時文波，于常聲，甘　為

山東電力中心醫(yī)院，濟南 250000

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芹菜素對煙草煙霧提取物誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細胞損傷的作用

時文波*，于常聲，甘為

山東電力中心醫(yī)院，濟南 250000

[摘要]目的探討芹菜素改善煙草煙霧提取物誘導(dǎo)的血管內(nèi)皮細胞損傷的機制。方法培養(yǎng)人臍靜脈內(nèi)皮細胞株，給予煙霧提取物(CSE)模擬吸煙環(huán)境和不同濃度芹菜素。實驗分為正常對照組、CSE組、芹菜素組，檢測細胞存活率、凋亡率、細胞內(nèi)活性氧ROS水平，以及細胞上清液中IL-6、TGF-β、INF-γ各因子的表達。結(jié)果芹菜素在24 h和48 h均能顯著緩解不同濃度CSE誘導(dǎo)的內(nèi)皮細胞存活率的降低，降低不同濃度CSE誘導(dǎo)的內(nèi)皮細胞的凋亡率，同時芹菜素可抑制CSE誘導(dǎo)的細胞內(nèi)ROS水平，以及上清液中炎性因子IL-6、TGF-β、INF-γ的升高，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05，P<0.01)。結(jié)論芹菜素以血管內(nèi)皮細胞凋亡和炎性反應(yīng)為標靶，抑制吸煙引起的血管內(nèi)皮細胞損傷，為臨床治療提供理論依據(jù)。

[關(guān)鍵詞]芹菜素；煙草煙霧提取物；血管內(nèi)皮細胞

0引言

國內(nèi)外研究發(fā)現(xiàn)，血管內(nèi)皮細胞損傷可導(dǎo)致慢性阻塞性肺疾病和動脈粥樣硬化等心血管病變發(fā)生，其主要的作用機制為細胞凋亡和線粒體功能異常等。吸煙是公認的動脈粥樣硬化發(fā)展的獨立危險因素，后者嚴重威脅現(xiàn)代人類的生命健康，可導(dǎo)致內(nèi)皮炎癥反應(yīng)增加和功能紊亂等誘發(fā)急性心血管事件的發(fā)生[1]。血管內(nèi)皮細胞損傷是慢性阻塞性肺疾病的重要發(fā)病機制之一，可以通過直接作用或通過炎癥介質(zhì)的釋放等多種方式損傷血管內(nèi)皮細胞。芹菜素(Apigenin)屬于黃酮類植物抗毒素，以植物黃色素的形式存在于多種中藥中，如紫蘇、馬鞭草、玄參等，具有低毒性和無誘變性的藥理特點。其具有抑制血管炎癥反應(yīng)、抗氧化應(yīng)激、鎮(zhèn)靜安神、降壓、改善血管內(nèi)皮功能等作用[2]，但對內(nèi)皮細胞損傷的保護機制尚未明確。本文從體外研究芹菜素對吸煙誘導(dǎo)的血管內(nèi)皮細胞損傷的干預(yù)作用，現(xiàn)報道如下。

1資料與方法

1.1試驗藥物芹菜素(Apigenin)，購自Sigma公司，用DMSO溶解后，用培養(yǎng)基配制成以下濃度：10、30、50、70 μmol/L。煙草煙霧提取物(CSE)，購自Sigma公司，分別用相應(yīng)培養(yǎng)基配制成以下濃度：1%、5%、10%。

1.2動物或細胞人臍靜脈內(nèi)皮細胞株HUVEC，購自中國醫(yī)學科學院中國協(xié)和醫(yī)科大學基礎(chǔ)所細胞中心。HUVEC細胞株采用DMEM培養(yǎng)液和10%胎牛血清混合的完全培養(yǎng)基，每5~6 d，細胞達到80%~90%的融合率，進行傳代，37 ℃、5% CO2培養(yǎng)孵箱培養(yǎng)，本實驗使用第3代細胞。取對數(shù)生長期的細胞進行實驗。

1.3試劑PBS緩沖溶液、胎牛血清、DMEM培養(yǎng)基、胰蛋白酶和雙抗(青霉素100 μg/mL，鏈霉素100 μg/mL)均購自Gibco公司；活性氧ROS檢測試劑盒購自碧云天生物科技公司；PE-Annexin V/7-AAD試劑盒購自BD公司。

1.4儀器流式細胞儀(美國BD公司)，酶標儀(美國Thermo公司)，熒光顯微鏡(尼康公司)。

1.5方法

1.5.1MTT比色法測定不同時間各組細胞的存活率細胞培養(yǎng)后，胰酶消化細胞并計數(shù)，細胞鋪板在1×104/孔(96孔)培養(yǎng)基，100 μL/孔。細胞貼壁4 h后，用含5% FBS的DMEM培養(yǎng)基配制各加藥組，將細胞隨機分組，每組設(shè)置5復(fù)孔。繼續(xù)培養(yǎng)24、48 h后，MTT法檢測細胞活性。直接向每孔加入20 μL已配制好的MTT溶液(5 mg/mL)，37 ℃孵育4 h，吸凈上清，然后加入150 μL DMSO。待結(jié)晶充分溶解后，利用酶標儀在波長490 nm處測定OD值。以MTT比色法測定各組細胞的存活率。

1.5.2細胞凋亡的影響收集細胞培養(yǎng)舊液以及PBS洗滌3次后的洗滌液，用不含EDTA胰酶細胞的消化液消化1~2 min，加入完全培養(yǎng)液，吹打，細胞消化后，轉(zhuǎn)移到離心管內(nèi)，350 r/min離心5 min，去上清，PBS重懸，350 r/min離心5 min，重復(fù)2次，加入100 μL結(jié)合緩沖液重懸細胞。加入5 μL PE-Annexin V和5 μL 7-AAD染色液輕輕混勻，室溫避光孵育15 min，再加400 μL結(jié)合緩沖液，30 min內(nèi)上機檢測，每份樣品檢測104個細胞。在雙變量流式細胞儀的散點圖上，顯示右下象限為凋亡細胞顯現(xiàn)(PE-Annexin V+/7-AAD-)，左下象限為活細胞(PE-Annexin V-/7-AAD-)；右上象限是晚期凋亡細胞(PE-Annexin V+/7-AAD+)。

1.5.3細胞內(nèi)活性氧ROS水平檢測培養(yǎng)12 h后，把細胞培養(yǎng)液吸至離心管內(nèi)，PBS洗滌貼壁細胞3次，收集洗滌液至離心管內(nèi)，用胰酶細胞消化液消化1~2 min，加入完全培養(yǎng)液，吹打，細胞消化下來后，轉(zhuǎn)移到離心管內(nèi)，350 r/min離心5 min，去上清，加0.5 mL培養(yǎng)基重懸細胞，加入稀釋好的DCFH-DA(10 μmol/L)中，置37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱內(nèi)孵育30 min，流式細胞儀檢測熒光強度。

1.5.4細胞上清液中炎癥因子檢測釆用ELISA酶聯(lián)免疫吸附法，按照白細胞介素-6(IL-6)、TGF-β、INF-γ各因子ELISA Kit說明書操作，5 min內(nèi)用酶標儀在450 nm波長處測定各孔的OD值。

2結(jié)果

2.1細胞存活率檢測結(jié)果MTT法檢測結(jié)果顯示，24 h與48 h時，不同濃度CSE對HUVEC細胞活力的影響差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。見表1、表2。50 μmol/L芹菜素可以顯著提高不同濃度CSE作用HUVEC細胞后的存活率(P<0.05，P<0.01)；同時在5% CSE作用下，不同濃度芹菜素(10、30、50、70 μmol/L)可以顯著提高細胞存活率(P<0.01)。見表3。50 μmol/L芹菜素作用后，細胞存活率趨于平臺期，故選用50 μmol/L進行后續(xù)的實驗。

表1　芹菜素對不同濃度CSE作用后細胞存活率的影響(24 h)

注：與CSE組比較，*P<0.05，**P<0.01

表2　芹菜素對不同濃度CSE作用后細胞存活率的影響(48 h)

注：與CSE組比較，**P<0.01

2.2凋亡率檢測結(jié)果24、48 h時1%、5%、10% CSE組的凋亡率隨濃度升高而明顯升高(P<0.01)，而芹菜素組的凋亡率均顯著低于對應(yīng)濃度的CSE組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。芹菜素在24 h和48 h均能改善CSE誘導(dǎo)的內(nèi)皮細胞的凋亡。見表4。

表3　不同濃度芹菜素對5% CSE作用后細胞存活率影響

注：與對照組比較，*P<0.01

注：與相應(yīng)濃度CSE組比較，**P<0.01；與空白對照組比較，##P<0.01

2.3各組細胞上清液中炎性因子檢測結(jié)果隨著CSE作用濃度的升高，1%、5%和10% CSE組的IL-6、TGF-β、INF-γ含量明顯升高(P<0.01)，而在不同CSE濃度下芹菜素各組的IL-6、TGF-β、INF-γ含量對應(yīng)濃度CSE組顯著降低，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。芹菜素可抑制CSA誘導(dǎo)的內(nèi)皮細胞上清液中炎性因子IL-6、TGF-β、INF-γ的升高。見表5。

表5　細胞上清液中炎性因子檢測結(jié)果(pg/mL)

注：與相應(yīng)濃度CSE組比較，**P<0.01；與空白對照組比較，##P<0.01

2.4活性氧ROS檢測結(jié)果24 h和48 h時，1%、5%和10% CSE組的細胞ROS水平明顯升高(P<0.05，P<0.01)，而在不同CSE濃度下，芹菜素各組的細胞ROS水平較對應(yīng)濃度的CSE組顯著降低，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。芹菜素在24 h和48 h均能降低CSE誘導(dǎo)的內(nèi)皮細胞ROS水平的升高。見表6。

3討論

吸煙是公認的動脈粥樣硬化發(fā)展的獨立危險因素以及慢性阻塞性肺疾病(COPD)最重要的危險因素。吸煙可以引起癌癥、慢性肺臟疾病、血管疾病以及口腔疾病，影響著人類的健康。研究發(fā)現(xiàn)，吸煙使人類的平均壽命減少12~15歲。動脈粥樣硬化嚴重威脅現(xiàn)代人類生命健康，可導(dǎo)致內(nèi)皮功能紊亂，炎癥反應(yīng)增加，血液脂肪酸、脂蛋白等代謝異常，血管內(nèi)血栓形成，易誘發(fā)急性心血管事件的發(fā)生[1,3]。血管內(nèi)皮細胞損傷是心血管病變包括動脈粥樣硬化等的主要發(fā)病機制和風險因素，動脈粥樣硬化的發(fā)生與病理演變離不開血管內(nèi)皮細胞的生長、增殖、凋亡、衰老及死亡等細胞過程[4]。而細胞凋亡與線粒體功能異常密切相關(guān)[5]。內(nèi)皮細胞損傷的病理改變可導(dǎo)致血管整體老化，促進了心血管疾病的發(fā)生[6]。吸煙者COPD發(fā)病率明顯高于不吸煙者，吸煙可以通過直接作用或通過炎癥因子間接作用損傷肺血管內(nèi)皮細胞，導(dǎo)致肺血管的慢性炎癥以及血管內(nèi)皮細胞凋亡水平升高。煙草煙霧是煙葉燃燒過程中產(chǎn)生的上千種化學物質(zhì)的混合物，尼古丁、一氧化碳、活性氧、丙烯醛是煙草煙霧中最重要的幾種毒性物質(zhì)。煙草煙霧中的毒性物質(zhì)隨著細胞中所含的活性氧的升高，激活上皮細胞下游信號途徑，導(dǎo)致IL-6、TNF-α等炎癥因子的激活，導(dǎo)致血管內(nèi)皮細胞的炎癥反應(yīng)[7]。因此，尋找新的有效的治療措施，為心肺腦血管疾病的防治提供新的治療思路，具有重要的意義。

表6　活性氧ROS檢測結(jié)果

注：與相應(yīng)濃度CSE組比較，**P<0.01；與空白對照組比較，##P<0.01

芹菜素主要存在于瑞香科、馬鞭草科、卷柏科植物中，如芫花、卷柏中含量較大[8]。屬于黃酮類，具有低毒性和無誘變性等特點，屬于治療HIV和其他病毒感染的抗病毒藥物，同時是抗腫瘤藥物和MAP激酶的抑制劑，具有鎮(zhèn)靜安神、降壓、抗炎、抗氧化等作用。近年來，芹菜素對心血管的保護效應(yīng)備受關(guān)注[9]。芹菜素具有調(diào)節(jié)血脂、抗氧化應(yīng)激、抑制血管炎癥反應(yīng)、舒張血管等作用[10-11]，但從抗內(nèi)皮細胞衰老的角度論述其作用機制的研究較少。

本研究結(jié)果表明，芹菜素在24 h和48 h均能抑制不同濃度CSE誘導(dǎo)的內(nèi)皮細胞存活率降低，并降低不同濃度CSE誘導(dǎo)的內(nèi)皮細胞的凋亡率，說明芹菜素可干預(yù)CSE導(dǎo)致內(nèi)皮細胞損傷。同時芹菜素可降低CSE誘導(dǎo)的細胞內(nèi)ROS水平及上清液中炎性因子IL-6、TGF-β、INF-γ的升高。表明芹菜素可改善吸煙誘導(dǎo)的血管內(nèi)皮細胞活性氧的升高，抑制IL-6、TNF-α等炎癥因子的激活，減緩血管內(nèi)皮細胞的炎癥反應(yīng)及內(nèi)皮細胞損傷，從而降低引發(fā)各種心血管和肺部病變的風險。

綜上所述，芹菜素可以抑制吸煙引起的血管內(nèi)皮細胞的損傷，有效預(yù)防動脈粥樣硬化和COPD的發(fā)生，具有一定的應(yīng)用前景和臨床價值。

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Effect of apigenin on the vascular endothelial cell injury induced by cigarette smoke extractSHI Wen-bo*,YU Chang-sheng,GAN Wei(Shandong Electric Power Central Hospital,Jinan 250000,China)

[Abstract]ObjectiveTo investigate the mechanism of apigenin in endothelial cell damage induced by cigarette smoke extract (CSE).MethodsHuman umbilical vein endothelial cells were cultured,with CSE simulating the smoke environment and were given varying concentrations of apigenin.The cells were divided into normal control group,CSE group,and apigenin group. Cell viability,apoptosis rate,intracellular ROS level,and IL-6,TGF-β,INF-γ of cell supernatant were detected.ResultsApigenin could significantly improve the survival rates of endothelial cells with different concentrations of CSE at 24 h and 48 h,and reduce the rate of apoptosis induced by different concentrations of CSE.Apigenin could reduce the elevated levels of ROS induced by CSE and IL-6,TGF-β,INF-γ,there were significant difference(P<0.05,P<0.01).ConclusionApigenin can inhibit endothelial cell damage caused by smoking through apoptosis and inflammatory reactions,and provide a theoretical basis for clinic.

Key words：Apigenin;Cigarette smoke extract;Vascular endothelial cells

DOI:10.14053/j.cnki.ppcr.201601006

*通信作者

收稿日期：2015-06-23