謝晴，薄軍，鄭榕輝，洪幅坤，張玉生

國家海洋局第三海洋研究所，廈門 361005

鎘脅迫下黑點(diǎn)青鳉(Oryziasmelastigma)肝臟金屬硫蛋白mRNA性別差異性表達(dá)研究

謝晴，薄軍，鄭榕輝，洪幅坤，張玉生*

國家海洋局第三海洋研究所，廈門 361005

魚類金屬硫蛋白(metallothionein, MT)mRNA作為生物標(biāo)志物已越來越多地應(yīng)用到水環(huán)境重金屬污染的監(jiān)測中，然而重金屬脅迫下魚類MT mRNA表達(dá)是否具有性別差異性特征目前尚無相關(guān)報(bào)道。以海洋模式魚類—黑點(diǎn)青鳉(Oryzias melastigma)為實(shí)驗(yàn)魚類，首次克隆了其MT基因全長cDNA序列，分析了黑點(diǎn)青鳉MT基因和氨基酸序列特征，然后進(jìn)一步研究了水體中鎘暴露后雌、雄性黑點(diǎn)青鳉肝臟中MT mRNA表達(dá)的差異性。結(jié)果顯示，黑點(diǎn)青鳉MT基因cDNA全長為385 bp，編碼60個(gè)氨基酸，預(yù)測編碼的多肽分子量為5 990 Da，含有脊椎動物MT基因特征性序列結(jié)構(gòu)cys-x-cys、cys-x-x-cys和cys-x-cys-cys。鎘脅迫下雌、雄性黑點(diǎn)青鳉肝臟MT mRNA表達(dá)結(jié)果顯示，在0.8，4.0和8.0 μg·L-1環(huán)境濃度的鎘暴露1～7 d條件下，與對照組相比，雄性黑點(diǎn)青鳉在所有的不同暴露濃度和不同暴露時(shí)間的實(shí)驗(yàn)組中肝臟MT mRNA幾乎均被顯著性誘導(dǎo)表達(dá)；而雌性黑點(diǎn)青鳉只在較高暴露濃度和較長暴露時(shí)間的實(shí)驗(yàn)組中才被顯著性誘導(dǎo)表達(dá)，并且MT mRNA的表達(dá)水平比雄性低得多。上述研究結(jié)果表明，在相同的鎘脅迫條件下，雄性黑點(diǎn)青鳉肝臟MT mRNA的表達(dá)比雌性更敏感；以黑點(diǎn)青鳉MT mRNA作為生物標(biāo)志物監(jiān)測海洋環(huán)境重金屬污染生物效應(yīng)狀況時(shí)，應(yīng)選擇更敏感的雄性黑點(diǎn)青鳉作為監(jiān)測魚類。利用生物標(biāo)志物監(jiān)測水環(huán)境污染物生物效應(yīng)時(shí)，監(jiān)測動物的性別差異是一個(gè)應(yīng)當(dāng)考慮的重要因素。

鎘；黑點(diǎn)青鳉；金屬硫蛋白mRNA；性別差異

近年來，我國海洋生態(tài)環(huán)境狀況總體較好，但近岸局部海域海水環(huán)境污染依然嚴(yán)重，其中重金屬污染是我國海洋污染的主要類型之一。我國每年產(chǎn)生400億t左右的工業(yè)廢水，其中重金屬廢水約占60%[1]?！?014年中國海洋環(huán)境狀況公報(bào)》顯示[2]，我國河流排海污染物總量依然居高不下，陸源入海排污口達(dá)標(biāo)率僅為52%，重點(diǎn)監(jiān)測的72條河流入海的重金屬污染物總量2.1萬t，其中鎘為120 t。重金屬對生物的危害主要通過3種途徑產(chǎn)生：直接生物毒性效應(yīng)、在微生物作用下轉(zhuǎn)化為毒性更強(qiáng)的重金屬化合物以及生物富集作用。重金屬鎘的生物學(xué)毒性主要包括早期發(fā)育階段毒性、遺傳毒性和蛋白毒性[3-4]等。20世紀(jì)30至70年代在日本發(fā)生的“骨痛病”就是鎘污染物通過食物鏈傳遞危害人體健康的典型例證。因此鎘的生物效應(yīng)及其危害至今仍然受到國際社會廣泛關(guān)注，也是目前海洋生態(tài)毒理學(xué)領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)之一。

金屬硫蛋白(metallothionein, MT)是一類普遍存在于生物體內(nèi)、富含半胱氨酸、具有結(jié)合金屬能力和高誘導(dǎo)特性的低分子量蛋白質(zhì)。Margoshes和Vallee[5]在1957年從馬的腎臟外皮細(xì)胞中首次分離獲得了MT，并發(fā)現(xiàn)該蛋白可能與鎘的生物代謝過程有關(guān)。早在20世紀(jì)70年代末，Bayne[6]就提出水生生物MT可作為一種生物標(biāo)志物指示水環(huán)境重金屬污染狀況；隨后MT逐漸成為監(jiān)測環(huán)境重金屬污染最重要的生物標(biāo)志物之一[7-8]。Bebianno和Langston[9]研究發(fā)現(xiàn)，雙殼類貽貝的鰓和消化腺等器官中的鎘濃度與MT誘導(dǎo)水平相關(guān)，貽貝MT作為響應(yīng)重金屬污染的一種早期生物標(biāo)志物已得到廣泛應(yīng)用。許多野外研究也發(fā)現(xiàn)，在野生魚類體內(nèi)MT的表達(dá)水平與水環(huán)境中重金屬含量，尤其是與鎘、鋅和銅3種重金屬污染程度呈現(xiàn)較好的相關(guān)性[10-12]，我國很多學(xué)者也進(jìn)行了重金屬誘導(dǎo)魚類或貝類MT mRNA表達(dá)的相關(guān)研究[13-15]。聯(lián)合國環(huán)境規(guī)劃署于1999年開展的“地中海行動計(jì)劃”中，把MT作為海洋環(huán)境監(jiān)測的生物標(biāo)志物之一[16]，歐盟及其他相關(guān)國際組織也把MT作為水生環(huán)境重金屬污染狀況評估的生物標(biāo)志物，并將MT作為關(guān)鍵性生物標(biāo)志物列入歐洲監(jiān)測計(jì)劃生物效應(yīng)質(zhì)量保證(Biological Effects Quality Assurance in Monitoring Programmes, BEQUALM)中[17]。目前，海洋動物MT含量已被認(rèn)為是海洋環(huán)境中重金屬污染監(jiān)測、暴露風(fēng)險(xiǎn)和健康評價(jià)的重要指標(biāo)，并受到廣泛重視[18-19]。然而，由于MT分子量比較小和極少含有芳香族氨基酸等特點(diǎn)，其提取和檢測方法比較復(fù)雜，使MT生物標(biāo)志物的推廣和應(yīng)用受到了一定的影響。重金屬對MT的誘導(dǎo)作用首先發(fā)生在轉(zhuǎn)錄水平，因此可以直接把MT mRNA作為生物標(biāo)志物應(yīng)用于監(jiān)測環(huán)境中重金屬的污染狀況[20-21]。由于檢測MT mRNA的方法比檢測MT蛋白的方法簡便可行，因此前者已經(jīng)被廣泛應(yīng)用。目前用于檢測MT mRNA表達(dá)方法主要有核酸印跡法(Northern blot)、半定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(semi-quantitative polymerase chain reaction)和實(shí)時(shí)定量PCR(real-time quantitative PCR, qPCR)，其中qPCR被公認(rèn)為是一種最靈敏又可靠的分析方法[15]。魚類MT mRNA作為生物標(biāo)志物已經(jīng)越來越多地應(yīng)用于水環(huán)境中重金屬污染效應(yīng)狀況的監(jiān)測[22-23]。然而重金屬脅迫下魚肝臟MT mRNA表達(dá)是否具有性別差異性特征，目前尚無相關(guān)的報(bào)道。

黑點(diǎn)青鳉(Oryzias melastigma)是海洋生態(tài)毒理學(xué)研究中理想的模式魚類[24-26]，具有如下優(yōu)點(diǎn)：溫度和鹽度適應(yīng)范圍廣；體型小，世代周期短，雌雄個(gè)體形態(tài)上差異明顯等，易于水族廳繁殖、飼養(yǎng)和試驗(yàn)。近年來，黑點(diǎn)青鳉在生態(tài)毒理學(xué)等研究中的應(yīng)用越來越多[27-28]。

本研究首先克隆了黑點(diǎn)青鳉MT cDNA全長序列，然后以環(huán)境濃度的鎘分別對雌、雄性黑點(diǎn)青鳉進(jìn)行水體暴露實(shí)驗(yàn)，旨在比較不同性別的黑點(diǎn)青鳉肝臟MT mRNA表達(dá)差異性，為應(yīng)用黑點(diǎn)青鳉肝臟MT mRNA作為生物標(biāo)志物監(jiān)測海洋環(huán)境重金屬污染生物效應(yīng)狀況提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法(Materials and methods)

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 黑點(diǎn)青鳉

黑點(diǎn)青鳉最初受贈于香港城市大學(xué)生化系Dr. Doris W T Au，已經(jīng)在我國家海洋局第三海洋研究所海洋生物與生態(tài)研究室青鳉養(yǎng)殖中心穩(wěn)定繁殖6代以上。養(yǎng)殖過程嚴(yán)格按照黑點(diǎn)青鳉養(yǎng)殖標(biāo)準(zhǔn)操作流程：室溫控制在(28±1)℃；光照周期為光∶暗=14 h∶10 h，光照強(qiáng)度100～500 lux；溶氧量DO≥6 mg·L-1；養(yǎng)殖用的海水為人工配制，鹽度為30‰；配備一套水質(zhì)在線實(shí)時(shí)監(jiān)測系統(tǒng)，監(jiān)測水中溶氧量、pH和電導(dǎo)等參數(shù)；每天2次固定時(shí)間分別投喂新孵化的活體豐年蟲，投餌量約為魚體重2%。

本研究中所用到的雌、雄性黑點(diǎn)青鳉來自國家海洋局第三海洋研究所青鳉養(yǎng)殖中心人工孵化的同一批魚卵，實(shí)驗(yàn)時(shí)年齡為8個(gè)月，雄魚平均體長(3.00±0.18) cm，平均體重(0.27±0.04) g；雌魚平均體長(2.76±0.22) cm，平均體重(0.22±0.04) g。

1.1.2 CdCl2母液配制

CdCl2(AR)購自美國Sigma-Aldrich公司。實(shí)驗(yàn)前用Milli-Q水配制為一系列濃度梯度的CdCl2母液備用。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 黑點(diǎn)青鳉MT cDNA全長序列克隆與生物信息學(xué)分析

使用TRIzol法提取黑點(diǎn)青鳉肝臟總RNA，根據(jù)已報(bào)道的黑點(diǎn)青鳉MT基因部分核苷酸序列(GenBank：HM137170)設(shè)計(jì)引物進(jìn)行MT cDNA全長擴(kuò)增。3'-RACE和5'-RACE的引物分別為：5'-CTGCGACTGCTCCAAAACTG-3'和5'-TGTCGCAGGTCTTCCCTTTG-3'，利用SMARTTMRACE cDNA Amplification Kit (TaKaRa)進(jìn)行MT基因cDNA第一鏈合成、5'-RACE和3'-RACE擴(kuò)增；然后將目的條帶切膠回收，與pMD19-T載體鏈接，轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細(xì)胞，經(jīng)平板培養(yǎng)和菌落PCR鑒定后進(jìn)行測序。

利用NCBI(http://www.ncbi.nlm.nih.gov)同源序列相似性在線搜索比對工具BLAST進(jìn)行黑點(diǎn)青鳉MT基因序列相似性搜索比對分析；使用GeneTool 1.0 Lite拼接基因序列；使用DNAssist 2.0軟件預(yù)測開放閱讀框(ORF)，翻譯編碼的氨基酸序列，預(yù)測蛋白質(zhì)分子量以及計(jì)算理論等電點(diǎn)；使用Clustalx 1.83軟件進(jìn)行各物種間氨基酸序列比對；利用MEGA 4.0軟件，構(gòu)建黑點(diǎn)青鳉MT基因的系統(tǒng)進(jìn)化樹。

1.2.2 鎘水體暴露實(shí)驗(yàn)

參考現(xiàn)行的“GB3097—1997中華人民共和國海水水質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)”(一類海水鎘≤ 1 μg·L-1，二類海水鎘≤ 5 μg·L-1，三、四類海水鎘≤ 10 μg·L-1)[29]，在劑量效應(yīng)實(shí)驗(yàn)中，鎘水體暴露濃度設(shè)計(jì)為0.8、4.0和8.0 μg·L-1共3個(gè)濃度組，同時(shí)設(shè)置一個(gè)空白對照組。各濃度設(shè)置2個(gè)平行組，每個(gè)平行組暴露體積10 L，隨機(jī)放入黑點(diǎn)青鳉成魚18條，每天更換一次含有相應(yīng)鎘濃度的海水。雄性和雌性黑點(diǎn)青鳉暴露實(shí)驗(yàn)分別同時(shí)進(jìn)行，盡量保證整個(gè)實(shí)驗(yàn)過程條件完全一致。暴露后的1、3、5和7 d這4個(gè)時(shí)間點(diǎn)分別取樣，每次取樣時(shí)從各濃度組的2個(gè)平行組分別隨機(jī)取4條，即每個(gè)濃度取8條魚(n=8)，解剖獲得的肝臟樣品立即放入液氮中速凍，然后轉(zhuǎn)移至-80 ℃超低溫冰箱中保存，用于后續(xù)的分析。

采用無火焰原子吸收分光光度法[29]，使用德國耶拿Zeenit 600原子吸收分光光度計(jì)測定空白對照組和3個(gè)不同鎘濃度暴露組海水鎘離子的實(shí)際濃度。

1.2.3 黑點(diǎn)青鳉MT mRNA表達(dá)定量分析

黑點(diǎn)青鳉肝臟MT mRNA表達(dá)水平利用qPCR方法進(jìn)行檢測，該基因擴(kuò)增引物序列同上述RACE實(shí)驗(yàn)所用的引物一致；內(nèi)參基因?yàn)?8S，qPCR實(shí)驗(yàn)步驟同文獻(xiàn)[26]中的方法。所用儀器為Rotor-Gene Q(德國Qiagen)，MT mRNA相對表達(dá)量分析方法基于2-ΔΔCT原理[30]進(jìn)行。

1.2.4 數(shù)據(jù)處理

所有數(shù)據(jù)均以平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤差(M±S.E.)表示，應(yīng)用IBM SPSS 19.0軟件中的單因素方差分析進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。結(jié)果中“*”表示統(tǒng)計(jì)學(xué)上具有顯著性差異(P < 0.05)。各個(gè)時(shí)間點(diǎn)處理組MT mRNA表達(dá)數(shù)據(jù)均與其相應(yīng)的對照組進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

2 結(jié)果(Results)

2.1 黑點(diǎn)青鳉MT cDNA序列分析

測序拼接后黑點(diǎn)青鳉MT cDNA全長及推導(dǎo)的氨基酸序列如圖1所示：全長385 bp，開放閱讀框?yàn)?80 bp，起始密碼子為ATG，終止密碼子為TGA，編碼60個(gè)氨基酸，預(yù)測編碼多肽的分子量為5 990 Da，理論pI為8.38；含有典型的多腺苷酸化信號序列(AATAAA)。BLAST在線比對結(jié)果顯示，該基因編碼的氨基酸序列與已經(jīng)報(bào)道的其他魚類MT基因的氨基酸序列一致性范圍為82%～98%，確認(rèn)該序列為黑點(diǎn)青鳉MT基因。

圖1 黑點(diǎn)青鳉MT全長cDNA序列及推導(dǎo)的氨基酸序列注：圖中灰色部分為預(yù)測編碼的氨基酸序列；終止密碼子用“*”表示。Fig. 1 Complementary DNA and predicted amino acid sequences of MT from O. melastigmaNote: The grey part indicates the predicted code of MT from O. melastigma. The stop code is indicated with an asterisk ‘*’.

圖2 黑點(diǎn)青鳉MT基因與其他魚類相同基因氨基酸序列比對注：‘*’表示具有完全一致的氨基酸的位置；‘:’和‘.’表示具有相似性質(zhì)的氨基酸的位置。Fig. 2 Multiple sequence alignment of MT among O. melastigma and other fish speciesNote:‘*’ indicates positions which have a single, fully conserved residue; ‘:’ indicates that one of the strong groups is fully conserved; ‘.’ indicates that one of the weaker groups is fully conserved.

圖3 黑點(diǎn)青鳉MT基因與其他魚類相同基因氨基酸序列系統(tǒng)進(jìn)化樹分析Fig. 3 Phylogenetic analysis of deduced amino acid sequences of MT cDNA from O. melastigma and other fish species

黑點(diǎn)青鳉MT基因編碼的氨基酸與其他魚類相同基因氨基酸序列比對結(jié)果如圖2所示。推導(dǎo)的黑點(diǎn)青鳉MT含20個(gè)半胱氨酸(Cys)殘基，占總氨基酸數(shù)目的三分之一，它們與鄰近的氨基酸組成了MT的保守性結(jié)構(gòu)，具有MT特征性序列結(jié)構(gòu)cys-x-cys、cys-x-x-cys和cys-x-cys-cys，與其他魚類的MT在Cys的排列方式上顯示出高度的保守性。黑點(diǎn)青鳉MT基因與其他魚類相同基因氨基酸序列系統(tǒng)進(jìn)化樹分析結(jié)果如圖3所示：黑點(diǎn)青鳉與鱖魚(Siniperca chuatsi)和吻鱗肩孔南極魚(Trematomus lepidorhinus)在進(jìn)化上距離較近，而與鮭科如大馬哈魚(Oncorhynchus keta)、銀鮭(Oncorhynchus kisutch)和北極紅點(diǎn)鮭(Salvelinus alpinus)等距離較遠(yuǎn)，分屬于兩個(gè)不同分支。

2.2 海水鎘離子濃度測定

測定結(jié)果顯示，空白對照組海水鎘離子濃度為0.196 μg·L-1，3個(gè)暴露組(0.8、4.0和8.0 μg·L-1)海水鎘離子實(shí)際濃度分別為0.965、4.182和8.194 μg·L-1。

2.3 水體鎘暴露對雄性黑點(diǎn)青鳉肝臟MT mRNA表達(dá)的影響

雄性黑點(diǎn)青鳉經(jīng)鎘暴露不同時(shí)間，肝臟中MT mRNA表達(dá)結(jié)果如圖4所示。暴露1 d后，0.8、4.0和8.0 μg·L-1濃度組MT mRNA相對表達(dá)量與對照組相比均顯示出快速且顯著性的升高，各濃度組表達(dá)水平為對照組的3.5～4.1倍。暴露3 d后，3個(gè)濃度組魚肝臟MT mRNA均被顯著性誘導(dǎo)，分別為對照組的9.6、9.0和7.5倍。暴露5 d后，0.8 μg·L-1和4.0 μg·L-1濃度組魚肝臟MT mRNA相對表達(dá)水平開始下降，但與對照組相比仍具有顯著性差異；而最高濃度的8.0 μg·L-1組MT mRNA表達(dá)水平仍不斷升高，達(dá)到對照組的10.6倍。暴露7 d后，各組的表達(dá)量水平總體上繼續(xù)呈下降趨勢，0.8、4.0和8.0 μg·L-1濃度組分別為對照組的1.5、3.3和5.3倍。除最低劑量組之外，4.0和8.0 μg·L-1濃度組MT mRNA表達(dá)量與對照組相比仍然具有顯著性差異。

圖4 水體鎘暴露對雄性黑點(diǎn)青鳉肝臟MT mRNA表達(dá)的影響Fig. 4 Hepatic MT mRNA expression pattern of male O. melastigma exposed to Cd

圖5 水體鎘暴露對雌性黑點(diǎn)青鳉肝臟MT mRNA表達(dá)的影響Fig. 5 Hepatic MT mRNA expression pattern of female O. melastigma exposed to Cd

2.4 水體鎘暴露對雌性黑點(diǎn)青鳉MT mRNA表達(dá)的影響

雌性黑點(diǎn)青鳉經(jīng)不同劑量和不同時(shí)間的鎘暴露后，肝臟MT mRNA表達(dá)結(jié)果如圖5所示。暴露1 d后，只有4.0 μg·L-1濃度組MT mRNA被顯著性誘導(dǎo)表達(dá)；暴露3 d后，各濃度組(0.8、4.0 和8.0 μg·L-1)的表達(dá)量呈現(xiàn)升高的趨勢，均達(dá)到最大值，分別為對照組的6.8、8.7和2.9倍。然而，隨著暴露時(shí)間延長到5～7 d后，MT mRNA表達(dá)量均下降到本底水平。

3 討論(Discussion)

魚類的肝臟是解除重金屬毒性的主要器官，在重金屬離子脅迫下，魚類肝臟中金屬硫蛋白及其mRNA表達(dá)通常呈現(xiàn)一種典型的“先誘導(dǎo)后抑制”模式。在一定濃度的環(huán)境重金屬誘導(dǎo)下，MT表達(dá)量先隨著暴露時(shí)間延長不斷升高；隨后當(dāng)MT含量達(dá)到閾值時(shí)又會對自身的轉(zhuǎn)錄機(jī)制產(chǎn)生負(fù)反饋調(diào)節(jié)，抑制其表達(dá)；同時(shí)MT也會由于相關(guān)酶的作用而被降解[31-33]。以魚類肝臟MT和MT mRNA為生物標(biāo)志物的實(shí)驗(yàn)結(jié)果大多數(shù)符合這種誘導(dǎo)模式[34-36]。Zhang等[37]將鯰魚(Ictalurus punctatus)暴露于100.0 μg·L-1的CdCl2中1～4 d，魚肝臟MT mRNA表達(dá)水平在1 d時(shí)呈上升趨勢，2 d時(shí)達(dá)到最高，并呈現(xiàn)顯著性差異，隨后降低到對照組水平。Choi等[38]對金魚(Carassius auratus)進(jìn)行0.1 μg·g-1CdCl2體內(nèi)注射，實(shí)驗(yàn)開始6 h后肝臟MT mRNA相對表達(dá)量已經(jīng)顯著升高，12 h后達(dá)到最高值，約為對照組的6倍，之后開始降低。在本研究中，鎘的時(shí)間效應(yīng)實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，暴露1～3 d期間，雌、雄性黑點(diǎn)青鳉肝臟MT mRNA表達(dá)均呈現(xiàn)上升趨勢，并且在3 d時(shí)達(dá)到最高水平；暴露5～7 d后，總體上表現(xiàn)出下降趨勢，而且雄性的表達(dá)更加顯著，這與上述報(bào)道的其他魚類重金屬暴露后MT mRNA表達(dá)呈現(xiàn)先誘導(dǎo)后抑制的結(jié)果相一致。

重金屬暴露后機(jī)體相關(guān)組織細(xì)胞中MT被誘導(dǎo)表達(dá)是生物重要防護(hù)機(jī)制之一。生物體內(nèi)具有一種或多種金屬效應(yīng)轉(zhuǎn)錄因子，能夠與相應(yīng)的金屬離子結(jié)合發(fā)生結(jié)構(gòu)的轉(zhuǎn)化，進(jìn)而與金屬效應(yīng)元件(metal response elements, MREs)結(jié)合，調(diào)控效應(yīng)基因，啟動MT基因轉(zhuǎn)錄。Cd2+可使轉(zhuǎn)錄因子從非活性狀態(tài)(非DNA結(jié)合型)轉(zhuǎn)化為活性狀態(tài)(DNA結(jié)合型)，在Cd2+作用下，DNA結(jié)合型金屬調(diào)控蛋白識別MREs，成為正調(diào)控因子，促進(jìn)MT基因轉(zhuǎn)錄，這可能是經(jīng)過鎘暴露后肝臟MT mRNA顯著升高的主要原因[39-40]。生物體中MT的誘導(dǎo)表達(dá)參與了體內(nèi)金屬的內(nèi)穩(wěn)和脫毒過程，利用人類胚胎腎細(xì)胞系進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn)，蛋白磷酸酶2A通過金屬轉(zhuǎn)錄因子-1(metal transcription factor-1, MTF-1)的去磷酸化而調(diào)控MT的表達(dá)[41]。然而，在魚類中MT的調(diào)控機(jī)制是否和哺乳動物中一致，目前尚不清楚。

Smaoui-Damak等[42]通過研究溝紋蛤仔(Ruditapes decussatus)不同季節(jié)消化腺和鰓中MT含量與性別的關(guān)系發(fā)現(xiàn)，MT含量的性別差異與蛤仔的生殖周期有關(guān)。Hamza-Chaffai等[43]的研究結(jié)果顯示，另一種蛤類(Ruditapes decussates)消化腺中MT含量在雌性體內(nèi)更高。除貝類外，鉤蝦(Gammarus locusta)的研究結(jié)果同樣顯示，MT含量與性別具有相關(guān)性[44]。在本實(shí)驗(yàn)中，黑點(diǎn)青鳉肝臟MT mRNA的表達(dá)同樣具有明顯的性別差異性。因此，推測MT mRNA性別差異性表達(dá)特征可能在不同水生動物中具有普遍性。在一些免疫刺激物或環(huán)境污染物脅迫下，黑點(diǎn)青鳉相關(guān)分子在轉(zhuǎn)錄水平的性別差異性表達(dá)已有報(bào)道。脂多糖刺激后，黑點(diǎn)青鳉抗菌肽hepcidin基因在肝和脾中雄性比雌性誘導(dǎo)水平更高[26]；經(jīng)多溴聯(lián)苯醚-47暴露后，黑點(diǎn)青鳉轉(zhuǎn)錄組表達(dá)譜和補(bǔ)體系統(tǒng)重要基因表現(xiàn)出雄性比雌性更敏感的性別差異特征[45-46]。本實(shí)驗(yàn)中，暴露1～7 d期間，雄性黑點(diǎn)青鳉肝臟MT mRNA，除了暴露7 d時(shí)的最低劑量組外，其余各劑量組均被顯著性誘導(dǎo)；而雌性暴露組，只有暴露3 d時(shí)，各劑量組均呈現(xiàn)顯著性升高，其余各組MT mRNA表達(dá)水平與對照組比較，總體上無顯著性差異。此外，與雌性比較，在整個(gè)暴露期間，雄性肝臟MT mRNA受鎘的誘導(dǎo)一直處于較高水平。由此可見，鎘暴露后，雄性黑點(diǎn)青鳉肝臟MT mRNA表現(xiàn)出誘導(dǎo)持續(xù)時(shí)間比較長和誘導(dǎo)倍數(shù)比較高的特征。因此，在海洋環(huán)境重金屬污染效應(yīng)研究與監(jiān)測中，選擇比較敏感的雄性黑點(diǎn)青鳉肝臟MT mRNA表達(dá)為指標(biāo)更合適。

綜上，本文首次克隆了黑點(diǎn)青鳉MT基因全長cDNA序列，在環(huán)境濃度鎘暴露條件下，雄性黑點(diǎn)青鳉肝臟MT mRNA的表達(dá)比雌性更敏感。以黑點(diǎn)青鳉肝臟MT mRNA作為生物標(biāo)志物監(jiān)測海洋環(huán)境重金屬鎘的污染是可行的，但應(yīng)充分考慮不同性別對重金屬脅迫響應(yīng)的差異性。我們的研究結(jié)果提示，利用生物標(biāo)志物監(jiān)測水環(huán)境污染物生物效應(yīng)時(shí)，監(jiān)測動物的性別差異是一個(gè)應(yīng)當(dāng)考慮的重要因素。

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Study on Gender Difference of Hepatic Metallothionein mRNA Expression ofOryziasmelastigmaExposed to Cadmium

Xie Qing, Bo Jun, Zheng Ronghui, Hong Fukun, Zhang Yusheng*

Third Institute of Oceanography, State Oceanic Administration, Xiamen 361005, China

Received 28 February 2016 accepted 21 April 2016

Although fish metallothionein (MT) mRNA as a biomarker has been widely used for monitoring heavy metal pollution in aquatic environment, there were no reports on the gender difference from fish hepatic MT mRNA expression under heavy metal exposure. In present study the full-length cDNA sequence of MT gene was isolated for the first time from medaka (Oryzias melastigma), a marine model fish, and MT gene and amino acid sequences were characterized. Then the gender difference of hepatic MT mRNA expression was studied between male and female medaka after exposure to environmentally relevant concentrations of Cd (0.8, 4.0 and 8.0 μg·L-1). The results indicate that hepatic MT cDNA of the medaka contains 385 bp, coding 60 amino acids with a predicted molecular weight 5 990 Da and containing the specific sequences of MT gene in vertebrates such as cys-x-cys, cys-x-x-cys and cys-x-cys-cys. After exposure to different concentrations of Cd for 1-7 d, hepatic MT mRNA expressions of all male medaka were almost significantly increased when compared with the control group, while the hepatic MT mRNA expressions of female medaka were significantly induced only by higher Cd concentrations with longer exposure time, and the induced levels were much lower than that of the male. By comparison of the gender difference of hepatic MT mRNA expression in the present study it is clear that male medaka is much more sensitive than the female, thus it is better to select the male medaka as a sentinel fish. The results indicate that gender difference is an important factor to be considered when using biomarkers for monitoring the biological effects of aquatic pollutants.

cadmium; Oryzias melastigma; metallothionein (MT) mRNA; gender difference

海洋公益性行業(yè)科研專項(xiàng)經(jīng)費(fèi)資助項(xiàng)目(201005016)；國家海洋局第三海洋研究所基本科研業(yè)務(wù)費(fèi)資助項(xiàng)目(海三科2012019)；國家海洋局近岸海域生態(tài)環(huán)境重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室開放基金(201204)

謝晴(1991-)，男，在讀碩士研究生，研究方向?yàn)楹Ｑ笊鷳B(tài)毒理學(xué)，E-mail: xieqing@tio.org.cn；

*通訊作者(Corresponding author)， E-mail: zhangyusheng@tio.org.cn

10.7524/AJE.1673-5897.20160228001謝晴, 薄軍, 鄭榕輝, 等. 鎘脅迫下黑點(diǎn)青鳉(Oryzias melastigma)肝臟金屬硫蛋白mRNA性別差異性表達(dá)研究[J]. 生態(tài)毒理學(xué)報(bào)，2016, 11(6): 93-101

2016-02-28 錄用日期：2016-04-21

1673-5897(2016)6-093-09

X171.5

A

張玉生(1956-)，男，二級研究員，主要研究方向?yàn)楹Ｑ笪廴旧镄?yīng)及其生物標(biāo)志物監(jiān)測技術(shù)。

Xie Q, Bo J, Zheng R H, et al. Study on gender difference of hepatic metallothionein mRNA expression of Oryzias melastigma exposed to cadmium [J]. Asian Journal of Ecotoxicology, 2016, 11(6): 93-101 (in Chinese)