胡曉莉， 劉雅恬， 王建紅， 何 松， 彭春雷， 張珣磊

論 著

pFOXO1A與胃癌臨床病理特征相關(guān)性研究

胡曉莉， 劉雅恬， 王建紅， 何 松， 彭春雷， 張珣磊

目的 測定FOXO1A絲氨酸-256和絲氨酸-329磷酸化位點(diǎn)在胃癌組織標(biāo)本中的表達(dá)，分析其與胃癌臨床病理特征之間的關(guān)系。方法 采用免疫組化法檢測141例胃腺癌手術(shù)標(biāo)本中FOXO1A絲氨酸-256(s256)和絲氨酸-329(s329)磷酸化位點(diǎn)的表達(dá)，分析其與患者年齡、性別、腫瘤分化程度、神經(jīng)侵犯、臨床分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移之間的關(guān)系。結(jié)果 在胃癌組織中，pFOXO1A s256位點(diǎn)陽性率為97.1%，s329位點(diǎn)陽性率為85.1%。s256與s329位點(diǎn)磷酸化的表達(dá)在4組患者(陰性組、+陽性組、++陽性組及+++陽性組)之間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。且在++及+++陽性組中，s256與s329位點(diǎn)磷酸化的表達(dá)強(qiáng)度呈顯著相關(guān)(r2= 0.272，P<0.05)。s256位點(diǎn)的表達(dá)與腫瘤發(fā)生部位有關(guān)，賁門區(qū)腫瘤患者++～+++陽性率為84.6%(P<0.05)。s329位點(diǎn)的表達(dá)與患者年齡有關(guān)，60歲以上患者s329位點(diǎn)陽性率及表達(dá)強(qiáng)度顯著增高(P<0.05)。結(jié)論 s256及s329位點(diǎn)的磷酸化可能在正常細(xì)胞向惡性細(xì)胞轉(zhuǎn)化的過程中扮演了重要角色。s256磷酸化高表達(dá)有可能在賁門部位腫瘤的形成、發(fā)展中起到重要的作用。s329磷酸化高表達(dá)與患者年齡有關(guān)。

FOXO1A； 絲氨酸-256； 絲氨酸-329； 胃癌； 臨床病理特征

胃癌的發(fā)生發(fā)展是典型的多因素參與、多步驟轉(zhuǎn)化的過程，常常表現(xiàn)為慢性炎癥刺激到不典型增生再到癌變的過程，期間涉及多個(gè)癌基因、抑癌基因的活化及失活。轉(zhuǎn)錄因子是控制基因表達(dá)的蛋白質(zhì)分子,通過靶基因的表達(dá)對機(jī)體的發(fā)育、分化、代謝等起調(diào)節(jié)作用。2000年開始，F(xiàn)ORKHEAD轉(zhuǎn)錄因子正式統(tǒng)一命名[1]。隨著研究的深入，發(fā)現(xiàn)FORKHEAD轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)水平(活性)與人類腫瘤的發(fā)生和發(fā)展存在一定的關(guān)系，尤其是FOXO亞家族。人類FOXO1A蛋白中，含有3個(gè)高度保守的磷酸化位點(diǎn)，分別是蘇氨酸-24，絲氨酸-256和絲氨酸-329，是其區(qū)別于其他叉頭蛋白的重要特征[2]。體外試驗(yàn)及細(xì)胞實(shí)驗(yàn)均表明這3個(gè)位點(diǎn)可以被PKB磷酸化。磷酸化后的FOXO1A 轉(zhuǎn)錄因子轉(zhuǎn)移至胞質(zhì)內(nèi)，阻礙凋亡前靶基因的轉(zhuǎn)錄[3]，導(dǎo)致存在遺傳學(xué)缺陷的細(xì)胞逃脫免疫監(jiān)視，最終導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生。本研究采用免疫組化方法測定FOXO1A磷酸化蛋白在胃癌組織標(biāo)本中的表達(dá)，分析pFOXO1A與患者年齡、性別、腫瘤部位和臨床分期等病理特征之間的相關(guān)性。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 收集2009年12月至2016年1月在南通大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院行胃癌手術(shù)的141例患者，分類統(tǒng)計(jì)患者年齡、性別、腫瘤部位、分化程度、神經(jīng)侵犯、脈管浸潤、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、浸潤深度、UICC分期等臨床資料。

1.2 pFOXO1A的免疫組化檢測 pFOXO1A(s256和s329)抗體購自艾博抗(上海)貿(mào)易有限公司，采用免疫組化SP法分別就FOXO1A的兩個(gè)磷酸化位點(diǎn)(s256和s329)對患者腫瘤組織切片進(jìn)行檢測。pFOXO1A免疫組化染色結(jié)果由兩位經(jīng)驗(yàn)豐富的病理科醫(yī)生單盲獨(dú)立判定，判定結(jié)果一致時(shí)納入研究對象。具體評價(jià)方式如下：胞質(zhì)有粽黃色顆粒沉著為陽性染色；陽性細(xì)胞數(shù)≤10%為陰性，>10%為陽性，+陽性細(xì)胞數(shù)10%～50%，++陽性細(xì)胞數(shù)50%～70%,+++陽性細(xì)胞數(shù)>70%。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 所有數(shù)據(jù)應(yīng)用SPSS 18.0統(tǒng)計(jì)軟件處理,FOXO1As256位點(diǎn)表達(dá)和s329位點(diǎn)表達(dá)陽性率與各臨床資料參數(shù)間的比較采用χ2檢驗(yàn)，P<0.05則認(rèn)為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。兩者表達(dá)一致性檢驗(yàn)采用配對t檢驗(yàn)。兩者表達(dá)強(qiáng)度聯(lián)系采用相關(guān)性分析。P<0.05則認(rèn)為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 胃癌組織中pFOXO1A(s256和s329)的表達(dá) 光鏡下可見，在高分化腺癌中，陽性染色顆粒位于細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)中；在低分化腺癌中，陽性染色主要集中在細(xì)胞質(zhì)中。在141例患者中，pFOXO1A s256位點(diǎn)陽性137例(97.1%)，陰性4例(2.9%)；s329位點(diǎn)陽性120例(85.1%)，陰性21例(14.9%)。其中s256位點(diǎn)+44例，++53例，+++40例；s329位點(diǎn)+60例，++27例，+++33例，s256與s329位點(diǎn)磷酸化的表達(dá)在4組患者(陰性組、+陽性組、++陽性組及+++陽性組)之間有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05，表1)，且在++及+++陽性患者組中，s256與s329位點(diǎn)磷酸化的表達(dá)強(qiáng)度呈顯著正相關(guān)(r2=0.272，P<0.05，圖1)。

表1 胃癌組織中pFOXO1As256及s329位點(diǎn)的表達(dá)

注：s256和s329位點(diǎn)磷酸化的表達(dá)在4組患者中的比較(陰性組、+陽性組、++陽性組及+++陽性組)，P<0.05。

圖1 47例++～+++陽性患者 s256和s329位點(diǎn)磷酸化表達(dá)強(qiáng)度的相關(guān)性

2.2 胃癌組織中FOXO1As256及s329位點(diǎn)的表達(dá)與臨床病理特征的相關(guān)性免疫組化 結(jié)果表明，在胃癌組織中pFOXO1A的表達(dá)與患者性別、腫瘤浸潤深度、分化程度、臨床分期和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移均無關(guān)。其中，s256位點(diǎn)的表達(dá)與腫瘤發(fā)生部位有關(guān)，與胃體、胃竇區(qū)相比，賁門區(qū)腫瘤++～+++陽性66例(84.6%,P<0.05，表2)。s329位點(diǎn)的表達(dá)與患者年齡有關(guān)，60歲以上患者s329位點(diǎn)陽性率及表達(dá)強(qiáng)度顯著增高(P<0.05，表2)。

表2 胃癌組織中FOXO1As256及s329位點(diǎn)的表達(dá) 與臨床病理參數(shù)的關(guān)系(n=141)

3 討論

1989年，人們在果蠅中發(fā)現(xiàn)了第一個(gè)FORKHEAD轉(zhuǎn)錄因子,目前這一轉(zhuǎn)錄因子在人類細(xì)胞中已有17個(gè)亞家族(FOXA～Q)，F(xiàn)OXO屬于其中之一，具有FOX結(jié)構(gòu)域[4]。研究表明，F(xiàn)OXO轉(zhuǎn)錄因子的活性受到多方面調(diào)節(jié),有基因表達(dá)水平、翻譯后修飾、蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性、蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用等[5]。其中磷酸化/去磷酸化和乙?；?去乙?；揎椏梢哉{(diào)節(jié)FOXO蛋白分子的亞細(xì)胞定位以及轉(zhuǎn)錄活性。磷酸化/去磷酸化的改變可以實(shí)現(xiàn)FOXO蛋白的亞細(xì)胞定位，磷酸化的FOXO蛋白被排出細(xì)胞核外,從而抑制其轉(zhuǎn)錄活性，這是FOXO轉(zhuǎn)錄活性受到負(fù)性調(diào)節(jié)的主要機(jī)制。同時(shí)，F(xiàn)OXO蛋白磷酸化修飾有多種蛋白激酶的參與,他們主要包括SGK、CK1、AKT/PKB、DYRK1A和Ral等,而且細(xì)胞內(nèi)多種信號途徑可激活這些特異的蛋白激酶[6]。研究還發(fā)現(xiàn)FOXO蛋白分子磷酸化及其亞細(xì)胞定位可導(dǎo)致FOXO蛋白的功能下降，從而促進(jìn)腫瘤的發(fā)生與發(fā)展[7]。絲氨酸-256磷酸化是抑制FKHR轉(zhuǎn)錄激活的重要因素，是蘇氨酸-24/絲氨酸-329磷酸化的前提，在FOXO1A多步驟的磷酸化過程中扮演重要角色[2]。蘇氨酸-24/絲氨酸-329磷酸化是導(dǎo)致FOXO蛋白從細(xì)胞核中移至細(xì)胞質(zhì)的關(guān)鍵原因，同樣從另外一方面調(diào)節(jié)FKHR的功能活性。這些研究表明了FOXO蛋白3個(gè)磷酸化位點(diǎn)的各自作用及相互關(guān)系。

文獻(xiàn)報(bào)道，F(xiàn)OXO磷酸化、亞細(xì)胞定位在許多實(shí)體瘤中被發(fā)現(xiàn)，包括肺癌、肝癌、胃癌、乳腺癌等。深入研究發(fā)現(xiàn)FOXO3A的磷酸化與乳腺癌的低生存率相關(guān)[8]，F(xiàn)OXO1A的磷酸化水平在Ⅳ期非小細(xì)胞肺癌患者中顯著升高[9]。進(jìn)一步研究顯示FOXO直接調(diào)控小窩蛋白-1(caveolin-1)的表達(dá)[10],而小窩蛋白-1與腫瘤的發(fā)生密切相關(guān)[11],其表達(dá)增加了部分原發(fā)性腫瘤如肺腺癌和食管鱗癌的發(fā)生和轉(zhuǎn)移。研究還顯示FOXO可調(diào)控腫瘤壞死因子受體相關(guān)的死亡結(jié)構(gòu)域(TNF receptor-associated death domain，TRADD)靶基因表達(dá)[12],在化療藥物誘導(dǎo)FOXO1A活化的肺腺癌細(xì)胞和纖維肉瘤細(xì)胞中，可導(dǎo)致TRADD表達(dá)下降，使腫瘤細(xì)胞發(fā)生凋亡[13]。Bim屬于Bcl-2家族成員，具有促凋亡活性作用，是FOXO調(diào)控的靶基因，研究發(fā)現(xiàn)FOXO1A、FOXO3A及其靶蛋白Bim在9種乳腺癌細(xì)胞中均有表達(dá)，上調(diào)FOXO3A的表達(dá)方法可以提高Bim mRNA和蛋白質(zhì)水平，直接誘導(dǎo)乳腺癌細(xì)胞凋亡[14]。

Kim等[15]研究首次表明pFOXO1A表達(dá)與胃癌發(fā)生有關(guān)。該研究顯示FOXO1A通過介導(dǎo)細(xì)胞周期停滯促進(jìn)胃癌發(fā)生，同時(shí)發(fā)現(xiàn)pFOXO1A在胃癌的發(fā)生中是早發(fā)、頻發(fā)事件。在胃癌組織中，F(xiàn)OXO1A主要在細(xì)胞質(zhì)中表達(dá)，但在高分化腺癌中細(xì)胞核、細(xì)胞質(zhì)均可被染色，而在正常胃黏膜、低分化腺癌中不表達(dá)或低表達(dá)。在對各項(xiàng)臨床病理指標(biāo)的分析中,pFOXO1A表達(dá)與淋巴結(jié)的轉(zhuǎn)移和浸潤也相關(guān)[15-16],而與患者的年齡、性別、腫瘤部位及是否遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移等尚無確定的關(guān)系。周英姿等[17]報(bào)道FOXO1與胃癌細(xì)胞分化程度相關(guān)，腫瘤分化程度越低FOXO1的表達(dá)也越低。

在本研究中，F(xiàn)OXO1As256位點(diǎn)的磷酸化在整個(gè)樣本中表達(dá)陽性率達(dá)到97.1%，而在s329位點(diǎn)的磷酸化表達(dá)陽性率達(dá)到85.1%，表明這兩個(gè)位點(diǎn)的磷酸化與胃癌可能存在密切關(guān)系。同時(shí)s256磷酸化與s329磷酸化表達(dá)的強(qiáng)度具有相關(guān)性，且s256磷酸化的表達(dá)陽性率高于s329磷酸化的表達(dá)。

在本研究中，賁門部位腫瘤的s256磷酸化高表達(dá)的比例明顯高于其他部位胃癌，表明s256的磷酸化有可能在賁門部位腫瘤的形成、發(fā)展中起重要作用。我們下一步將擴(kuò)大賁門部位胃癌病例的研究，為賁門癌的診斷、個(gè)體化治療提供新的思路。本研究還發(fā)現(xiàn)s329磷酸化在>60歲的患者中發(fā)生的比例更高，提示其表達(dá)可能與年齡有關(guān)。

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Correlation between phosphorylation of FOXO1A and clinicopathological features of gastric

HUXiaoli1，WANGJie2，WANGJianghong1，HESong3，PENGChunlei1，ZHANGXunlei1.

(1.DepartmentofMedicalOncology,NantongUniversityAffiliateTumorHospital,Nantong226361,China；2.DepartmentofScientificResearch，JiangsuCancerHospital,Nanjing210009,China； 3.DepartmentofPathology,NantongUniversityAffiliateTumorHospital,Nantong226361,China)

WANGJianghong,E-mail:wjh-ywk@163.com

Objective To investigate the expression of phosphorylation of Serine 256 and Serine 329 in FOXO1A in gastric cancer tissues, and to analyze the relationship between them and clinicopathological features of gastric cancer.Methods The expressions of phosphorylation of Serine 256 and Serine 329 in FOXO1A in 141 cases of gastric cancer tissues, were detected using immunohistochemistry assay.The relationships between the expression of phosphorylation of Serine 256 and Serine 329 in FOXO1A and age，gender, differentiation, nerve invasion, disease stage, and lymphoid node metastasis were analyzed. Results The positive rate of pFOXO1A s256 was 97.1% in gastric cancer tissues and 85.1% in s329 loci.The expression of s256 and s329 phosphorylation was significantly different between the four groups (negative group,+ positive group,++ positive group and +++ positive group) (P<0.05).And in the ++ and +++ positive groups，there was a significant correlation between s256 and s329 phosphorylation (r2=0.272,P<0.05). The expression of s256 locus was associated with tumor location, and the positive rate of ++～+++ in patients with cardiac cancer was 84.6% (P<0.05). The expression of s329 was correlated with the age of the patients. The positive rate and the expression intensity of s329 were significantly higher in the patients over 60 years old (P<0.05).Conclusions Phosphorylation of Serine 256 and Serine 329 may play an important role in the transition of normal gastric cells to malignant cells. Serine 256 phosphorylation may play an important role in the formation and development of carcinoma of cardia.High phosphorylation of Serine 329 was associated with patient age.

FOXO1A； Serine 256； Serine 329； Gastric carcinoma； Clinicopathological features

國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(81501977)；南通市應(yīng)用研究科技計(jì)劃項(xiàng)目(BK2012071)

226361 江蘇 南通，南通大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院 腫瘤內(nèi)科(胡曉莉,王建紅,彭春雷,張珣磊)； 210009 江蘇 南京，江蘇省腫瘤醫(yī)院 放療科(劉雅恬)； 226361 江蘇 南通，南通大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院 病理科(何 松)

胡曉莉，女，主治醫(yī)師，研究方向：消化道腫瘤的化療，E-mail：happy-hxl@163.com

共同第一作者： 劉雅恬，女，主治醫(yī)師，研究方向：胸腔腫瘤的放射治療，E-mail：10567438@qq.com

王建紅，男，主任醫(yī)師，研究方向：消化道腫瘤的防治，E-mail：wjh-ywk@163.com

10.3969/j.issn.1674-4136.2016.06.003

1674-4136(2016)06-0357-04

2016-06-02][本文編輯：欽 嫣]