石永康， 白 晶， 王清波

論 著

腫瘤標志物與結(jié)直腸癌術(shù)后XELOX輔助化療療效的相關(guān)性分析

石永康， 白 晶， 王清波

目的 探討腫瘤標志物(CEA、VEGF、IGFBP-3、TGF-β1、TIMP-1、miR-21、miR-126、miR-143、miR-148a、miR-192)在結(jié)直腸癌XELOX輔助化療前后的表達變化及與化療療效的相關(guān)性。方法 收集50例健康志愿者，54例結(jié)直腸癌患者不同時期(術(shù)前、術(shù)后化療前及化療后)血清樣本，運用酶聯(lián)免疫吸附實驗及實時熒光定量PCR法檢測樣本中上述腫瘤標志物的表達，并分析其與化療療效的相關(guān)性。 結(jié)果 XELOX輔助化療后患者血清中CEA、VEGF、IGFBP-3、TGF-β1、TIMP-1蛋白整體水平顯著低于手術(shù)前(P<0.05)，Ⅱ及Ⅲ期患者化療后CEA、VEGF、IGFBP-3、TGF-β1、TIMP-1蛋白水平顯著低于化療前(P<0.05)，Ⅳ期患者化療后僅CEA、TGF-β1、TIMP-1水平顯著下降(P<0.05)；實時熒光定量PCR結(jié)果表明：CEA、IGFBP-3、miR-21及miR-126化療后水平顯著低于術(shù)前(P<0.05)，而與化療前相比，Ⅱ期患者化療后CEA、IGFBP-3、miR-21及miR-126顯著降低(P<0.05)，miR-143顯著性增高(P<0.05)，Ⅲ期患者化療后僅CEA、miR-21及miR-126水平顯著性降低(P<0.05)，其余分子無顯著性變化，Ⅳ期患者化療后與化療前相比，上述腫瘤標志物分子皆無變化。CEA無論在蛋白水平還是mRNA水平的表達變化與療效都具有正相關(guān)性(mRNA水平Ⅳ期患者除外)，IGFBP-3與TGF-β1在蛋白水平的變化與Ⅱ期患者化療療效呈正相關(guān)，TGF-β1與Ⅲ期患者化療療效呈正相關(guān)；在mRNA水平，miR-21和miR-126的變化與Ⅱ及Ⅲ期患者化療療效呈正相關(guān)，其余分子表達變化與療效無相關(guān)性。結(jié)論 腫瘤標志物的表達變化與結(jié)直腸癌不同分期XELOX輔助化療療效具有相關(guān)性。

腫瘤標志物； 結(jié)直腸癌； XELOX； 輔助化療

結(jié)直腸癌(colorectal cancer, CRC)是最常見的惡性腫瘤之一，全球每年新增100萬確診病例，其病死率高達50%左右[1-2]。隨著飲食結(jié)構(gòu)的變化及環(huán)境的影響，我國CRC發(fā)病率有逐年上升的趨勢，死亡率也僅次于肺癌和肝癌[3]。有報道指出，我國多數(shù)CRC患者Ⅰ期手術(shù)根治率及術(shù)后生存率較低，術(shù)后5年生存率約50%，Ⅱ、Ⅲ期患者根治術(shù)后局部復發(fā)率高達20%～40%[4]。目前臨床多采用輔助化療以提高術(shù)后無病生存期和延長總生存期，如何判斷輔助化療的療效，為患者提供有效的化療方案即成為目前的研究重點。近年來Ⅰ型基質(zhì)金屬蛋白酶抑制因子-1(TIMP-1)等腫瘤特異性蛋白、克爾斯滕大鼠肉瘤病毒癌基因同源物(Kras)等DNA標志物，以及癌胚抗原(CEA)、微小RNA21(miR-21)等RNA標志物分別在患者糞便和血漿中相繼被檢出[5]。本研究選取在CRC診斷中敏感性及特異性都較高的靶分子：CEA[6]、血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)[7]、胰島素樣生長因子結(jié)合蛋白3 (IGFBP-3)[8]、轉(zhuǎn)化生長因子β1 (TGF-β1)[9]、TIMP-1[10]、miR-21[11-12]、miR-126[13]、miR-143[14]、miR-148a[15]、miR-192[16]作為研究目標，通過對54例CRC患者和50例健康志愿者血清標本的檢測，對比上述指標在CRC患者術(shù)前、術(shù)后化療前和化療后及與健康對照者之間的表達差異，研究其在CRC患者術(shù)后XELOX輔助化療療效評價中的作用及臨床意義，并進行相關(guān)性分析。

1 資料與方法

1.1 研究對象

選取常州市金壇區(qū)人民醫(yī)院腫瘤科2013年1月至2015年1月收治的54例經(jīng)病理檢查初次確診的CRC患者，其中男30例，女24例；年齡34～79歲，平均年齡56.5歲。依據(jù)美國癌癥聯(lián)合委員會(AJCC)/國際抗癌聯(lián)盟(UICC)2010年第7版標準進行TNM分期，Ⅱ期13例、Ⅲ期26例、Ⅳ期15例。病理確診為腺癌51例，黏液腺癌1例，印戒細胞癌2例。在常規(guī)根治性切除(R0)手術(shù)后，行6周期XELOX方案化療。收集患者術(shù)前、術(shù)后化療前及化療后外周血標本。患者術(shù)前均未做任何放化療。同時，選取健康志愿者50例，其中男28例，女22例；年齡39～80歲，平均年齡59.5歲，同樣收集外周血標本。所有標本采集者均獲得知情同意?；颊呒爸驹刚叩哪挲g、體重、BMI及性別等差異無統(tǒng)計學意義。

1.2 方法

1.2.1 化療方案及療效評估 采用6周期的XELOX方案化療：奧沙利鉑130 mg/m2靜脈滴注(持續(xù)3 h),d1；卡培他濱1 000 mg/m2口服，每日2次，連續(xù)14 d。21 d為1個化療周期。所有患者化療前后檢查血常規(guī)、肝腎功能，化療前常規(guī)給予止吐、營養(yǎng)神經(jīng)等處理。同時依據(jù)實體瘤療效評價標準(RECIST 1.1)進行療效評價及計分，即完全緩解(CR)記4分、部分緩解(PR)記3分、病情穩(wěn)定(SD)記2分、病情進展(PD)記1分。所得記分與化療前后血清腫瘤標志物表達變化進行Pearson相關(guān)性分析。

1.2.2 血清RNA抽提 在400 μl的血清樣本中加入800 μl的Trizol(Invitrogen, 美國)，混勻，加入氯仿200 μl，劇烈震蕩20 s，冰上靜置15 min，離心15 min(4 ℃)，將上層水相溶液轉(zhuǎn)移至新的無RNAase的離心管中，后續(xù)操作按照miRcute miRNA提取分離試劑盒(天根，北京)的具體步驟進行miRNA抽提。抽提后的RNA置于-80 ℃保存，用于后續(xù)實驗。

1.2.3 逆轉(zhuǎn)錄及Real-time PCR 用Taqman miRNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(TAKARA,日本)和miRNA特異性莖環(huán)結(jié)構(gòu)(stem-loop)逆轉(zhuǎn)錄引物(生物工程股份有限公司，上海)進行miRNA逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。Real-time PCR每個反應(yīng)體系為10 μl，包括2 μl稀釋后的cDNA、0.5 μl 20×miRNA檢測探針、5μl 2×基因表達MasterMix、0.5 μl引物，2 μl雙蒸水。每個miRNA檢測配置三平行所需的體系，使用ABIPrism 7900熒光定量PCR儀。PCR的反應(yīng)條件：95 ℃ 5 min后95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，進行45個循環(huán)。檢測的miRNA和內(nèi)參U6在同一塊384孔板上進行定量檢測。原始數(shù)據(jù)用SDS 2.5軟件進行初步分析。

1.2.4 酶聯(lián)免疫吸附試驗 將搜集的血清樣本置于冰上溶解后，參照酶聯(lián)免疫吸附試驗(Elisa)試劑盒(R&D，美國)具體實驗步驟檢測血清樣本中相應(yīng)蛋白分子的表達。酶標儀檢測OD450后計算樣本中蛋白的相對含量。

1.3 統(tǒng)計學方法

應(yīng)用SPSS17.0統(tǒng)計軟件包進行數(shù)據(jù)分析。計量資料采用均數(shù)±標準差表示，采用Pearson相關(guān)性分析對血清腫瘤標志物表達變化及化療療效進行相關(guān)性分析。P<0.05表示差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 化療前后血清蛋白腫瘤標志物表達的變化

如表1所示，腫瘤標志物CEA、VEGF、IGFBP-3、TGF-β1、TIMP-1這5種蛋白在XELOX化療后表達顯著降低，與化療前及術(shù)前相比差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，但仍然高于健康對照組。依據(jù)TNM分期，我們進一步分析不同分期患者XELOX化療前后上述5種腫瘤標志物的表達變化，如表2所示，與化療前相比，CEA、TGF-β1和TIMP-1在TNM Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ期患者化療后的蛋白水平都顯著性下降(P<0.05)；而VEGF和IGFBP-3僅在Ⅱ和Ⅲ期患者化療后表達下調(diào)(P<0.05)，在Ⅳ期患者的表達與化療前無顯著性差異。

表1 CRC患者XELOX化療前后與健康志愿者及術(shù)前血清腫瘤標志物的比較(蛋白水平)

*：與XELOX化療前及術(shù)前相比，P<0.05。

表2 CRC患者XELOX化療前后不同TNM分期患者血清腫瘤標志物的比較(蛋白水平)

*：TNM各期與各自XELOX化療前相比，P<0.05。

2.2 化療前后血清RNA腫瘤標志物表達的變化

Real-time PCR結(jié)果表明，CEA、IGFBP-3、miR-21及miR-126化療后血清RNA水平顯著低于術(shù)前(P<0.05)(圖1)，其余分子的表達變化化療后與術(shù)前相比差異無統(tǒng)計學意義，且各組分子RNA水平也未恢復至健康對照組水平；與化療前相比，Ⅱ期患者化療后CEA、IGFBP- 3、miR-21及miR-126血清水平顯著降低(P<0.05)，miR-143顯著性增高(P<0.05)，Ⅲ期患者化療后僅CEA、miR-21及miR-126水平顯著性降低(P<0.05)，其余分子無顯著性變化，而Ⅳ期患者化療后與化療前相比，上述腫瘤標志物分子皆無變化(圖2)。

圖1 腫瘤標志物在健康志愿者及CRC患者術(shù)前、術(shù)后XELOX化療前后的表達變化

圖2 不同TNM分期XELOX化療前后腫瘤標志物的表達變化

2.3 腫瘤標志物與XELOX療效的相關(guān)性分析

運用Pearson相關(guān)性分析比較CRC不同分期患者化療前后血清腫瘤標志物的表達變化與療效的相關(guān)性發(fā)現(xiàn)，無論在蛋白水平還是mRNA水平，CEA化療前后的表達變化與不同分期CRC患者化療療效都具有正相關(guān)性(mRNA水平Ⅳ期患者除外)；

IGFBP-3與TGF-β1在蛋白水平化療前后的表達變化與Ⅱ期患者化療療效呈正相關(guān)，此外TGF-β1與Ⅲ期患者化療療效也呈正相關(guān)。在mRNA水平，miR-21和miR-126化療前后的變化與Ⅱ及Ⅲ期患者化療療效呈正相關(guān)，其余分子表達變化與療效無相關(guān)性(表3、4)。

表3 CRC患者XELOX化療前后血清腫瘤標志物與療效相關(guān)性(蛋白水平)

*：P<0.05，血清腫瘤標志物與療效之間有相關(guān)性。

3 討論

腫瘤的發(fā)生、發(fā)展與預后呈現(xiàn)出明顯的個體化特征，然而目前尚缺乏有效的早期診斷、腫瘤分型、病程監(jiān)測、用藥指導及療效評估等個體化診療手段，充分利用現(xiàn)有的科研成果，執(zhí)行個體化醫(yī)療策略，將會有2/3難治性CRC患者獲得治愈的機會[17]。因此，腫瘤標志物的檢測對CRC早期診斷、療效評估以及預測其復發(fā)和轉(zhuǎn)移風險方面都具有重要意義。

表4 CRC患者XELOX化療前后血清腫瘤標志物與療效相關(guān)性(mRNA水平)

*：P<0.05，血清腫瘤標志物與療效之間有相關(guān)性。

我們選取了與CRC診斷及預后具有顯著相關(guān)性的分子，分別檢測其在健康志愿者，CRC患者術(shù)前、術(shù)后XELOX化療前及化療后，以及不同TNM分期的CRC患者血清中的表達，通過觀察其在不同時期的表達變化，評定其與XELOX化療療效的相關(guān)性，從而深入了解這些分子在CRC患者術(shù)后XELOX化療中的指導意義。CEA是CRC常用的血清標志物，其在Duke’s臨床分期各期的表達存在差異，是CRC術(shù)后預后不良的重要評估指標。雖然CEA診斷腫瘤的特異性不強，但連續(xù)檢測CEA可使CRC復發(fā)監(jiān)測的敏感性提升至80%，特異性提升至70%[18]。VEGF與CRC的血管生成、轉(zhuǎn)移和復發(fā)關(guān)系密切，對診斷CRC的敏感性和特異性都高于90%[19]。TGF-β1是個多功能的細胞因子，在細胞生長、分化、凋亡及抗炎中起到重要作用，其功能缺失可導致腫瘤發(fā)生。TGF-β1與CRC患者臨床分期及淋巴轉(zhuǎn)移相關(guān)，可作為預后不良的標志[20]。IGFBP-3是胰島素樣生長因子(IGF)的結(jié)合蛋白，其能夠結(jié)合90%以上的IGF-1和IGF-2。雖然目前由于檢測方法不同導致IGFBP-3在結(jié)腸癌中的表達變化仍有爭議，但其在CRC診斷中具有較高的敏感性(82%)及特異性(72%)[21]。TIMP-1是一個能夠抑制大多數(shù)金屬蛋白酶功能的多功能糖蛋白，雖然有報道指出其在結(jié)直腸腺癌患者血清中并未見升高，但術(shù)前TIMP-1水平可能成為與分型無關(guān)的預后標記物，其61%的診斷敏感性遠遠高于CEA的39%，與CEA聯(lián)合檢測可將診斷敏感性提升至73%[22]。我們檢測了上述5種分子在健康志愿者及CRC患者血清中的蛋白及mRNA表達，結(jié)果表明，與化療前及術(shù)前相比，雖然5種分子的蛋白水平在化療后表達顯著下降，但依據(jù)TNM分期檢測結(jié)果顯示，VEGF和IGFBP-3僅在Ⅱ和Ⅲ期化療后表達下調(diào)，在Ⅳ期患者的表達與化療前無顯著性差異；而在RNA水平，僅CEA、IGFBP-3化療后表達降低。

近些年的研究發(fā)現(xiàn)，miRNA不僅存在于腫瘤組織中，還可穩(wěn)定存在于人類血液中，外周血miRNA 的表達水平足以供臨床檢測使用，我們同樣篩選了5種與CRC化療預后相關(guān)的miRNA分子，通過檢測其在健康對照者及CRC患者血清中的表達，分析其與XELOX化療療效的相關(guān)性。結(jié)果顯示，僅miR-21及miR-126在化療后水平顯著低于術(shù)前，其余差異則無統(tǒng)計學意義；同時結(jié)果也表明，Ⅱ期及Ⅲ期患者化療后miR-21及miR-126血清表達都顯著降低，Ⅱ期患者miR-143表達增高，Ⅳ期患者化療后與化療前相比，上述miRNA腫瘤標志物分子皆無變化。

基于上述研究結(jié)果及相關(guān)性分析，CEA、TGF-β1、miR-21和miR-126在XELOX化療前后的表達變化與XELOX化療療效具有一定的相關(guān)性，這為深入研究其在XELOX化療療效評估的敏感性和特異性方面奠定了研究基礎(chǔ)。

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The correlation analysis of tumor markers with the effect of colorectal cancer with XELOX chemotherapy after surgery

SHIYongkang1,BAIJing1,WANGQingbo2.

(1.DeparmentofOncology,People’sHospitalofJintanDistrict,ChangzhouCity,Changzhou213200China; 2.DepartmentofMedicalOncology,TheSecondHospitalofNanjingAffiliatedtoSoutheastUniversity，Nanjing210003，China)

WANGQingbo,E-mail：wqb3020@sina.com

Objective To investigate the expression of tumor markers (CEA,VEGF,IGFBP-3,TGF-β1,TIMP-1,miR-21,miR-126,miR-143,miR-148a,miR-192) in colorectal cancer with XELOX chemotherapy after surgery, and to detect the correlation between tumor markers and chemotherapy efficacy. Methods Serum samples were collected from 50 healthy volunteers and 54 patients with colorectal cancer at different periods (preoperative, before and after postoperative chemotherapy). The expression of tumor markers of colorectal cancer was detected by enzyme-linked immunosorbent assay (Elisa) and real-time PCR assay, and we analyzed the relationship between the efficacy of chemotherapy and tumor markers. Results Elisa showed the results that CEA,VEGF,IGFBP-3,TGF-β1,TIMP-1 protein level were significantly lower in patients after XELOX chemotherapy than in preoperative patients (P<0.05), CEA,VEGF,IGFBP-3,TGF-β1,TIMP-1 protein level were significantly lower in patients during stage Ⅱ and Ⅲ after XELOX chemotherapy than in pre-chemotherapy patients (P<0.05), CEA,TGF-β1,TIMP-1 protein level were significantly declined in patients with stage Ⅳ according to TNM (P<0.05); real-time PCR detected that the mRNA level of CEA,IGFBP-3,miR-21 and miR-126 was lower in patients after XELOX chemotherapy than in preoperative patients (P<0.05), CEA,IGFBP-3,miR-21and miR-126 mRNA level were significantly lower in patients with stage Ⅱ after XELOX chemotherapy than in pre-chemotherapy patients (P<0.05), and miR-143 was significant higher in patients with stage Ⅱ after XELOX chemotherapy than in pre-chemotherapy patients (P<0.05), CEA、miR-21 and miR-126 were lower in patients with stage Ⅲ after XELOX chemotherapy than in pre-chemotherapy patients (P<0.05), there was no significant change in stage Ⅳ. The expression of CEA at protein and mRNA level have a positive correlation with the chemotherapy efficacy(except patients in stage Ⅳ), IGFBP-3 and TGF-β1 protein level have a positive correlation with chemotherapy efficacy in patients with stage Ⅱ, and TGF-β1 protein level have a positive correlation with chemotherapy efficacy in patients with stage Ⅲ; miR-21 and miR-126 have a positive correlation with chemotherapy efficacy in patients with stage Ⅱ and Ⅲ. Conclusions The expression of tumor markers was associated with the effect of XELOX chemotherapy in different stages of colorectal cancer.

Tumor markers; Colorectal cancer; XELOX; Adjuvant chemotherapy

213200 江蘇 常州，常州市金壇區(qū)人民醫(yī)院 腫瘤科(石永康，白 晶)； 210009 江蘇 南京，東南大學附屬第二醫(yī)院 腫瘤內(nèi)科(王清波)

石永康，男，副主任醫(yī)師，研究方向：胃腸道惡性腫瘤的綜合治療及基礎(chǔ)研究，E-mail: 122415348@qq.com

王清波，男，醫(yī)學博士，副主任醫(yī)師，研究方向：消化道惡性腫瘤的臨床治療及基礎(chǔ)研究，E-mail:wqb3020@sina.com

10.3969/j.issn.1674-4136.2016.06.005

1674-4136(2016)06-0364-06

2016-09-17][本文編輯：李筱蕾]