(chǎn)油酵母在產(chǎn)油和非產(chǎn)油條件下細胞組成不變，即h、i和j均為定值，且在氮源剛好完全被消耗時沒有油脂積累，定義此時所消耗的碳氮比（mol·mol-1）為臨界碳氮比 ，則式（4）可轉(zhuǎn)化為

因此，油脂對底物油脂得率系數(shù)為

2 實驗結(jié)果與討論

圖1 圓紅冬孢酵母連續(xù)培養(yǎng)中稀釋率和消耗碳氮比之間的關(guān)系Fig.1 Relationship of D and consumed C/N in R. toruloides AS 2.1389 under continuous cultivation

2.1 圓紅冬孢酵母連續(xù)培養(yǎng)中稀釋率和消耗碳氮比之間的關(guān)系

圓紅冬孢酵母在限制氮源的連續(xù)培養(yǎng)中，由于稀釋率不同，營養(yǎng)物質(zhì)在生物反應(yīng)器中停留時間也有所不同，這導(dǎo)致單位時間內(nèi)微生物消耗碳氮比也存在較大差別。結(jié)果如圖1(a)所示。在0.02～0.14 h-1之間，隨著稀釋率增大所消耗碳氮比呈現(xiàn)逐漸下降趨勢。在稀釋率增大初期，細胞所消耗碳氮比下降較快，稀釋率為0.02 h-1時細胞所消耗碳氮比為61.6 mol·mol-1，當稀釋率增大到0.04 h-1時，下降到38.0 mol·mol-1左右，稀釋率進一步增大到0.06 h-1和0.08 h-1時，所消耗碳氮比分別為30.8 mol·mol-1和24.9 mol·mol-1。而后隨著稀釋率進一步增大，消耗碳氮比下降趨勢明顯變緩，當稀釋率增大到0.14 h-1時，消耗碳氮比為13.2 mol·mol-1。而且稀釋率和消耗碳氮比的倒數(shù)呈線性關(guān)系（R2=0.98），結(jié)果如圖1(b)所示。這和Ykema等[16]在產(chǎn)油酵母Apiotrichum curvature中的結(jié)果一致。

隨著稀釋率增大，消耗的碳氮比和胞內(nèi)油脂逐漸減少。當稀釋率增大到剛好胞內(nèi)沒有油脂積累，此時消耗的碳氮比為臨界碳氮比。進一步增大稀釋率，細胞元素組成不變，則消耗的碳氮比不再變化。本文2.3節(jié)中表明臨界碳氮比為12.1 mol·mol-1。根據(jù)圖1(b)消耗碳氮比的倒數(shù)和稀釋率的線性關(guān)系可得：當消耗碳氮比為12.1 mol·mol-1時，稀釋率為0.155 h-1，即稀釋率大于0.155 h-1消耗碳氮比不變。

圓紅冬孢酵母連續(xù)培養(yǎng)過程中，在不同稀釋率下均達到穩(wěn)態(tài)，而且不同穩(wěn)態(tài)時氮源均為限制性因素，碳源相對充足。此時，所消耗碳氮比主要取決于消耗碳源數(shù)量。在低稀釋率下，營養(yǎng)物質(zhì)在反應(yīng)器中停留時間長，碳有充足的時間被微生物所利用。高稀釋率時停留時間短，微生物沒有充足的時間消耗碳源。稀釋率為0.02 h-1時，營養(yǎng)物質(zhì)在反應(yīng)器中的停留時間為50 h，而當稀釋率增大到0.10 h-1時，停留時間為10 h，稀釋率進一步增大到0.14 h-1時，停留時間僅為7.1 h。因此，稀釋率越小所消耗碳氮比越大，反之，則越小。

2.2 連續(xù)培養(yǎng)中菌體（不含油脂）碳得率和油脂碳得率的計算

在氮源限制的圓紅冬孢酵母連續(xù)培養(yǎng)中，獲得了稀釋率和消耗碳氮比之間的關(guān)系。消耗碳氮比不同直接導(dǎo)致胞內(nèi)油脂含量不同，進而改變了底物碳在菌體和油脂之間的分配關(guān)系。根據(jù)Dekkers等[24]在厭氧和耗氧條件下對釀酒酵母的研究，酵母平均分子量為25 g·(mol C)-1。因此，這里不含油脂的圓紅冬孢酵母分子量取25 g·(mol C)-1。酵母油脂的生產(chǎn)中脂肪酸組成主要包括肉豆蔻酸、棕櫚酸、棕櫚油酸、硬脂酸、油酸、亞油酸和亞麻酸[1]。這里油脂以三油酸甘油酯計算其分子量，其分子式為C57H104O6，最簡分子式的分子量約為15.6 g·(mol C)-1。

表1 圓紅冬孢酵母恒化培養(yǎng)中菌體中碳和油脂中碳Table 1 Values of CXf C-and CL C-of R. toruloides AS 2.1389 in continuous culture under nitrogen limitation

圖2 圓紅冬孢酵母連續(xù)培養(yǎng)中消耗碳氮比和YX、YL之間的關(guān)系Fig.2 Relationship between consumed C/N and YXand YLof R. toruloides AS 2.1389 in continuous cultivation

圓紅冬孢酵母在氮源限制連續(xù)培養(yǎng)中，非油生物量和油脂碳結(jié)果如表1所示。油脂和非油生物量中碳均隨著稀釋率增大而下降，但油脂中碳下降更快，這與油脂量和非油生物量隨稀釋率變化趨勢相同。稀釋率從0.02 h-1增加到0.20 h-1，碳從0.34 g·L-1下降到0.03 g·L-1，下降了91%。而非油生物量中碳僅下降了46%。通過表1可計算非油生物量和油脂對底物的碳得率，結(jié)果如圖2所示。通過分析非油生物量碳得率和油脂碳得率之間的關(guān)系可發(fā)現(xiàn)：隨著消耗碳氮比減小，非油生物量對底物碳得率逐漸增大，在消耗碳氮比為61.6 mol·mol-1時，YX為0.14 mol·mol-1，當消耗碳氮比減少到13.2 mol·mol-1時增大到0.35 mol·mol-1。與之相反的是：YL從0.37 mol·mol-1下降到了0.17 mol·mol-1。氮源作為微生物生長的必需元素，一旦缺乏，微生物將停止生長。由此可見，在消耗碳氮比較高的情況下，更多碳源流向油脂合成；而在消耗碳氮比較低的情況下，則更多碳源流向非油生物量合成。這也進一步表明，為了進一步提高油脂對底物的碳得率和油脂生產(chǎn)強度，應(yīng)該理性地設(shè)計培養(yǎng)基中碳氮比。

2.3 連續(xù)培養(yǎng)中油脂模型參數(shù)的確定

（1）YXmax和YLmax的確定

假設(shè)圓紅冬孢酵母在氮源限制培養(yǎng)過程中，產(chǎn)物為菌體、油脂和二氧化碳，而沒有其他副產(chǎn)物生成。根據(jù)式（3）和式（4）可知：因為YXmax和YLmax均為常數(shù)，所以YX和YL呈線性關(guān)系。依據(jù)YX和YL作圖，并進行線性擬合，結(jié)果如圖3所示。二者表現(xiàn)出良好的線性關(guān)系（R2=0.98）。因此

則有

因此，油脂對底物的最大碳得率為0.51 mol C·(mol C)-1，非油生物量對底物的最大碳得率為0.52 mol C·(mol C)-1。預(yù)測油脂對葡萄糖的最大油脂得率系數(shù)為0.27 g·g-1。非油生物量對底物的質(zhì)量最大得率為0.43 g·g-1。（2）臨界碳氮比(C/N)cri的確定

圖3 圓紅冬孢酵母　YX　max和　YL　max的確定Fig.3 Determination of YX　maxand YL　maxof R. toruloides AS 2.1389 in continuous cultivation

表2 模型參數(shù)值的評估以及和文獻值的比較Table 2 Estimation of model parameters and their comparison with literature values

2.4 基于消耗碳氮比預(yù)測油脂得率模型驗證

為了評價預(yù)測油脂得率的模型，以及對所得的參數(shù)進行驗證，根據(jù)李永紅[28]博士論文第五章分批油脂發(fā)酵數(shù)據(jù)進行了預(yù)測。在發(fā)酵過程中根據(jù)不同發(fā)酵時間所消耗碳源和氮源數(shù)量獲得了消耗碳氮比，對發(fā)酵18 h之后的油脂得率進行了預(yù)測，并和實驗值進行了比較，結(jié)果如表3所示。在消耗碳氮比為21.9 mol·mol-1時，預(yù)測值為0.14 g·g-1，而實驗值為0.12 g·g-1，相差0.02 g·g-1。而在其他消耗碳氮比下，實驗值和預(yù)測值吻合較好，在所有消耗碳氮比中預(yù)測值為實驗值的95.2%～116.7%。

表3 油脂得率系數(shù)的實驗值和預(yù)測值比較Table 3 Comparison of experimental and calculated values of Fa

3 結(jié) 論

符 號 說 明

CL- C——油脂中碳，mol

CXf- C ——非油生物量中碳，mol

C/N ——碳氮比，mol·mol-1

(C/N)cri——臨界碳氮比，mol·mol-1

D ——稀釋率，h-1

Fa ——油脂得率，g·g-1

ML——油脂摩爾質(zhì)量，g·(mol C)-1

MS——底物摩爾質(zhì)量，g·(mol C)-1

YL——油脂對底物碳得率，mol·mol-1

Yl——二氧化碳對底物碳得率，mol·mol-1

——細胞對底物最大碳得率，mol·mol-1

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Foundation item: supported by the National Key Technology Research and Development Program of the Ministry of Science and Technology of China (2014BAD02B02) and the State Key Laboratory of Motor Vehicle Biofuel Technology (2013001).

Prediction of lipid yield and substrate distribution based on consumed C/N ratio

SHEN Hongwei, YANG Xiaobing, GONG Zhiwei, JIN Guojie, ZHAO Zongbao
(Dalian Institute of Chemical Physics, Chinese Academy of Sciences, Dalian 116023, Liaoning, China)

Abstract:Microbial lipids, similar to vegetable oil in their composition, are potential alternative feedstock for biodiesel production and oleochemical industries as well. However, the high costs of microbial lipids production are the major bottleneck. The synthesis of microbial lipids is considered as a partially growth-associated process with inconstant production rates. For the prediction of lipid yield and substrate distribution, a chemostat process was established for lipid production by the oleaginous yeast Rhodosporidium toruloides AS 2.1389 under nitrogen limitation conditions, and a correlation on carbon distribution between lipid and lipid-free cell components was also developed. The maximal lipid yieldand cell mass yieldwere predicted to be 0.51 mol C·(mol C)-1and 0.52 mol C·(mol C)-1, respectively. Together with the element balance analysis, the critical C/N ratio for switching to lipid production was estimated to be 12.1 mol·mol-1. The prediction for lipid yields was 95.2%—116.7% of those measured experimentally, indicating that the model was reliable.

Key words:fermentation; bioprocess; model; parameter estimation; C/N; microbial lipids

Corresponding author:Prof. ZHAO Zongbao, Zhaozb@dicp.ac.cn

基金項目：國家科技支撐項目（2014BAD02B02）；車用生物燃料技術(shù)國家重點實驗室開放基金（2013001）。

中圖分類號：TQ 028.8

文獻標志碼：A

文章編號：0438—1157（2016）01—0324—07

DOI：10.11949/j.issn.0438-1157.20150454