李楓林，張 寶，管石俠，侯麗麗，程 靖，蔣建華

非酒精性脂肪肝病大鼠IL-1β、IL-18、TNF-α水平的變化

李楓林，張 寶，管石俠，侯麗麗，程 靖，蔣建華

目的探討血清炎癥因子白細(xì)胞介素1β（IL-1β）、白細(xì)胞介素18（IL-18）、腫瘤壞死因子α（TNF-α）水平在非酒精性脂肪性肝病（NAFLD）大鼠中的變化及意義。方法24只雄性SD大鼠隨機(jī)分為造模組（n=12）及對照組（n=12），造模組予以高脂飼料喂養(yǎng)，對照組予以普通飼料喂養(yǎng)。分別于實(shí)驗(yàn)第4、8周各處死6只大鼠。生物化學(xué)法檢測血清谷丙轉(zhuǎn)氨酶（ALT）、谷草轉(zhuǎn)氨酶（AST）、總膽固醇（TC）、三酰甘油（TG）、高密度脂蛋白膽固醇（HDL-C），ELISA法檢測血清IL-1β、IL-18、TNF-α，光鏡和電鏡下觀察肝臟病理變化。結(jié)果與同期對照組比較，造模組的大鼠體重、肝濕重及肝指數(shù)均增高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。與同期對照組比較，造模組的ALT、AST、TC、TG高，HDL-C低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。4周和8周的IL-1β、IL-18、TNF-α水平均較同期的對照組高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。HE染色顯示造模組有輕-中度的脂肪變性，電鏡下造模組可見大小不等的脂滴。結(jié)論喂食高脂飼料8周成功的建立了NAFLD大鼠模型。其中IL-1β、IL-18、TNF-α可作為肝細(xì)胞損傷的標(biāo)志因子，在肝臟脂肪變的發(fā)生中起到重要作用。

非酒精性脂肪性肝病；高脂飲食；白細(xì)胞介素1β；白細(xì)胞介素18；腫瘤壞死因子α

非酒精性脂肪性肝病（non-alcoholic fatty liver disease，NAFLD）是一種無過量飲酒史和其他確切的肝損傷因素，并以肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞脂肪變性和肝臟脂肪貯積為病理特征的臨床綜合征［1］。其疾病譜是包括非酒精單純的肝臟脂肪變性、非酒精性脂肪性肝炎以及最終演變的肝硬化甚至是肝細(xì)胞癌［2］。隨著當(dāng)今生活水平的提高、生活方式的變化和膳食結(jié)構(gòu)的改變，NAFLD的發(fā)病率呈逐年上升趨勢，并且發(fā)生率有顯著的年輕化趨勢［3］。而Day［4］提出的“二次打擊”學(xué)說中的胰島素抵抗（insulin resistance，IR）、氧化應(yīng)激和脂質(zhì)過氧化仍然是目前NAFLD發(fā)病機(jī)制中公認(rèn)的關(guān)鍵因素。尤其提出是細(xì)胞內(nèi)的脂質(zhì)毒性導(dǎo)致細(xì)胞炎性因子釋放增多，從而促使肝細(xì)胞發(fā)生炎癥壞死等［5］。該研究旨在探究炎性細(xì)胞因子IL-1β、IL-18、TNF-α在大鼠NAFLD發(fā)展過程中的作用。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 健康清潔級雄性SD大鼠24只，購自安徽醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心，約6周齡，體重140～180 g。

1.1.2主要試劑 ELISA試劑盒購自上海源葉生物技術(shù)有限公司；戊二醛溶液購自美國SPI公司。

1.1.3儀器 日立-7600型生化儀（瑞士Roche公司）；μQuant酶標(biāo)儀（美國Bio-Tek公司）；Universal 320/320 R型低溫高速離心機(jī)（德國Hettich公司）；LeicaRMZ135型石蠟切片機(jī)（德國徠卡公司）；Olympus BX53顯微鏡（日本Olympus公司）；JEM-1230型透射電鏡（日本JEOL公司）；電動(dòng)恒溫箱（上海三發(fā)公司）等。

1.2 方法

1.2.1動(dòng)物分組及造模 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物經(jīng)普通飼料適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后將SD大鼠隨機(jī)分為對照組12只和造模組12只。對照組喂食普通飼料，造模組喂食高脂飼料，分別于第4、8周末分批處理各組大鼠6只。高脂飼料：88%普通飼料+10%豬油+2%膽固醇；普通飼料及高脂飼料均由安徽醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供并制備。

1.2.2標(biāo)本采集及處理 大鼠隔夜禁食，次日晨腹腔注射10%水合氯醛，于麻醉后腹主動(dòng)脈取血，常規(guī)制備血清并分裝后于-80℃保存?zhèn)錅y。迅速取出整塊肝臟后稱取重量即肝濕重，計(jì)算肝指數(shù)（%）=肝濕重（g）/體重（g）×100%。

1.2.3血清指標(biāo)檢測 血清生化指標(biāo)谷丙轉(zhuǎn)氨酶（alanine transaminase，ALT）、谷草轉(zhuǎn)氨酶（aspartate aminotransferase，AST）、總膽固醇（total cholesterol，TC）、三酰甘油（triglyceride，TG）、高密度脂蛋白膽固醇（high density lipoprotein cholesterol，HDL-C）均使用全自動(dòng)生化分析儀檢測；血清炎性細(xì)胞因子白細(xì)胞介素1β（interleukin-1β，IL-1β）、白細(xì)胞介素18（interleukin-18，IL-18）、腫瘤壞死因子α（tumor necrosis factor-alpha，TNF-α）均使用ELISA試劑盒測定，步驟嚴(yán)格按照其說明書操作。用酶標(biāo)儀在450 nm波長下讀取各吸光度值，并根據(jù)所繪制的標(biāo)準(zhǔn)曲線來計(jì)算出相應(yīng)的濃度值。

1.2.4肝臟病理學(xué)觀察 于肝右葉同一部位取組織1塊，10%甲醛固定，石蠟包埋，切片，HE染色，光鏡下觀察。在肝左葉同一部位取1塊1 mm3肝組織，用4℃2.5%戊二醛溶液固定，環(huán)氧樹脂包埋，切超薄片，枸櫞酸鉛染色，電鏡下觀察肝細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)變化，是由安徽省立醫(yī)院病理科專業(yè)人士操作。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用SPSS 16.0軟件進(jìn)行分析，計(jì)量數(shù)據(jù)以-x±s表示。兩組間計(jì)量數(shù)據(jù)比較采用t檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 一般情況的比較8周時(shí)，對照組的肝臟形態(tài)正常，顏色鮮紅，質(zhì)地柔軟，表面光滑，邊緣銳利；造模組的肝臟體積明顯增大，重量也較對照組重，顏色發(fā)白，肝臟切面油膩。第4、8周造模組的大鼠體重、肝濕重及肝指數(shù)均較同期的對照組顯著增高（P＜0.01）。同組間比較，對照組和造模組第8周的體重、肝濕重均較第4周增加明顯，且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。見表1。

2.2 血清生化指標(biāo)的比較造模組與同期對照組比較，血清ALT、AST、TC、TG水平升高，且第8周時(shí)顯著升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。造模組HDL-C水平明顯低于同期對照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。而同組間比較，對照組和造模組第8組ALT、AST、TC、TG均較第4周升高，HDL-C降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見表2。

2.3 血清IL-1β、IL-18、TNF-α濃度的比較與同期對照組比較，造模組血清IL-1β、IL-18、TNF-α濃度升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。而同組間比較，對照組和造模組第8周血清IL-1β、IL-18、TNF-α濃度均較第4周升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見表3。

2.4 肝臟組織病理學(xué)結(jié)果光鏡下HE染色顯示，對照組的肝小葉結(jié)構(gòu)清晰完整，肝細(xì)胞未見脂肪變性，細(xì)胞中央可見細(xì)胞核；造模組第4周肝細(xì)胞廣泛腫脹，肝索排列疏松，肝小葉結(jié)構(gòu)不清，部分動(dòng)物的肝細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)可見少數(shù)大小不等的脂滴，呈現(xiàn)灶脂變或輕度脂變；造模組第8周全部大鼠肝組織均呈現(xiàn)輕-中度脂肪變性，肝細(xì)胞體積明顯增大，胞質(zhì)疏松，內(nèi)含大小不等的脂滴空泡，尚未見炎性細(xì)胞浸潤、壞死灶。見圖1。透射電鏡下可見，對照組肝細(xì)胞核周隙正常，線粒體豐富且形態(tài)正常，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)排列整齊，細(xì)胞質(zhì)內(nèi)未見脂滴；造模組第4周肝細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)排列整齊，線粒體增大但結(jié)構(gòu)尚完整，胞質(zhì)內(nèi)可見少量脂滴；造模組第8周細(xì)胞體積明顯增大，肝細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)形態(tài)尚正常，線粒體明顯腫脹，少數(shù)線粒體嵴消失，胞質(zhì)內(nèi)有多數(shù)脂滴。見圖2。

3 討論

隨著人們生活水平的提高和飲食習(xí)慣的改變，NAFLD已逐漸發(fā)展成為慢性肝病的首位病因，并且其發(fā)病率呈逐年上升的趨勢，表明NAFLD的防治已經(jīng)成為當(dāng)前研究的重要課題。當(dāng)今人們飲食攝入中的脂肪含量不斷增加，而脂肪便是飲食中能量最高的營養(yǎng)物質(zhì)，能量攝入過多是導(dǎo)致脂肪肝、IR等發(fā)生率不斷上升的重要因素［6］。脂肪攝入過多可導(dǎo)致三酰甘油在肝細(xì)胞內(nèi)聚集，從而引起脂肪變性。而脂肪過量堆積會引起血清游離脂肪酸增多，對肝細(xì)胞和胰島有“脂毒性”作用，而產(chǎn)生IR［7］。從本研究結(jié)果來看，造模組大鼠的體重、肝濕重明顯高于同期對照組，造模組ALT、AST、TC、TG較同期對照組明顯升高，HDL-C明顯降低。肝臟HE染色和電鏡結(jié)果均表明造模組的肝組織有一定的脂質(zhì)沉積。表明長期的高脂飲食可誘發(fā)肝臟的脂肪變性。而同組間比較，對照組和造模組第8周的大鼠體重、肝濕重及生化指標(biāo)ALT、AST、TC、TG均較第4周高，HDLC明顯降低。并且造模組各項(xiàng)指標(biāo)升高和降低的幅度明顯大于對照組，說明高脂飲食可加快肝臟脂肪變性的速度。

NAFLD的發(fā)病機(jī)制比較復(fù)雜，IR是其中心環(huán)節(jié)，而細(xì)胞因子的異常在其發(fā)病過程中起著重要作用。IL-18作為重要的前炎癥細(xì)胞因子參與炎癥反應(yīng)，在炎癥反應(yīng)過程中起著關(guān)鍵作用。IL-18是T細(xì)胞介導(dǎo)肝損傷的必須媒介，IL-18在肝臟中除了由庫普弗細(xì)胞表達(dá)外，還可以由損傷的肝細(xì)胞合成［8］。由于IL-18在分泌γ-干擾素的同時(shí)也產(chǎn)生了很多的TNF-α、IL-8等炎性細(xì)胞因子從而加劇了代謝紊亂及免疫功能損傷，此外，IL-18還促進(jìn)T淋巴細(xì)胞的增殖和分化，而直接介導(dǎo)肝細(xì)胞的損傷［9-10］。Vecchie et al［11］發(fā)現(xiàn)NAFLD患者與正常人比較，血漿IL-18水平升高，提示IL-18可能是脂肪變性損害和肝臟炎癥中的一個(gè)重要發(fā)病因素。與本研究中造模組IL-18水平較對照組顯著升高相符合。肝臟也是TNF-α重要的靶器官，TNF-α是介導(dǎo)肝臟損傷的重要炎癥因子，在機(jī)體免疫損傷中發(fā)揮著細(xì)胞毒作用［12］。TNF-α可以刺激脂肪細(xì)胞分泌瘦素引起IR，還可以和肝細(xì)胞上的TNF-α受體作用而影響肝臟脂肪代謝，抑制胰島素受體酪氨酸激酶活性，而致IR加重［13］。此外，TNF-α可減弱線粒體的呼吸功能，導(dǎo)致線粒體跨膜電位降低及其內(nèi)外膜間的通透轉(zhuǎn)換孔道開放，而加強(qiáng)線粒體氧化活性物質(zhì)和過氧化脂質(zhì)的形成［10］。庫普弗細(xì)胞還可產(chǎn)生IL-1β而加劇肝臟炎癥及脂肪變性，因IL-1β促進(jìn)胰島β細(xì)胞的一氧化氮生成和細(xì)胞凋亡而導(dǎo)致胰島β細(xì)胞選擇性的破壞，從而進(jìn)一步誘導(dǎo)胰島素抵抗［14-15］。本研究中，造模組中IL-18、TNF-α、IL-1β的水平都隨著高脂飲食引起肝臟病理表現(xiàn)的加重而升高，提示IL-18、TNF-α、IL-1β可作為肝細(xì)胞受損的標(biāo)志因子。

綜上所述，高脂飲食喂養(yǎng)大鼠可致肝功能降低、肝臟脂質(zhì)沉積，說明高脂飲食是NAFLD發(fā)展的危險(xiǎn)膳食因素。IL-18、TNF-α、IL-1β在NAFLD發(fā)病中起著重要的作用，通過血清IL-18、TNF-α、IL-1β濃度的變化，結(jié)合肝臟病理變化，可以反映肝臟損傷的嚴(yán)重程度，對判斷NAFLD的發(fā)展及預(yù)后有一定的意義。

［1］ Alkhouri N，Tamimi T A，Yerian L，et al.The inflamed liver and atherosclerosis：a link between histologic severity of nonalcoholic fatty liver disease and increased cardiovascular risk［J］.Dig Dis sci，2010，55（9）：2644-50.

［2］ Te Sligte K，Bourass I，Sels JP，et al.Non-alcoholic steatohepatitis：review of a growing medical problem［J］.Eur J Intern Med，2004，15（1）：10-21.

［3］ 王素琴，黃 緣.非酒精性脂肪肝病的研究進(jìn)展［J］.世界華人消化雜志，2014，23：3410-5.

［4］ Day C P.Non-alcoholic fatty liver disease：amassive problem［J］. Clin Med，2011，11（2）：176-8.

［5］ 張羽萍，華 靜.庫普弗細(xì)胞在非酒精性脂肪性肝病中的作用［J］.國際消化病雜志，2008，28（4）：315-7.

［6］ Bertolotti M，Lonardo A，Mussi C，et al.Nonalcoholic fatty liver disease and aging：epidemiology tomanagement［J］.World JGastroenterol，2014，20（39）：14185-204.

［7］ Shih C M，Wu JS，Ko W C，et al.Mitochondria-mediated caspaseindependent apoptosis induced by cadmium in normal human lung cells［J］.JCell Biochem，2003，89（2）：335-47.

［8］ 李 嵐，劉慧霞，賀 丹，等.IL-18對大鼠非酒精性脂肪肝病形成的作用［J］.世界華人消化雜志，2009，17（17）：1764-7.

［9］ 周冬生，劉博峰.細(xì)胞因子與非酒精性脂肪肝關(guān)系的研究進(jìn)展［J］.華夏醫(yī)學(xué)，2014，27（4）：128-31.

［10］程 勇，趙亞敏，蘇 劍，等.非酒精性脂肪性肝病患者血清白介素-18、白介素-8、腫瘤壞死因子-α水平變化的臨床意義［J］.醫(yī)學(xué)研究與教育，2009，26（3）：18-20.

［11］Vecchiet J，F(xiàn)alasca K，Cacciatore P，et al.Association between plasma interleukin-18 levels and liver injury in chronic hepatitis C virus infection and non-alcoholic fatty liver disease［J］.Ann Clin Lab Sci，2005，35（4）：415-22.

［12］魏永杰.細(xì)胞因子在非酒精性脂肪性肝炎發(fā)病機(jī)制中的作用［J］.國際消化病雜志，2006，26（1）：14-6.

［13］陳春蓮.脂肪因子與非酒精性脂肪肝的研究進(jìn)展［J］.華夏醫(yī)學(xué)，2012，25（6）：927-30.

［14］Miura K，Kodama Y，Inokuchi S，et al.Toll-like receptor9 promotes steatohepatitis by induction of interleukin-1βin mice［J］.Gastroenterology，2010，139（1）：323-34.

［15］陳艷麗，張寶，管石俠，等.IL-18、IL-1β水平與非酒精性脂肪性肝病的關(guān)系［J］.安徽醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，2015，50（2）：181-4.

The changes of IL-1β，IL-18 and TNF-αlevels in NAFLD rats

Li Fenglin，Zhang Bao，Guan Shixia，et al
（Dept of Clinical Nutriology，The First Affiliated Hospital of Anhui Medical University，Hefei 230022）

ObjectiveTo study the changes and significance of serum inflammatory factors interleukin-1β（IL-1β），interleukin-18（IL-18）and tumor necrosis factor-alpha（TNF-α）levels in non-alcoholic fatty liver disease（NAFLD）rats.MethodsTwenty-fourmale SD rats were randomly divided intomodel group and control group. Themodel group（12 rats）were fed with a high-fat diet，and the control group（12 rats）were fed with normal diet. After feeding for 4 and 8 weeks，6 rats were randomly selected to be killed from each group.The serum alanine transaminase（ALT），aspartate aminotransferase（AST），total cholesterol（TC），triglyceride（TG）and high density lipoprotein cholesterol（HDL-C）weremeasured with biochemicalmethod.ELISA was used to test the levels of IL-1β，IL-18 and TNF-α.The liver pathological changeswere observed under lightmicroscopy and transmission electron microscope.ResultsThe level of weight，liver-wetweight and liver index of ratswere significantly higher in themodel group than the concurrent control group in 4th or 8th week（P＜0.01）.The levels of ALT，AST，TC，TG were significantly higher and HDL-Cwas significantly lower in themodel group than the concurrent control group in 4 or 8 week（P＜0.05）.The level of IL-1β，IL-18 and TNF-αwere significantly higher in the model group than the concurrent control group in 4th or 8th week（P＜0.05）.HE staining showed mild-to-moderate hepatic steatosis in themodel group.Under transmission electron microscope showed lipid droplets in different number.ConclusionThe NAFLD ratsmodel is established successfully by feeding high-fat diet for 8 weeks.IL-1β，IL-18 and TNF-αare symbolic inflammatory factors of hepatocyte damage，andmay play important roles in the progress of hepatic steatosis.

non-alcoholic fatty liver disease；high-fat diet；interleukin-1β；interleukin-18；tumor necrosis factoralpha

R 589.2

A

1000-1492（2016）03-0351-04

時(shí)間：2016/1/28 14：23：10 網(wǎng)絡(luò)出版地址：http：//www.cnki.net/kcms/detail/34.1065.R.20160128.1423.018.html

2015-12-08接收

安徽省年度科研項(xiàng)目（編號：1301043019）

安徽醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院臨床營養(yǎng)科，合肥 230022

李楓林，女，碩士研究生；

蔣建華，女，主任醫(yī)師，副教授，碩士生導(dǎo)師，責(zé)任作者，E-mail：Jjhua@yeah.net