郭海燕，張 昊，李擁軍，程國虎

(揚州大學動物科學與技術(shù)學院，江蘇省動物遺傳繁育與分子設(shè)計重點實驗室，江蘇揚州 225009)

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性別控制技術(shù)及其在家畜生產(chǎn)中的應(yīng)用

郭海燕，張 昊，李擁軍*，程國虎

(揚州大學動物科學與技術(shù)學院，江蘇省動物遺傳繁育與分子設(shè)計重點實驗室，江蘇揚州 225009)

繁殖力是畜牧生產(chǎn)中重要的經(jīng)濟指標，繁殖新技術(shù)對畜禽生產(chǎn)與繁殖起著巨大的推動作用。性別控制技術(shù)是繁殖新技術(shù)發(fā)展史上的一個重要里程碑。對性別控制技術(shù)及其在家畜生產(chǎn)中的應(yīng)用進行了綜述。

繁殖力；性別控制；家畜生產(chǎn)

繁殖力是評價家畜經(jīng)濟效益的重要指標，對種畜而言繁殖力就是生產(chǎn)力。因此，提高家畜的繁殖性能對于提高我國畜牧業(yè)的經(jīng)濟效益具有重要意義。隨著科學技術(shù)的發(fā)展，繁殖新技術(shù)在畜牧生產(chǎn)中的應(yīng)用越來越廣泛，并取得了一定的成果。動物繁殖新技術(shù)包括性別控制、動物克隆、轉(zhuǎn)基因技術(shù)、胚胎嵌合以及體外受精等。性別控制技術(shù)是繁殖新技術(shù)發(fā)展史上的一個重要里程碑。筆者對性別控制技術(shù)及其在家畜生產(chǎn)中的應(yīng)用進行了綜述。

1　性別控制技術(shù)

性別控制(Sex control)是指通過人為干預(yù)并按照人們的愿望使雌性動物繁殖出所需性別后代的一種繁殖新技術(shù)。性別控制技術(shù)在畜牧生產(chǎn)實踐中有著重要的意義。性別控制技術(shù)可使受性別限制的生產(chǎn)性狀(如泌乳性狀)和受性別影響的生產(chǎn)性狀(如生長速度、肉質(zhì)等)獲得更大的經(jīng)濟效益；同時，還能增強良種選種中的強度和提高育種效率，以獲得最大的遺傳進展。此外，通過控制性別還能克服牛胚胎移植中出現(xiàn)的異性孿生不育現(xiàn)象，排除伴性有害基因的危害等[1]。

1.1性別控制技術(shù)的發(fā)展基礎(chǔ)公元前400年，古希臘哲學家德謨克利特就提出通過抑制一側(cè)睪丸從而控制后代性別的設(shè)想，雖然這設(shè)想在現(xiàn)在看來十分荒謬，但也反映出當時人們對性別控制技術(shù)的渴望。1923年，Painter首次證實了人類X和Y染色體的存在，并指出卵子與Y精子結(jié)合時發(fā)育為雄性，與X精子結(jié)合時發(fā)育為雌性。1959年，Welshons和Jacobs等提出Y染色體決定雄性的理論。1990年，Sinclair等[2]從人體中克隆到Y(jié)染色體上1個名稱為SRY的基因。此后，SRY基因在其他動物中相繼被克隆出來，并證實其長度約為35 kb，編碼79個氨基酸(HMG盒)，這是SRY基因主要的功能區(qū)。研究發(fā)現(xiàn)，人與哺乳動物的HMG區(qū)域的同源性高達70%，而在其他區(qū)域如此高的同源性[3-8]。Y染色體上SRY基因的發(fā)現(xiàn)是哺乳動物性別決定理論的重大突破，也為性別控制技術(shù)奠定了理論基礎(chǔ)。

1.2性別控制的方法目前，性別控制的方法主要分為受精前的控制(X精子與Y精子的分離)；與受精后的控制(早期胚胎的性別鑒定)。受精前的控制是指通過在體外對精子進行干預(yù)，使在受精之前便決定后代的性別；受精后的控制指通過對胚胎進行性別鑒定，從而獲得所需性別的后代。在家畜生產(chǎn)實踐中，較為理想的方法是先分離X、Y精子，然后再根據(jù)需求進行人工授精，從而得到所需性別的后代。

1.2.1X與Y精子分離的方法。從20世紀50年代開始，人們就開始了對X與Y精子的大小、帶電荷數(shù)、密度及活力等方面的研究。研究表明，X、Y精子的差異主要表現(xiàn)在X精子的DNA含量大于Y精子以及Y染色體上的性別決定序列SRY[2，9]。此外，二者在其他方面無明顯差異。X與Y精子DNA含量的差異就是X、Y精子分離的理論基礎(chǔ)[10]。

X與Y精子的分離方法有很多種，包括物理分離法，沉積分離法、梯度離心法、電泳法、白蛋白沉淀法、免疫學分離法以及流式細胞儀分離法等。其中，流式細胞儀分離法具有效率高、準確率高等優(yōu)點，是目前畜牧生產(chǎn)中較為高效、可靠且使用范圍廣泛的一種方法[11-12]。

1.2.1.1流式細胞儀分離法。目前，在生產(chǎn)中使用最多、技術(shù)最為成熟的就是流式細胞儀分離法。此方法的理論依據(jù)就是X、Y精子頭部DNA含量的差異。在家畜中X精子的DNA含量比Y精子高3%～4%[10]。根據(jù)這一差異，用DNA特異性染料(常用Hochest33342)對精子進行染色，染料著色量與DNA含量成正比[13]。經(jīng)過染色的精子會連同少量的稀釋液逐個通過激光束，然后精子上的熒光染料就會被激發(fā)形成光學信號，探測器根據(jù)發(fā)光強度的強弱將信息傳遞給計算機，計算機的信息處理系統(tǒng)會使發(fā)光強度高的帶正電，弱的帶負電，然后帶電液滴通過高壓電場被分開，進入2個不同的收集管，正電荷收集管為X精子，負電荷收集管為Y精子[1，12]。經(jīng)過多年的改進，流式細胞儀分離的準確率可達90%以上，此方法已經(jīng)用于商業(yè)化，特別是在奶牛的生產(chǎn)中較為常用。

1.2.1.2免疫學分離法。免疫學分離法是根據(jù)利用H-Y抗體檢測Y精子質(zhì)膜上存在的H-Y抗原，以此來分離X精子和Y精子[14]。Zavos[15]和Jones等[16]利用此方法都成功分離出Y精子。但是，Hendriksen P J M[17]研究表明X和Y精子會共享抗原，它們都能夠結(jié)合抗H-Y抗原抗體。此外，免疫學分離法處理精子的時間較長，會降低精子活力，從而導致受胎率的降低，因此此方法在生產(chǎn)實踐中難以推廣[18]。

1.2.1.3其他常見的分離方法。

(1)密度梯度離心技術(shù)在20世紀70年代就已經(jīng)出現(xiàn)。此方法的原理是X、Y精子的密度和比重不同，但由于其差異并不大，X、Y精子的比重會隨精子成熟情況的不同而變化，因此該方法的分離效果并不是十分理想，在生產(chǎn)實踐中也并不常用[19-20]。

(2)電泳法的原理是X、Y精子表面攜帶的電荷不同，因此在電泳時會分別向兩極移動并形成2條泳帶，從而使精子分離[21]。但是，此方法的分離結(jié)果的準確性和重復(fù)性都不理想，且精子在電泳液中不易存活，因此此方法在生產(chǎn)中也不常用[22]。

(3)白蛋白柱分離法的技術(shù)基礎(chǔ)是Y精子在白蛋白溶液中的泳動速度比X精子快。很多科研人員用此方法分離人或動物的X、Y精子，但結(jié)果卻差別很大[23-24]。Ericsson等[25]首次用此方法分離到85%的人類精子。Evans等[26]認為白蛋白柱法不能有效分離人類的X、Y精子。由于此方法的效果存在較大的爭議，所以此方法也不太常用。

1.2.2早期胚胎的性別鑒定。通過對早期胚胎進行性別鑒定，移植已知性別的胚胎，也可以控制后代的性別比例。對胚胎進行性別鑒定有許多方法，如核型分析法、SRY-PCR法、免疫學法和X-相關(guān)酶法等。目前，在生產(chǎn)實踐中最有效、最常用的早期胚胎的性別鑒定方法就是SRY-PCR法。

1.2.2.1核型分析法。不同物種的染色體都有各自特定的形態(tài)結(jié)構(gòu)，包括染色體的長度、著絲點位置、臂比、隨體大小等特征，且這些形態(tài)特征是相對穩(wěn)定的。胚胎的性別鑒定就是分析胚胎細胞的染色體組，具有XX染色體的是雌性胚胎，具有XY染色體的是雄性胚胎。核型分析一般采用切割胚(晚期桑葚胚、囊胚或擴張囊胚)，檢測時一半用于鑒定性別，另一半用于移植或冷凍[27]。如果想要擴張囊胚，切割時可切成含內(nèi)細胞團的半胚和含滋養(yǎng)層細胞的半胚，前者用于冷凍和移植，后者用于核型分析[27]。

核型分析法的主要步驟如下：先取部分胚胎細胞，用秋水仙素處理使細胞處于有絲分裂的中期，然后制成染色體標本，通過顯微攝影分析染色體組成并確定胚胎性別[1]。此方法的準確率可達100%，但此方法對胚胎損傷較大，且操作有一定難度，因此在生產(chǎn)實踐中難以推廣。

1.2.2.2X-相關(guān)酶法。X-相關(guān)酶法是通過測定早期胚胎中與X染色體連鎖相關(guān)酶的活性來鑒定胚胎性別的一種方法。此方法通過觀察相關(guān)酶與底物著色反應(yīng)的顏色來鑒別胚胎性別。此方法的準確性較低，且不能檢測桑椹胚以后的胚胎性別，因此在生產(chǎn)中并不常用[28]。

1.2.2.3免疫學法。胚胎的免疫學法與X、Y精子分離的免疫學法很相似，都是根據(jù)雄性的H-Y抗原去鑒別性別，就是利用H-Y單克隆抗體或血清檢測胚胎是否存在H-Y抗原，從而達到對胚胎進行性別鑒定的一種方法。利用此方法鑒定小鼠和奶牛的胚胎性別，其雄性與雌性鑒別的準確率均能達到80%以上[29-30]。由于此方法在操作中會破壞胚胎，且H-Y抗原是弱抗原，觀察人員的主觀因素對結(jié)果的影響很大，從而會導致結(jié)果存在較大誤差，因此在生產(chǎn)實踐中也難以推廣。

1.2.2.4SRY-PCR法。SRY-PCR法就是指利用雄性特異性DNA探針和PCR擴增技術(shù)對哺乳動物早期胚胎進行性別鑒定的一種方法。首先提取胚胎的DNA，以此為模板，用SRY基因的一段堿基作為引物進行PCR擴增，再用SRY特異性探針對擴增引物進行檢測，若檢測結(jié)果為陽性即為雄性胚胎；若檢測結(jié)果為陰性，則為雌性胚胎。此外，也可對PCR產(chǎn)物進行電泳檢測，出現(xiàn)特異性條帶的為雄性，不出現(xiàn)特異性條帶的為雌性[28]。此方法對胚胎損傷小，準確率高，可達95%以上[31]。此方法在生產(chǎn)中較為常用，運用此方法時應(yīng)注意避免污染，防止出現(xiàn)假陽性[32]。

2　性別控制在家畜生產(chǎn)中的應(yīng)用

性別控制技術(shù)對于家畜生產(chǎn)具有重大意義，在生產(chǎn)中能夠增加所需性別的動物，提高家畜生產(chǎn)的經(jīng)濟效益，特別是對奶牛產(chǎn)業(yè)起著重要的推動作用。此技術(shù)還可以通過控制后代的性別，從而避免異性胚胎移植導致的孿生不育現(xiàn)象；同時對預(yù)防伴性遺傳疾病也起著舉足輕重的作用[28]。

2.1流式細胞儀在家畜生產(chǎn)中的應(yīng)用由于對胚胎進行性別檢測時，會對胚胎造成一定程度的損害，從而會導致妊娠率的降低；鑒定時對樣本有一定的要求，對劣質(zhì)胚胎的鑒定效果較差，因此在家畜生產(chǎn)上使用最多的是流式細胞儀分離法[12]。

在奶牛行業(yè)中，流式細胞儀得到了廣泛應(yīng)用。截至2012年，全國擁有36臺流式細胞儀，分布在洛陽白馬寺種公牛站、河南鼎元種牛有限公司、北京奶牛中心種公牛站、賽克星股份有限公司以及其他一些生物公司和種公牛站[33]。

2006年寶雞市在陜西省率先使用了性控凍精技術(shù)，累計已配種上萬頭，母犢率達92%以上[34]?！笆晃濉逼陂g，在全國2 700多個奶牛場累計使用奶牛性控凍精150多萬支，生產(chǎn)奶牛母犢50余萬頭，總產(chǎn)值達25億元[35]。陜西省千陽縣2008年開始使用此技術(shù)，截至2015年底累計產(chǎn)犢母犢單項增加經(jīng)濟收入836.42萬元[36]。

2.2SRY-PCR技術(shù)在家畜生產(chǎn)中的應(yīng)用對于性染色體差異較小的物種而言，使用X、Y精子分離法較為困難，且后代有一定的畸形率[37]。因此，SRY-PCR在家畜生產(chǎn)中也是一種常見的方法。PCR具有快速、簡便、特異性強等特點，此方法在養(yǎng)牛業(yè)中已經(jīng)廣泛應(yīng)用[38]。在試驗中，PCR分為常規(guī)PCR、多重PCR和巢式PCR。早期試驗大多采用常規(guī)PCR法，后來為避免擴增失敗而導致的判斷結(jié)果的錯誤，一般采用多重PCR法，在擴增性別特異引物的同時擴增常染色體序列作為陽性對照[39]。巢式PCR法就是同時根據(jù)1個性別特異基因設(shè)計1對外引物，獲得被測基因較長的擴增產(chǎn)物，再根據(jù)擴增產(chǎn)物序列設(shè)計第2對引物(內(nèi)引物)對產(chǎn)物進行第2次擴增[37]。研究表明，與其他PCR法相比，巢式PCR法胚胎性別鑒定的靈敏度得到大大提升[40-41]。在實際生產(chǎn)中，將多重PCR與巢式PCR結(jié)合起來可以提高結(jié)果的可靠性[37]。在奶牛產(chǎn)業(yè)中，為了多生母犢，可以對SRY基因進行定點突變，使之不再表達，從而控制牛犢性別[42]。

3　小結(jié)

性別控制的各種技術(shù)都有各自的優(yōu)點與缺點。隨著科學技術(shù)的進步，性別控制技術(shù)的準確度與靈敏度一定會得到更大提升。相信在不久的將來，性別控制技術(shù)就會走上商業(yè)化與生產(chǎn)化的規(guī)模，同時也一定會為家畜產(chǎn)業(yè)帶來更大的經(jīng)濟效益。

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Sex Control Technology and Its Application in Livestock Production

GUO Hai-yan,ZHANG Hao,LI Yong-jun*et al

(College of Animal Science and Technology,Yangzhou University,Key Laboratory for Animal Genetic,Breeding,Reproduction and Molecular Design of Jiangsu Province,Yangzhou,Jiangsu 225009)

Fertility is an important economic indicator in animal production.Breeding new technology plays a huge role in promoting the production and breeding of livestock.And sex control technology is an important milestone in the history of the development of new technology of reproduction.Based on these,we reviewed the sex control technology and its application in livestock production.

Fertility;Sex control;Livestock production

郭海燕(1992- )，女，河南洛陽人，碩士研究生，研究方向：動物遺傳育種與繁殖。*通訊作者，教授，博士，碩士生導師，從事動物繁殖學和羊生產(chǎn)學的教學和科研工作。

2016-07-13

S 814

A

0517-6611(2016)25-116-03