于 蕊，劉紅霞，孫世杰，王惠國，李文哲

B細(xì)胞受體核心巖藻糖基化調(diào)節(jié)成熟B細(xì)胞的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)

于 蕊1，劉紅霞2，孫世杰2，王惠國1，李文哲2

目的探討核心巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶（Fut8）對成熟B細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的影響。方法利用Fut8-siRNA逆轉(zhuǎn)錄病毒載體建立Fut8基因沉默成熟B細(xì)胞株（3-83-KD細(xì)胞），并將PLHCX-Fut8質(zhì)粒導(dǎo)入3-83-KD細(xì)胞建立Fut8基因恢復(fù)成熟B細(xì)胞株（3-83-KD-Re）。用Real time-PCR、Western blot和HPLC法檢測Fut8 mRNA、蛋白表達(dá)和Fut8酶活性，流式細(xì)胞儀和凝集素免疫印跡檢測BCR的表達(dá)量和核心巖藻糖基化水平，Western blot技術(shù)檢測細(xì)胞內(nèi)酪氨酸磷酸化水平。結(jié)果與3-83細(xì)胞相比，3-83-KD細(xì)胞的BCR核心巖藻糖基化水平明顯下降，而3-83-KD-Re細(xì)胞其表達(dá)得到恢復(fù)。Fut8基因沉默使3-83-KD細(xì)胞BCR介導(dǎo)的信號傳導(dǎo)明顯減弱，而3-83-KD-Re細(xì)胞的信號傳導(dǎo)恢復(fù)正常。結(jié)論Fut8修飾的核心巖藻糖基化在BCR介導(dǎo)的細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)過程中發(fā)揮重要的調(diào)節(jié)作用。

核心巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶；siRNA；B細(xì)胞受體；信號轉(zhuǎn)導(dǎo)

成熟B細(xì)胞的抗原識別及B細(xì)胞受體（B cell receptor，BCR）介導(dǎo)的細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)是體液免疫應(yīng)答調(diào)節(jié)的重要組成部分［1］。質(zhì)譜分析表明IgG-BCR分子是富含有核心巖藻糖基的糖蛋白［2］，核心巖藻糖基修飾對IgG-BCR的生物活性具有重要的調(diào)節(jié)作用。但目前核心巖藻糖基化對IgG-BCR介導(dǎo)的信號傳導(dǎo)尚不清楚。核心巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶（α-1，6-fucosyltransferase，F(xiàn)ut8）是催化核心巖藻糖修飾的唯一的糖基轉(zhuǎn)移酶，是以GDP-巖藻糖為活化的糖基供體，以α-1，6糖苷鍵的形式把巖藻糖移交到N-糖鏈還原末端的乙酰葡糖胺，形成核心巖藻糖基［3］。研究［4-6］顯示Fut8在B細(xì)胞的分化發(fā)育中發(fā)揮重要的調(diào)節(jié)作用。該實驗以成熟B細(xì)胞株即3-83細(xì)胞，該細(xì)胞為BCR轉(zhuǎn)基因模型，在p31刺激下，表達(dá)IgG2a-BCR［7］）為研究對象，通過RT-PCR、實時定量PCR、Western blot、流式細(xì)胞術(shù)等，研究Fut8對成熟B細(xì)胞活化過程的調(diào)節(jié)作用。

1 材料與方法

1.1 材料逆轉(zhuǎn)錄病毒載體PSINsi-hU6、PLHCXFut8-mutant cDNA質(zhì)粒為本實驗室保存；3-83細(xì)胞株購自美國ATCC公司；逆轉(zhuǎn)錄酶、dNTP mixture、RNase抑制劑、DNA連接試劑盒、Ex Taq酶、質(zhì)粒提取試劑盒購于大連TaKaRa公司實驗室常規(guī)試劑購于上海生工公司；G418購自美國AMRESCO公司；Anti-mouse IgG2a等一抗購自美國Sigma公司；辣根過氧化物酶標(biāo)記山羊抗小鼠IgG購自江蘇碧云天公司；生物素標(biāo)記-AOL購自日本TCI；抗GAPDH（FL-355）抗體購自美國Santa Cruz（sc-25778）；生物素標(biāo)記p31由北京中科亞光公司合成；膜蛋白提取試劑盒（BSP049）購自上海生工生物公司。

1.2 細(xì)胞模型的制備篩選出最佳的Fut8 siRNA序列，siRNA-sense：5′-GATCCTCTCAGAATTGGCGCTATGT-TCAAGAGACATAGCGCCAATTCTGAGACTTTTTTAT-3′；siRNA-antisense：5′-CGATAAAAAAGGTATCGCGGTTAA-GACTCTTCTCTTGAAAGAGTCTTAACCGCGATACCG-3′，該序列位于小鼠Fut8基因（NM_016893）的1386～1404位。Fut8基因沉默細(xì)胞（3-83-KD）模建立：準(zhǔn)備階段：5×105個3-83細(xì)胞置于6孔板內(nèi)，37℃培養(yǎng)。感染階段：利用聚凝胺處理細(xì)胞后，加入含F(xiàn)ut8-siRNA的逆轉(zhuǎn)錄病毒液，37℃，CO2培養(yǎng)箱中孵育6 h，再追加1ml培養(yǎng)液到6孔板中過夜培養(yǎng)。G418篩選階段：加入G418（400μg/ml）的培養(yǎng)液，每2 d更換一次G418的培養(yǎng)液，兩周后挑選單個克隆置于96孔板中培養(yǎng)擴大培養(yǎng)，獲得穩(wěn)定遺傳的沉默細(xì)胞模型命名為3-83-KD。Fut8恢復(fù)細(xì)胞（3-83-KD-Re）模型建立：準(zhǔn)備階段：5×1053-83-KD細(xì)胞置于6孔板內(nèi)，37℃培養(yǎng)。轉(zhuǎn)染階段：將梭華-Sofast和Fut8-pLHCX質(zhì)粒按一定比例混合，并轉(zhuǎn)染至3-83-KD細(xì)胞，37℃孵育6 h，然后再加入1ml含20%血清的DEME培養(yǎng)液，37℃，CO2培養(yǎng)箱中孵育24～48 h。篩選階段：加入潮霉素（200μg/ml）于培養(yǎng)液中，每隔3 d換一次含潮霉素的培養(yǎng)液，2周后挑取單個克隆細(xì)胞進(jìn)行擴大培養(yǎng)，獲得穩(wěn)定遺傳的具有潮霉素抗性的Fut8基因恢復(fù)細(xì)胞株，命名為3-83-KD-Re。

1.3 實時定量PCR按TRIzol RNA提取試劑盒的操作說明提取細(xì)胞總RNA。以O(shè)ligo（dT）為起始引物，按照反轉(zhuǎn)錄說明書操作進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。PCR程序：變性：94℃3 min，退火：93℃10 s，60℃20 s，72℃1 min 35個循環(huán)，延伸：72℃10 min。引物序列為：5-AACAGCTTGTTAAGGCCAA AG-3 and 5-GCATGTCTTTGGAGTTCATTTC-3（Fut8）（NM_016893）；5-GCAAGAGCTACAGCATGAGAG-3 and 5-TGCCGCCAGCGAAGAGACGCT-3（Fut4）（NM_ 010242）；5-TCAAGCCATCAACATCAAC-3 and 5-GTGGCGGATGTACTCGAAGG-3（GnT III）（NM_010795）；5-CAGCGCCAGCAACTCGACTA-3 and 5-TCGATTGAA CATGGTGTCTCCAG-3（β4GalT-Ⅰ）（NM_022305）；5-AAATGGTGAAGGTCGGTGTG-3 and 5-TGAAGGGGT CGTTGATGG-3（GAPDH）（NM_001001303）。

1.4 高效液相色譜（HPLC）檢測酶活性底物為PABA［4-（2-pyridylamino）butylamine］標(biāo)記的GnGnbi-Asn-PABA（S）。通過HPLC對其產(chǎn)物（GnGnFucbi-Asn-PABA）（P）進(jìn)行分析，F(xiàn)ut8酶活性［pmol/（h ·mg）］按照公式［P（pmol）/反應(yīng)時間（h）蛋白含量（mg）］來計算。

1.5 流式細(xì)胞術(shù)分析細(xì)胞表面BCR的表達(dá)首先利用BSA-抗-CD16/CD32（2.4G2）抗體混合液對細(xì)胞表面的Fc受體進(jìn)行封閉，然后加入熒光標(biāo)記抗體在冰上反應(yīng)15 min。利用流式細(xì)胞儀（FACSCalibur）進(jìn)行分析。

1.6 免疫沉淀（immunoprecipitation，IP）純化膜蛋白根據(jù)膜蛋白提取試劑盒提取膜蛋白，測定蛋白濃度后取蛋白（約500μg）與抗-IgG2a以及G-Sepharose充分混勻4℃搖晃過夜，之后用PBS洗兩次，加無變性劑loading buffer 100℃煮5 min待用。

1.7 Westernblot和lectinblot法分析細(xì)胞內(nèi)蛋白的表達(dá)按標(biāo)準(zhǔn)方法進(jìn)行SDS-PAGE，將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，用含5%BSA封閉2 h后，加入合適的一抗或生物素標(biāo)記-AOL（米曲霉素，特異性識別核心巖藻糖基），搖床過夜，洗膜后加入二抗，孵育1 h，洗膜后ECL顯色并掃描。

2 結(jié)果

2.1 3-83-KD細(xì)胞及3-83-KD-Re細(xì)胞特性利用含F(xiàn)ut8-siRNA的重組逆轉(zhuǎn)錄病毒及Fut8-pLHCX質(zhì)粒，建立3-83-KD細(xì)胞及3-83-KD-Re細(xì)胞。RTPCR結(jié)果顯示，與正常3-83細(xì)胞相比，3-83-KD細(xì)胞中Fut8 mRNA的表達(dá)量明顯減少（圖1A），而在3-83-KD-Re細(xì)胞中其表達(dá)得到恢復(fù)。實時定量PCR結(jié)果也顯示，38-3-KD細(xì)胞的Fut8 mRNA表達(dá)量小于3-83細(xì)胞的5%（圖1B），但Fut4，GnTⅢ和β4GalT-I等其它糖基轉(zhuǎn)移酶的表達(dá)量并沒有明顯的變化（圖1B）。Western blot實驗結(jié)果進(jìn)一步顯示，與正常3-83細(xì)胞相比，F(xiàn)ut8蛋白含量明顯減少（圖1C），而在3-83-KD-Re細(xì)胞中得到恢復(fù)。此外，通過HPLC技術(shù)檢測了Fut8的酶活性，結(jié)果顯示3-83細(xì)胞和3-83-KD-Re細(xì)胞在20 min處出現(xiàn)特異性Fut8酶產(chǎn)物，而3-83-KD細(xì)胞在20 min處并沒有出現(xiàn)特異性Fut8酶產(chǎn)物（圖1D）。

2.2 細(xì)胞表面的IgG-BCR是核心巖藻糖基化糖蛋白BCR介導(dǎo)的信號是B細(xì)胞活化、增殖和分化的關(guān)鍵。流式細(xì)胞術(shù)檢測結(jié)果顯示，3-83、3-83-KD、3-83-KD-Re細(xì)胞之間IgG2a-BCR的表達(dá)量沒有明顯的差別（圖2A）。但是Lectin blot結(jié)果表明3-83-KD細(xì)胞中IgG2a-BCR的核心巖藻糖基化修飾缺失，在3-83-KD-Re細(xì)胞中又得到恢復(fù)（圖2B）。

2.3 核心巖藻糖基化修飾影響B(tài)CR介導(dǎo)的下游信號分子磷酸化BCR復(fù)合物是由識別抗原的膜表面免疫球蛋白（the membrane surface immunoglobulin，m Ig）與傳遞抗原刺激信號的CD79a/CD79b（cluster of differentiation，CD）異源二聚體所組成。BCR與特異性抗原表位結(jié)合后，由CD79a和CD79b把此激活信號轉(zhuǎn)入細(xì)胞內(nèi)，并通過Fyn、Lyn、Syk、Vav、PLCγ2及鈣離子流出，激活B細(xì)胞［8］。3-83細(xì)胞表面的BCR特異性識別p31抗原肽（HDWRSGFGGFQHLCC）。為了更進(jìn)一步確認(rèn)核心巖藻糖基修飾對BCR介導(dǎo)的細(xì)胞信號傳導(dǎo)的影響，用p31作用不同種類的3-83細(xì)胞，檢測細(xì)胞內(nèi)信號分子的酪氨酸磷酸化情況。用p31（0.1μg/ml）處理后，與正常的3-83細(xì)胞相比，3-83-KD細(xì)胞在5 min和15 min時酪氨酸磷酸化水平明顯的下降，但在3-83-KD-Re細(xì)胞中磷酸化水平又得到恢復(fù)（圖3a）。進(jìn)一步的研究結(jié)果顯示，3-83-KD細(xì)胞中BCR下游信號分子，如CD79a和Syk分子的磷酸化水平明顯下降，而在3-83-KD-Re細(xì)胞中又得到恢復(fù)（圖3b）。

3 討論

BCR介導(dǎo)的信號是B細(xì)胞活化的第一信號，是B細(xì)胞成熟和活化的關(guān)鍵步驟。最新研究［9］表明，糖基化對BCR功能具有重要的影響，如糖基化在維系BCR水溶性和立體構(gòu)象中起重要作用，糖基化程度低下，會使BCR肽鏈缺乏剛性；糖基化過度，會遮住BCR的Ag結(jié)合位點，影響與Ag的結(jié)合。

Fut8是修飾核心巖藻糖基化的唯一的糖基轉(zhuǎn)移酶?；蚯贸∈髮嶒灒?-6］表明Fut8在B細(xì)胞的分化發(fā)育中發(fā)揮重要的調(diào)節(jié)作用。闡明某個基因的功能，目前常用的方法是利用siRNA，抑制該基因表達(dá)，觀察其相應(yīng)功能的丟失；然后細(xì)胞內(nèi)重新導(dǎo)入該基因，建立轉(zhuǎn)基因恢復(fù)模型，觀察其丟失功能的恢復(fù)。與正常3-83細(xì)胞相比，3-83-KD細(xì)胞中Fut8 mRNA明顯減少，而Fut4、GnT-Ⅲ及β4-GalT-ⅠmRNA的表達(dá)量沒有變化，說明復(fù)制缺陷型Fut8-siRNA重組逆轉(zhuǎn)錄病毒（pSINsi-hU6）沒有脫靶現(xiàn)象。將PLHCX-Fut8質(zhì)粒導(dǎo)入3-83-KD細(xì)胞建立Fut8基因恢復(fù)成熟B細(xì)胞株（3-83-KD-Re），發(fā)現(xiàn)在3-83-KD-Re細(xì)胞中Fut8 mRNA、蛋白表達(dá)和Fut8酶活性表達(dá)得到恢復(fù)。IgG-BCR是富含核心巖藻糖基化糖蛋白，也是Fut8的重要的靶蛋白。Fut8基因沉默并沒有影響IgG2a-BCR的表達(dá)量，只是影響了IgG2a-BCR核心巖藻糖基化水平。進(jìn)一步研究表明，核心巖藻糖修飾能夠調(diào)節(jié)IgG-BCR與抗原肽（p31）之間的相互作用。Fut8基因沉默使IgG-BCR介導(dǎo)的信號傳導(dǎo)（p31刺激細(xì)胞）明顯減弱，而3-83-KD-Re細(xì)胞的信號傳導(dǎo)得到恢復(fù)。本實驗結(jié)果提示核心巖藻糖基化修飾在BCR介導(dǎo)的細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)過程中發(fā)揮重要的調(diào)節(jié)作用，為從糖基化角度揭示B細(xì)胞活化規(guī)律提供新的科學(xué)思路。

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Core fucosylation of B cell receptor regulates the signal transduction ofmature B cells

Yu Rui1，Liu Hongxia2，Sun Shijie2，et al
（1College of Life Science and Technology，Dalian University，Dalian 116622；2College of Basic Medical Sciences，Dalian Medical University，Dalian 116044）

ObjectiveTo investigate the role of core fucosyltransferase（Fut8）on the signal transduction via B cell receptor in mature B cells.MethodsFirstly，F(xiàn)ut8 gene knockdown mature B cells（3-83-KD cells）were established by using retroviruses containing Fut8-siRNA，and Fut8 gene restored mature B cells（3-83-KD-Re）were generated by transfections of PLHCX-Fut8 plasmid into 3-83-KD cells.The expressions of Fut8mRNA，protein and enzyme activity were detected by real time PCR，Western blot and HPLC，and the expressions of BCR and core fucosylation levelwere detected by flow cytometry and lectin blot，and intracellular tyrosine phosphorylation levelwas detected by Western blot.ResultsThere were no differences on the expression of IgG2a-BCR in 3-83，3-83-KD，3-83-KD-Re cells，while core fucosylation of IgG2a-BCR was abolished in 3-83-KD cells，and rescued by reintroduction of Fut8，as evidenced by AOL blot.Compared to 3-83 cells，the tyrosine phosphorylation was substantially reduced in 3-83-KD cellswith p31 stimulation，and then completely restored by re-introduction of the Fut8 gene to 3-83-KD cells.ConclusionIn summary，core fucosylationmodified by Fut8 plays an important role in the cellular signal transduction via BCR.

Fut8；siRNA；BCR；signal transduction

R 392.11

A

1000-1492（2016）03-0320-04

時間：2016/1/28 14：23：09 網(wǎng)絡(luò)出版地址：http：//www.cnki.net/kcms/detail/34.1065.R.20160128.1423.004.html

2015-12-08接收

國家自然科學(xué)基金項目（編號：31270864、30972675）

1大連大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院生物學(xué)專業(yè)，大連116622

2大連醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院生物化學(xué)與分子生物學(xué)教研室，大連 116044

于 蕊，女，碩士研究生；

李文哲，男，教授，博士生導(dǎo)師，責(zé)任作者，E-mail：liwenzhe46@hotmail.com

王惠國，女，副教授，碩士生導(dǎo)師，責(zé)任作者，E-mail：wanghuiguo126@126.com