劉祥，王敏，劉俊杰，陳凱，胡柳明，陳求穩(wěn),*

1. 南京水利科學(xué)研究院生態(tài)環(huán)境研究中心，南京 210029 2. 河海大學(xué)環(huán)境學(xué)院，南京 210098 3. 江蘇省水文水資源勘測局，南京 210093

汞和砷單一及聯(lián)合暴露對(duì)日本沼蝦的氧化應(yīng)激效應(yīng)

劉祥1,2，王敏1，劉俊杰3，陳凱1，胡柳明1，陳求穩(wěn)1,*

1. 南京水利科學(xué)研究院生態(tài)環(huán)境研究中心，南京 210029 2. 河海大學(xué)環(huán)境學(xué)院，南京 210098 3. 江蘇省水文水資源勘測局，南京 210093

為深入探討汞(Hg)和砷(As)對(duì)水生生物的慢性毒性效應(yīng)，以日本沼蝦(Macrobrachium nipponense)為受試生物，以超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化氫酶(CAT)、金屬硫蛋白(MT)和丙二醛(MDA)為測試分子標(biāo)志物，研究上覆水中不同濃度Hg和As單一及聯(lián)合暴露對(duì)日本沼蝦肝胰腺的氧化損傷及聯(lián)合作用機(jī)制。結(jié)果表明：Hg和As單一及聯(lián)合暴露對(duì)4種分子標(biāo)志物均可產(chǎn)生不同程度的抑制或激活效應(yīng)。其中，SOD活性均受到抑制，且高濃度As(1000 μg·L-1)暴露10 d的抑制率最大，高達(dá)59.13%；而CAT活性整體被激活，Hg單獨(dú)暴露下的激活效應(yīng)要高于As，且在聯(lián)合暴露組中隨著暴露時(shí)間的增加呈現(xiàn)出顯著的劑量效應(yīng)關(guān)系(P<0.05)；MT和MDA含量在Hg和As的暴露下均顯著增加(P<0.05)。其中MT對(duì)Hg的螯合能力大于As，As單獨(dú)暴露3 d后MDA變化較小，但10 d后其含量顯著增加(P<0.05)。析因方差分析發(fā)現(xiàn)，Hg-As對(duì)機(jī)體的聯(lián)合作用機(jī)制主要表現(xiàn)為協(xié)同作用。綜合生物標(biāo)志物響應(yīng)指數(shù)(IBR)評(píng)價(jià)證實(shí)，聯(lián)合毒性要高于單獨(dú)毒性，Hg與As在高濃度下聯(lián)合暴露10 d的IBR值最大，毒性最強(qiáng)，高濃度As單獨(dú)暴露處理組的毒性次之；同時(shí)，機(jī)體自身隨暴露時(shí)間延長對(duì)Hg也表現(xiàn)出一定的解毒功能。

汞；砷；日本沼蝦；聯(lián)合毒性；氧化應(yīng)激；交互作用；分子標(biāo)志物；協(xié)同作用

Received 11 May 2016 accepted 23 July 2016

近年來，隨著人類對(duì)河流的開發(fā)利用以及現(xiàn)代工農(nóng)業(yè)的快速發(fā)展，大量工業(yè)廢水和地表徑流排入水體造成各種污染物大量蓄積，尤其是重金屬污染負(fù)荷呈逐年增長。重金屬污染具有潛伏期長、毒性大、難降解和易于生物富集等特性[1-2]，對(duì)水生態(tài)系統(tǒng)的結(jié)構(gòu)和功能以及水資源利用產(chǎn)生巨大影響，嚴(yán)重威脅人類健康。雖然排入水體的重金屬離子絕大部分可以迅速吸附到懸浮物表面而轉(zhuǎn)移至沉積物中，但航道整治及河湖清淤等工程措施不僅導(dǎo)致了重金屬離子二次釋放，更是改變了重金屬離子在水環(huán)境中的遷移轉(zhuǎn)化規(guī)律，造成顯著的重金屬區(qū)域性污染[3]。對(duì)于長期暴露于重金屬污染中的水生生物來說，無疑會(huì)因富集重金屬離子而產(chǎn)生慢性毒性，甚至造成基因損傷而改變遺傳特性[4-5]。因此，近年來水體中溶解性重金屬離子的慢性生物毒性及其復(fù)合污染效應(yīng)成為淡水生態(tài)學(xué)領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)。

汞(Hg)和砷(As)是全球公認(rèn)的高毒性生物非必需元素，早在1976年就被美國國家環(huán)境保護(hù)局(U.S. EPA)列為優(yōu)先控制污染物。過去對(duì)環(huán)境介質(zhì)中Hg和As的研究基本集中在總量及形態(tài)分布方面，較少涉及對(duì)其生物毒性的定量研究。排放到水體中的Hg易被甲基化而形成劇毒性的甲基汞。甲基汞可以通過呼吸道、消化道和皮膚侵入生物體，使機(jī)體中某些酶失去活性而引起中毒，同時(shí)對(duì)中樞神經(jīng)系統(tǒng)產(chǎn)生較大損傷[6-7]；As的毒性大小取決于其在機(jī)體內(nèi)的蓄積程度，進(jìn)入機(jī)體的As可以進(jìn)入血液循環(huán)引起細(xì)胞組織營養(yǎng)障礙而產(chǎn)生慢性毒性，擾亂細(xì)胞的正常代謝，導(dǎo)致細(xì)胞死亡[7]。隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，生物監(jiān)測技術(shù)逐漸受到研究者的青睞，迄今為止，以魚類作為受試生物展開重金屬生物毒性的研究較多，對(duì)底棲動(dòng)物重金屬生物毒性的研究尚處于起步階段。

日本沼蝦(Macrobrachium nipponense)，俗稱河蝦，廣泛分布于我國江、河、湖泊和水庫中，是我國淡水水域中典型的底棲動(dòng)物優(yōu)勢種，是一種具有重要經(jīng)濟(jì)價(jià)值的甲殼類動(dòng)物；在水生態(tài)食物鏈中占據(jù)重要地位，不僅可以攝食水中有機(jī)碎屑降低污染，還可以作為更高營養(yǎng)級(jí)生物的餌料[8]。然而，當(dāng)河蝦蓄積的重金屬離子濃度超出一定閾值后，就會(huì)產(chǎn)生大量的活性氧自由基而引起機(jī)體氧化損傷[9-10]。肝胰腺作為機(jī)體對(duì)外源物質(zhì)的代謝解毒組織，與毒性物質(zhì)的接觸程度最高，是機(jī)體抗氧化防御的關(guān)鍵部位。本研究結(jié)合實(shí)際水體中Hg和As的濃度檢出范圍和水環(huán)境質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，設(shè)置不同處理組，在不同時(shí)間點(diǎn)測定河蝦肝胰腺中典型分子標(biāo)志物的變化，揭示Hg和As單一及聯(lián)合對(duì)機(jī)體的慢性生物毒性，并分析其聯(lián)合作用機(jī)制，同時(shí)采用綜合生物標(biāo)志物指數(shù)評(píng)價(jià)不同處理組的生物毒性大小，突破了原先僅以急性致死效應(yīng)判別污染物風(fēng)險(xiǎn)濃度的局限，進(jìn)一步闡明了水體中有毒金屬離子的潛在慢性生物毒性，為河流健康及水環(huán)境風(fēng)險(xiǎn)管理提供依據(jù)。

1 材料與方法(Materials and methods)

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

以河蝦作為受試生物，以Hg和As作為目標(biāo)污染物，在實(shí)驗(yàn)室內(nèi)展開重金屬單一及聯(lián)合暴露對(duì)河蝦肝胰腺的氧化損傷實(shí)驗(yàn)。水體Hg和As污染模擬均采用相應(yīng)的金屬鹽，分別為HgCl2和NaAsO2(分析純，中國國藥集團(tuán))。暴露實(shí)驗(yàn)桶的材質(zhì)為聚氯乙烯，最大容積為40 L。

實(shí)驗(yàn)用河蝦取自南京某河蝦養(yǎng)殖場，實(shí)驗(yàn)前先室內(nèi)暫養(yǎng)3 d以適應(yīng)新環(huán)境。為避免生物個(gè)體大小差異對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果造成誤差，選用的河蝦平均體長為(6.43±0.21) cm，體重為(2.62±0.15) g；為避免天然水體中殘存的重金屬濃度對(duì)實(shí)驗(yàn)的背景干擾，實(shí)驗(yàn)用水選用在太陽下暴曬10 d除氯后的自來水作為實(shí)驗(yàn)水體。為模擬真實(shí)水環(huán)境，在每個(gè)暴露桶中投加伊樂藻(Elodea nuttallii)(見圖1)，伊樂藻不僅為河蝦提供棲息場所，而且還可以作為河蝦的青飼料。

1.2 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

實(shí)驗(yàn)包括對(duì)照組(Control)，Hg單獨(dú)處理組，As單獨(dú)處理組以及Hg與As聯(lián)合處理組共10個(gè)暴露組，其中Hg和As的低(L)、中(M)、高(H)3個(gè)濃度梯度分別為：1、10、100 μg·L-1和10、100、1 000 μg·L-1，2種重金屬聯(lián)合暴露濃度梯度為(1+10)、(10+100)、(100+1 000) μg·L-1，濃度分別以汞離子和砷離子計(jì)。每個(gè)實(shí)驗(yàn)桶中分別盛裝25 L水，根據(jù)濃度梯度設(shè)定值，按照稀釋的方法將配好的母液投加到實(shí)驗(yàn)桶中并用玻璃棒攪勻水體。然后將實(shí)驗(yàn)用河蝦隨機(jī)分為10組，每組24只投加到每個(gè)實(shí)驗(yàn)桶中?？刂扑疁夭怀^10 ℃并用空氣泵進(jìn)行水體增氧，保證水中溶解氧的濃度不低于4 mg·L-1。分別在暴露3 d和10 d后取生物樣品，每組每個(gè)平行取樣3只，解剖河蝦，取出肝胰腺，迅速在-80 ℃下冰凍保存用于后續(xù)生物標(biāo)志物分析。

圖1 河蝦在不同重金屬處理組中的暴露示意圖Fig. 1 Schematic diagram of treatments of different heavy metals with different concentrations for river shrimp

1.3 檢測分析

主要測定河蝦肝胰腺中4種代表性分子生物標(biāo)志物，分別為超氧化物歧化酶(SOD，U·mg-1Protein)、過氧化氫酶(CAT，U·mg-1Protein)、金屬硫蛋白(MT，ng·mg-1Protein)和脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物丙二醛(MDA，mmol·mg-1Protein)。具體測定步驟和計(jì)算按南京建成生物工程研究所的試劑盒說明書進(jìn)行。

1.4 數(shù)據(jù)處理

生物標(biāo)志物數(shù)據(jù)均用平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差(Mean±SD)表示，采用IBM SPSS Statistics 22中的Shapiro-Wilk和Levene方法對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行常態(tài)和同方差性檢驗(yàn)，采用單因素方差分析(ANOVA)進(jìn)行組間差異顯著性的檢驗(yàn)(LSD)，處理組與對(duì)照組以及處理組之間采用Dunnett T3檢驗(yàn)法進(jìn)行差異顯著性檢驗(yàn)，顯著水平設(shè)為P<0.05。運(yùn)用2×2析因方差分析方法揭示Hg和As對(duì)生物體的聯(lián)合作用機(jī)制。

計(jì)算綜合生物標(biāo)志物指數(shù)(IBR)[11]，具體計(jì)算公式如下所示。把不同處理組的IBR值繪制成星狀圖，IBR值越大，生物受到的慢性毒性越大。

Bi=Zi+|Ymin|

Ai=1/2sin(2π/n)BiBi+1

2 結(jié)果(Results)

2.1 Hg和As單一及聯(lián)合暴露下肝胰腺中分子標(biāo)志物響應(yīng)

Hg和As單一及聯(lián)合暴露下河蝦肝胰腺中4種典型生物標(biāo)志物隨濃度和時(shí)間的變化如圖2所示。從圖2(a)中可知，Hg和As脅迫對(duì)肝胰腺中SOD活性均產(chǎn)生顯著抑制效應(yīng)(P<0.05)，尤其在高濃度As暴露10 d后抑制作用最顯著(P<0.05)，SOD值為(76.52±6.54) U·mg-1protein，相比于對(duì)照組，抑制率高達(dá)59.13%。具體來講，單獨(dú)Hg脅迫對(duì)SOD活性的抑制效應(yīng)要高于單獨(dú)As暴露，單獨(dú)Hg暴露時(shí)，SOD活性隨劑量均呈現(xiàn)出先增后降趨勢，但暴露10 d后，SOD活性對(duì)低和中等濃度的Hg表現(xiàn)出一定適應(yīng)性；單獨(dú)As暴露時(shí)，機(jī)體肝胰腺對(duì)As的適應(yīng)性隨濃度的增加而降低，對(duì)低濃度As表現(xiàn)出較強(qiáng)的適應(yīng)性，SOD活性可以恢復(fù)到對(duì)照組水平，而高濃度下，SOD活性隨時(shí)間則被顯著抑制(P<0.05)。Hg和As聯(lián)合暴露時(shí)，肝胰腺SOD活性隨暴露濃度的增加則表現(xiàn)出顯著的劑量效應(yīng)(P<0.05)。

從圖2(b)可以看出，除低濃度聯(lián)合暴露3 d之外，Hg和As脅迫對(duì)肝胰腺中CAT活性均產(chǎn)生顯著的激活效應(yīng)(P<0.05)，且單獨(dú)Hg對(duì)CAT活性的激活效應(yīng)要高于單獨(dú)As。單獨(dú)Hg暴露時(shí)，CAT活性隨劑量呈現(xiàn)出先增后降趨勢，暴露10 d后，仍呈現(xiàn)先增后降趨勢，但僅在中等濃度下，CAT活性可以繼續(xù)被激活，其余濃度則表現(xiàn)出時(shí)間抑制效應(yīng)；單獨(dú)As暴露時(shí)，CAT活性均受到較小程度的激活，從劑量角度來看，中等濃度的激活效應(yīng)最大，從時(shí)間尺度來看，均表現(xiàn)出微弱的抑制效應(yīng)；Hg和As聯(lián)合暴露時(shí)，CAT活性與時(shí)間和劑量呈現(xiàn)出顯著的正相關(guān)效應(yīng)(P<0.05)，在高濃度下暴露10 d后，CAT活性達(dá)到最大值，為(0.95±0.08) U·mg-1protein。

肝胰腺中MT含量在不同暴露組中隨時(shí)間和劑量的變化如圖2(c)所示。整體看來，肝胰腺中的MT均可與水體中的Hg、As離子結(jié)合而引起含量增加，尤其在聯(lián)合暴露下，MT含量增加較大，其中在中等濃度下聯(lián)合暴露3 d后，MT含量達(dá)到所有實(shí)驗(yàn)組最大值，為(0.67±0.07) ng·mg-1protein；單獨(dú)As暴露下，MT含量隨時(shí)間和劑量的增加而增大(P<0.05)；單獨(dú)Hg暴露下，MT含量變化無顯著時(shí)間和劑量效應(yīng)，低濃度下暴露10 d后，MT含量恢復(fù)到對(duì)照水平，而在中等濃度下，MT含量表現(xiàn)出微弱的時(shí)間效應(yīng)(P<0.05)。

圖2 Hg和As單一及聯(lián)合脅迫對(duì)河蝦肝胰腺中SOD活性(a)、CAT活性(b)、MT含量(c)和MDA含量(d)的影響注：不同字母表示相互之間存在顯著性差異(P<0.05)。Hg (L)、Hg (M)、Hg (H)，As (L)、As (M)、As (H)，Hg+As (L)、Hg+As (M)、Hg+As (H)的濃度分別為1 μg·L-1、10 μg·L-1、100 μg·L-1，10 μg·L-1、100 μg·L-1、1 000 μg·L-1，(1+10)、(10+100)、(100+1 000) μg·L-1。Fig. 2 Barplots of SOD activity (a), CAT activity (b), MT level (c) and MDA level (d) in hepatopancreas of river shrimps under treatments of control, low (L), middle (M), and high (H) gradient of Hg and As (single or in combination) concentrationsNote: Bars not sharing common letters were significantly different from each other (P<0.05). The concentrations of Hg (L), Hg (M),Hg (H); As (L), As (M), As (H)；Hg+As (L), Hg+As (M) and Hg+As (H) was 1 μg·L-1, 10 μg·L-1,100 μg·L-1; 10 μg·L-1, 100 μg·L-1, 1 000 μg·L-1; (1+10), (10+100) and (100+1 000) μg·L-1, respectively.

從圖2(d)可以看出，MDA含量整體隨時(shí)間和劑量的增大而增大，其中Hg和As聯(lián)合暴露時(shí)所引起的肝胰腺氧化損傷程度要大于單獨(dú)暴露，而單獨(dú)As所引起的氧化損傷大小僅在10 d后顯著，在暴露3 d時(shí)，MDA含量要低于單獨(dú)Hg處理組；其次，Hg和As在中等濃度聯(lián)合暴露3 d后對(duì)肝胰腺細(xì)胞產(chǎn)生的氧化損傷壓力最大，MDA含量為(15.54±0.99) nmol·mg-1protein，暴露10 d后，MDA含量稍有降低，為(14.82±0.70) nmol·mg-1protein，然而，高濃度下聯(lián)合暴露10 d后，MDA含量顯著高于暴露3 d時(shí)，為(15.29±0.98) nmol·mg-1protein (P<0.05)。

2.2 Hg和As聯(lián)合毒性效應(yīng)分析

Hg-As在不同濃度梯度下聯(lián)合對(duì)河蝦肝胰腺中的綜合生物標(biāo)志物指數(shù)(IBR)的聯(lián)合作用分析結(jié)果和聯(lián)合毒性作用特征分別見表1和圖3。低、中和高濃度Hg-As聯(lián)合暴露對(duì)IBR均產(chǎn)生交互作用，由Hg、As單獨(dú)及交互作用的Partial Eta2可知，在低濃度下暴露3 d，各因素對(duì)IBR變化的貢獻(xiàn)大小順序?yàn)镠g (L) > As (L) > Hg + As (L)，劑量-效應(yīng)曲線表明，Hg和As聯(lián)合對(duì)IBR的交互作用為協(xié)同作用(圖3a)；在中濃度下暴露3 d，各因素對(duì)IBR變化的貢獻(xiàn)大小順序?yàn)镠g (M) > As (M) > Hg + As (M)，劑量-效應(yīng)曲線表明Hg和As聯(lián)合對(duì)IBR的交互作用為協(xié)同作用(圖3a)；在高濃度下暴露3 d，各因素對(duì)IBR變化的貢獻(xiàn)大小順序?yàn)镠g (H) > Hg + As (H) >As (H)，劑量-效應(yīng)曲線表明Hg和As聯(lián)合對(duì)IBR的交互作用為拮抗作用(圖3a)。在低濃度下暴露10 d，各因素對(duì)IBR變化的貢獻(xiàn)大小順序?yàn)锳s (L) > Hg (L) > Hg + As (L)，劑量-效應(yīng)曲線表明Hg和As聯(lián)合對(duì)IBR的交互作用為協(xié)同作用(圖3b)；在中濃度下暴露10 d，各因素對(duì)IBR變化的貢獻(xiàn)大小順序?yàn)镠g (M) > As (M) > Hg + As (M)，劑量-效應(yīng)曲線表明Hg和As聯(lián)合對(duì)IBR的交互作用為協(xié)同作用(圖3b)；在高濃度下暴露10 d，各因素對(duì)IBR變化的貢獻(xiàn)大小順序?yàn)锳s (H) > Hg (H) > Hg + As (H)，量-效應(yīng)曲線表明Hg和As聯(lián)合對(duì)IBR的交互作用為協(xié)同作用(圖3b)。

圖3 Hg/As不同濃度梯度聯(lián)合暴露3 d (a)和10 d (b)對(duì)河蝦肝胰腺綜合生物標(biāo)志物的交互作用Fig. 3 Effects of Hg-As interaction on hepatopancreatic IBR value in river shrimp under different concentration gradient after 3 d (a) and 10 d (b) exposure

表1 Hg/As對(duì)河蝦肝胰腺綜合生物標(biāo)志物指數(shù)(IBR)聯(lián)合作用的析因分析Table 1 Factorial analyses of combined effects of Hg-As on hepatopancreatic integrated biomarker response (IBR) in river shrimp

注：*表示差異顯著(P<0.05)；Partial Eta2表示各因素對(duì)變異的貢獻(xiàn)；L、M、H表示低、中、高3種濃度梯度。

Note:* indicates significant difference (P<0.05); Partial Eta2shows the contribution to variation from the factors; the letters of L, M and H show the low, middle and high concentration gradient.

圖4 Hg和As單一及聯(lián)合污染下IBR響應(yīng)圖Fig. 4 Star plots of IBR from different exposure groups with heavy metals (Hg and As) during different periods

2.3 綜合生物標(biāo)志物毒性評(píng)價(jià)

河蝦肝胰腺在不同暴露時(shí)間及不同重金屬暴露下的綜合生物標(biāo)志物響應(yīng)如圖4所示。相比于對(duì)照組，Hg和As單一及聯(lián)合暴露對(duì)4種典型生物標(biāo)志物均產(chǎn)生影響且呈現(xiàn)出各自的特征?？傮w看來，聯(lián)合暴露下對(duì)肝胰腺產(chǎn)生的氧化應(yīng)激效應(yīng)要大于單一金屬暴露。具體說來，生物體在不同暴露組中暴露3 d后，Hg與As在中等濃度下聯(lián)合對(duì)河蝦肝胰腺產(chǎn)生的慢性毒性最大，IBR值為2.83，其次，Hg (H)所產(chǎn)生的毒性次之，IBR為2.30；10 d后，河蝦可以在部分處理組中表現(xiàn)出一定的毒性適應(yīng)性，如Hg (H)、Hg+As (L)和Hg+As (M)，而在其他處理組中，慢性毒性效應(yīng)表現(xiàn)出較強(qiáng)的時(shí)間效應(yīng)，尤其在Hg+As (H)處，IBR值顯著增加，達(dá)到全處理組最大值，為3.87，其次，在As (H)處也呈現(xiàn)出一定的氧化效應(yīng)增加趨勢，IBR值由原來的0.76增加到1.68。此外，肝胰腺細(xì)胞對(duì)Hg污染表現(xiàn)出一定的重金屬解毒機(jī)制，尤其在Hg (H)表現(xiàn)顯著。

3 討論(Discussion)

天然水體中，往往是多種重金屬同時(shí)存在共同作用于某一生物，存在聯(lián)合交互作用。生態(tài)毒理學(xué)中的交互作用主要包括協(xié)同作用、相加作用、獨(dú)立作用和拮抗作用[4]。然而，水體中重金屬對(duì)水生生物的聯(lián)合作用是一個(gè)很復(fù)雜的問題，其聯(lián)合毒性類型不僅取決于污染物的組成，而且與目標(biāo)生物、暴露濃度及時(shí)間等密切相關(guān)[4,12]。本研究顯示，Hg與As對(duì)河蝦肝胰腺的聯(lián)合作用以協(xié)同作用為主，僅在高濃度下聯(lián)合暴露3 d才表現(xiàn)為拮抗作用。對(duì)于協(xié)同效應(yīng)產(chǎn)生的主要原因可能是由于重金屬離子共同作用于機(jī)體時(shí)，細(xì)胞膜的通透性增強(qiáng)，進(jìn)入機(jī)體的重金屬離子濃度增加，因此對(duì)機(jī)體產(chǎn)生的生物毒性增強(qiáng)[13]；然而，對(duì)于拮抗作用可以用競爭點(diǎn)位理論來解釋：金屬離子進(jìn)入細(xì)胞前先要與細(xì)胞表面的接受點(diǎn)位結(jié)合[4]，當(dāng)Hg與As在高濃度下共存時(shí)，對(duì)細(xì)胞表面的接受點(diǎn)位產(chǎn)生競爭效應(yīng)而產(chǎn)生拮抗效應(yīng)，但具體如何競爭目前還沒有相關(guān)研究報(bào)道；其次，不同重金屬離子與MT的親合力或螯合飽和度差異也是引起交互作用不同的另一個(gè)重要原因[14]。

雖然Hg和As對(duì)生物細(xì)胞的毒性機(jī)制目前仍未完全清楚，但眾多研究表明，生物體在受到重金屬脅迫時(shí)，重金屬主要是通過誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生大量活性氧自由基，并改變細(xì)胞內(nèi)氧化還原平衡狀態(tài)來引起毒性作用的[9,15]。其次，Hg和As還可以通過影響或阻斷呼吸鏈、電子傳遞鏈、酶促反應(yīng)等體內(nèi)正常生理代謝，致使機(jī)體處于氧化應(yīng)激狀態(tài)[16-17]。然而，為消除或減緩因活性氧累積而產(chǎn)生的氧化損傷，生物體內(nèi)的各種酶和非酶抗氧化劑聯(lián)合作用可以構(gòu)成抗氧化防御系統(tǒng)。低濃度、短時(shí)間脅迫對(duì)分子標(biāo)志物產(chǎn)生的激活作用可認(rèn)為是生物對(duì)污染的適應(yīng)性反應(yīng)，以增強(qiáng)機(jī)體消除活性氧自由基的能力；而高濃度、長時(shí)間脅迫所產(chǎn)生的抑制作用，可認(rèn)為是氧化損傷壓力已超過機(jī)體的調(diào)節(jié)能力。因此，其所導(dǎo)致的酶活性降低可認(rèn)為是中毒反應(yīng)的前兆[18]。

CAT是一種末端血紅素氧化酶，在抗氧化防御系統(tǒng)中，其主要作用就是催化H2O2分解為H2O和O2，防止H2O2蓄積量過高對(duì)機(jī)體組織造成損傷[25]。本研究中CAT活性在Hg和As脅迫下整體呈現(xiàn)出誘導(dǎo)效應(yīng)(圖2b)，主要是因?yàn)榻饘匐x子進(jìn)入肝胰腺細(xì)胞后，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生大量的活性氧，致使產(chǎn)生氧化壓力，為保護(hù)機(jī)體細(xì)胞，CAT活性被激活。然而，CAT活性在單獨(dú)暴露組上表現(xiàn)先增后降的拋物線趨勢，主要原因可能是暴露初期在高濃度Hg和As的作用下，肝胰腺細(xì)胞內(nèi)金屬離子濃度急劇增加，一方面過量活性氧自由基抑制了CAT的生成，另一方面過量金屬離子破壞了細(xì)胞膜，改變了細(xì)胞內(nèi)的氧化還原的平衡條件，致使細(xì)胞損傷而引起CAT活性降低[12]。

MT是一類可被多種因素誘導(dǎo)的低分子量、富含半胱氨酸的蛋白質(zhì)，在淡水無脊椎底棲動(dòng)物中能結(jié)合金屬離子發(fā)生特異性結(jié)合，具有維持生物體內(nèi)金屬含量的動(dòng)態(tài)平衡和重金屬解毒作用的雙重機(jī)制[14]。圖2c顯示，MT含量整體顯著提高，部分處理組在隨著暴露時(shí)間的延長，含量有所降低，這一實(shí)驗(yàn)結(jié)果與諸多有關(guān)魚類肝臟中MT含量的變化一致[9,18]。引起這種變化的原因主要是因?yàn)榧?xì)胞富集的大量金屬離子，均能與MT結(jié)合，然而，隨著暴露時(shí)間延長，細(xì)胞中的MT的螯合節(jié)點(diǎn)逐漸飽和，MT含量不再上升，甚至出現(xiàn)下降趨勢。其次，金屬離子與MT的結(jié)合與金屬離子的電勢密切相關(guān)，李詩逸等[26]指出，Hg2+與MT的結(jié)合能力較高，與本實(shí)驗(yàn)結(jié)果相符。但結(jié)合細(xì)胞中MDA含量的變化，MT含量下降時(shí)MDA含量也減小，產(chǎn)生這種現(xiàn)象的原因可能是：隨著暴露時(shí)間與濃度的增大，MT對(duì)重金屬離子的螯合能力有限，并不能無限結(jié)合金屬離子，導(dǎo)致過量金屬離子在細(xì)胞中累積而引起過氧化損傷。

MDA既是機(jī)體內(nèi)脂質(zhì)過氧化反應(yīng)的重要產(chǎn)物，其含量變化可以直接表明生物受損傷大小，同時(shí)又可與蛋白質(zhì)的游離氨基作用，引起蛋白質(zhì)分子內(nèi)與分子間交聯(lián)，導(dǎo)致細(xì)胞損傷[14,25]。圖2d顯示，Hg和As污染脅迫對(duì)河蝦肝胰腺均會(huì)產(chǎn)生較大的氧化損傷，這種結(jié)果與眾多污染脅迫動(dòng)態(tài)研究結(jié)果相類似。產(chǎn)生這種現(xiàn)象的原因可能是，由于重金屬脅迫，河蝦體內(nèi)活性氧自由基水平過高，超出機(jī)體抗氧化防御系統(tǒng)的能力，過剩的活性氧自由基攻擊生物膜磷脂中不飽和脂肪酸雙鍵而導(dǎo)致脂質(zhì)的過氧化反應(yīng)，相應(yīng)地MDA含量隨之升高。

科學(xué)準(zhǔn)確地進(jìn)行重金屬生物毒性監(jiān)測與評(píng)價(jià)是當(dāng)前河流生態(tài)健康診斷的基礎(chǔ)。傳統(tǒng)重金屬生物毒性評(píng)價(jià)大多基于半致死濃度(LC50)。這忽略了低濃度重金屬的慢性生物毒性，提高了毒物的風(fēng)險(xiǎn)濃度。本研究綜合不同慢性毒性指標(biāo)進(jìn)行不同處理組的生物毒性評(píng)價(jià)，不僅可以避免單一生物標(biāo)志物的偶然性和不確定性，而且可以消除不同生物標(biāo)志物對(duì)不同污染物響應(yīng)程度的差異，更準(zhǔn)確地比較不同濃度梯度重金屬的慢性毒性大小。

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Effects of Oxidative Stress onMacrobrachiumnipponenseInduced by Single and Joint Exposure to Mercury and Arsenic

Liu Xiang1,2, Wang Min1, Liu Junjie3, Chen Kai1, Hu Liuming1, Chen Qiuwen1,*

1. Center for Eco-Environmental Research, Nanjing Hydraulic Research Institute, Nanjing 210029, China 2. College of Environment, Hohai University, Nanjing 210098, China 3. Jiangsu Hydrology and Water Resources Bureau, Nanjing 210093, China

To in-depth explore the chronic toxic effects of mercury (Hg) and arsenic (As) on aquatic organisms, oxidative damage and combined toxicity induced by single and joint exposure to Hg and As under different concentrations on river shrimp (Macrobrachium nipponense) were investigated. Superoxide dismutase (SOD), catalase (CAT), metallothionein (MT) and malondialdehyde (MDA) in hepatopancreas of the river shrimps were selected as tested biomarkers. The results showed that single and joint exposure to Hg and As could either inhibit or induce these four biomarkers. While all SOD activities were inhibited, the maximum inhibition rate of 59.13% was observed after 10 day-exposure to high As concentration (1000 μg·L-1). On the contrary, the CAT was activated as a whole, with higher activation rate at the single Hg treatments and significant dose-effect at the joint exposure groups along the exposure time (P<0.05). MT and MDA levels increased significantly (P<0.05) under the stress of Hg and As, and the chelating ability of MT to Hg was greater than As. MDA level increased slightly after 3-day exposure compared to control group, while showed a significant increase after 10-day exposure (P<0.05). Factorial analysis of variance revealed that the synergistic effects on organism were mainly found during Hg-As joint exposure. Toxicity evaluation based on integrated biomarker response (IBR) also suggested that the toxicity was higher in joint Hg and As exposure than the single exposure. The joint exposure of Hg and As at high concentration after 10 days made the largest contribution to IBR value, indicating the highest toxicity, followed by single As treatment with high concentration. The organism itself also showed a detoxification function to Hg as the extension of exposure time.

mercury; arsenic; Macrobrachium nipponense; joint toxicity; oxidative stress; interaction; biomarker; synergistic effects

江蘇省水利科技重大項(xiàng)目(2015005)；“十二五”水專項(xiàng)-“淮河流域水質(zhì)-水量-水生態(tài)聯(lián)合調(diào)度關(guān)鍵技術(shù)研究與示范”課題(No.2014ZX07204-006-01)；公益性行業(yè)科研專項(xiàng)經(jīng)費(fèi)項(xiàng)目—“淮河流域防洪工程體系多目標(biāo)協(xié)同調(diào)控研究”課題(201501007)

劉祥(1989-)，男，博士，研究方向?yàn)樗廴究刂婆c水環(huán)境生態(tài)，E-mail: gclx_2007@126.com

*通訊作者(Corresponding author)， E-mail: qchen@rcees.ac.cn

10.7524/AJE.1673-5897.20160511001

2016-5-11 錄用日期：2016-7-23

1673-5897(2016)6-144-09

X171.5

A

陳求穩(wěn)(1974—)，男，生態(tài)水力學(xué)博士，研究員，博士生導(dǎo)師，主要研究方向生態(tài)水力學(xué)，發(fā)表學(xué)術(shù)論文180余篇。

劉祥, 王敏, 劉俊杰, 等. 汞和砷單一及聯(lián)合暴露下對(duì)日本沼蝦的氧化應(yīng)激效應(yīng)[J]. 生態(tài)毒理學(xué)報(bào)，2016, 11(6): 144-152

Liu X, Wang M, Liu J J, et al. Effects of oxidative stress on Macrobrachium nipponense induced by single and joint toxic effect of exposure to mercury and arsenic [J]. Asian Journal of Ecotoxicology, 2016, 11(6): 144-152 (in Chinese)