王丹丹， 陳 秀， 楊蘇晉， 付 麗， 唐金海

論 著

乳腺浸潤性微乳頭狀癌耐藥機制研究

王丹丹， 陳 秀， 楊蘇晉， 付 麗， 唐金海

目的 探討miRNAs在紫杉醇耐藥的乳腺浸潤性微乳頭狀癌中的影響。方法 收集2011年1月至2014年12月年天津市腫瘤醫(yī)院11例乳腺浸潤性微乳頭狀癌(invasive micropapillary carcinoma，IMPC)患者的組織切片，實時熒光定量PCR法檢測其中miRNAs的表達。采用TargetScan和mi RDB預測miRNAs下游靶基因。結果 根據(jù)前期研究結果篩選出13個耐藥相關的miRNAs，其中與紫杉醇敏感的IMPC相比，miR-744-5p在紫杉類耐藥IMPC中的表達水平升高了(t=-2.650，P=0.029)，差異有統(tǒng)計學意義。通過生物信息學分析預測發(fā)現(xiàn)，miR-744-5p可能通過調(diào)節(jié)CPFS4，Upf1和PP2A等靶基因影響紫杉醇耐藥。結論 miR-744-5p可能參與調(diào)節(jié)IMPC的紫杉醇耐藥，并可能成為其分子標記物。

miRNA； 浸潤性微乳頭狀癌； 紫杉醇； 耐藥

浸潤性微乳頭狀癌(invasive micropapillary carcinoma，IMPC)是2003年WHO在乳腺上皮腫瘤分類中新增的一種類型，是一種少見的乳腺癌類型[1]。IMPC在光鏡下癌巢呈顯著的微乳頭狀，由細網(wǎng)狀的間質分隔開來，且與間質間由空隙分離。IMPC的發(fā)病率低，但對淋巴結侵襲能力強，淋巴結轉移發(fā)生率高，臨床預后差[2]。雖然在手術、化療、放療和內(nèi)分泌等綜合治療下IMPC患者的預后得到了很好的改善，但是仍有一部分患者由于對化療藥的耐藥使疾病進展，且其潛在的耐藥分子機制尚不清楚。

微RNA(microRNA，miRNA)是一類內(nèi)源性的高度保守的非編碼小RNA，其通過與靶基因的3’端非編碼區(qū)域(3’-untranslation region，3’UTR)結合抑制靶基因的表達[3]。近年來，越來越多的研究發(fā)現(xiàn)，miRNAs在腫瘤的增殖、凋亡、耐藥、侵襲和轉移等生物學中發(fā)揮了重要的作用[4-5]。因此，為了進一步探討miRNAs與IMPC耐藥機制間的關系，我們對11例IMPC乳腺癌患者的病理組織進行miRNAs檢測，并對其中潛在的耐藥機制進行研究。

1 資料和方法

1.1 臨床資料 11例石蠟組織切片取自2011年1月至2014年12月天津市腫瘤醫(yī)院乳腺病理科。實驗中涉及到的人乳腺癌組織標本及臨床資料通過天津市腫瘤醫(yī)院倫理委員會批準，并與患者簽署了知情同意書。

1.2 乳腺癌石蠟組織標本 將獲得的乳腺癌組織樣本浸泡在10%福爾馬林溶液中5～10 h，隨后進行脫水和石蠟包埋，最終制成石蠟包埋組織。同時，由兩位病理科主任醫(yī)師利用HE染色切片，在光鏡下劃定出每個樣本中IMPC腫瘤細胞的比例。最后根據(jù)藥敏試驗結果將標本分為藥物敏感組(4例)和藥物不敏感組(7例)。

1.3 主要試劑與儀器 總RNA提取試劑盒購自life公司；逆轉錄、Real-time PCR試劑盒購自日本TaKaRa公司；miRNAs引物合成自南京天為公司；NanoDrop2000紫外分光光度計購自美國Thermo公司；實時熒光定量擴增儀購自美國BIO-RAD公司。

1.4 實時定量PCR法(RT-qPCR)檢測miRNAs表達 按照Ambion石蠟組織總RNA提取試劑盒的說明，首先進行脫蠟步驟，即將3片10 μm厚的FFPE切片浸泡在100%二甲苯中30 min，100%、85%、75%的梯度乙醇中各15 min。其次，根據(jù)HE染色切片的IMPC細胞的范圍進行刮片，以消除其他細胞成分對結果的影響。隨后，經(jīng)過蛋白酶降解、純化、洗脫等步驟后，得到石蠟組織中的總RNA。用NanoDrop2000分光光度計鑒定RNA的質量。對提取出的總RNA按照life加尾法試劑盒進行反轉錄，然后以cDNA為模板，采用SYBR Green PCR試劑盒進行實時熒光定量PCR檢測，每個樣本設置3個復孔，U6作為內(nèi)參基因。miRNAs反轉錄引物序列見表1。以2-ΔΔCt法計算miRNAs的相對表達量。

表1 miRNAs引物序列

1.5 靶基因預測 通過Target Scan(Release 7.0，http://www.targetscan.org)和mi RDB(Version5.0，http://www.mirdb.org)生物信息學在線軟件預測miRNA的靶基因。因為不同的預測軟件采用了不同的預測靶基因的算法，為了增加預測結果的準確性，本研究取兩個軟件得到的靶基因交集。

1.6 統(tǒng)計學方法 使用SPSS 22.0 統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)分析，數(shù)據(jù)以s表示，兩組之間比較用t檢驗，P<0.05提示差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 miRNAs在石蠟組織切片中的表達 本研究根據(jù)實驗室前期研究結果篩選出13個與耐藥相關的miRNAs[6]。RT-qPCR結果證實，與紫杉類敏感的IMPC比，其中miR-744-5p在紫杉類耐藥IMPC中的表達水平升高了(t=-2.650，P=0.029，表2)，差異有統(tǒng)計學意義。

表2 耐藥組與非耐藥組miRNAs表達的差異

2.2 生物信息學軟件分析 通過Target Scan和mi RDB生物學分析，如圖1所示，miR-744-5p存在3個潛在的靶基因，即Cleavage and polyadenylation specificity factor 4 (CPFS4)，Upf1和Protein phosphatase 2A(PP2A)。

圖1 生物信息學分析預測

3 討論

乳腺癌是全球威脅女性健康最常見的惡性腫瘤之一，其發(fā)病率呈逐年上升趨勢[7]?；熓瞧渲饕闹委煼绞街弧Ｗ仙即际侨橄侔┹o助化療的一線藥物，其主要通過影響微管蛋白聚合，使細胞在進行有絲分裂時不能形成紡錘體和紡錘絲，進而抑制了細胞分裂和增殖[8]。IMPC作為乳腺癌的一種特殊類型，其較差的臨床預后，又伴隨著腫瘤細胞產(chǎn)生化療耐藥性，常常導致治療失敗。因此找出紫杉醇耐藥的標志物以及逆轉其耐藥，對于IMPC的治療具有重要的意義。近年來，有研究證實miRNAs參與了腫瘤耐藥的形成[9-10]，這為腫瘤的耐藥機制研究提供了新的思路和啟發(fā)。

研究表明，miR-744-5p的異常表達參與了調(diào)節(jié)鼻咽癌[11]、肺癌[11]和胰腺癌[12]等腫瘤的發(fā)生發(fā)展。但是，在IMPC耐藥中尚未見報道。本研究發(fā)現(xiàn)，在與耐藥相關的13個miRNAs中，miR-744-5p在紫杉醇耐藥的IMPC中顯著上調(diào)，提示其在IMPC對紫杉醇耐藥中起重要作用。進一步對miR-744-5p靶基因進行預測分析發(fā)現(xiàn)，CPFS4，Upf1和PP2A很可能是該miRNA異常表達導致耐藥的關鍵基因。Tang等[13]研究揭示，CBP (CREB-binding protein)通過靶向CPSF4通路調(diào)節(jié)肺癌的發(fā)生。Saul 等[14]證實，Upf1在hnRNPE2/miR-328通路中起到關鍵的作用。Kaur等[15]發(fā)現(xiàn)，Protein phosphatase methylesterase-1 (PME-1) 抑制PP2A的表達改變腫瘤的增殖、侵襲、轉移和耐藥。另外，在多種腫瘤中發(fā)現(xiàn)PME-1還促進MAPK/ERK and AKT等通路。這也為我們后期的IMPC耐藥的研究提供了理論基礎。

本研究發(fā)現(xiàn)，在紫杉醇耐藥的IMPC中，miR-744-5p的表達有顯著差異，其可能與多個靶基因存在密切關系。當然，單個miRNA可能作用于多個靶基因，一個基因也可能受到多個靶基因調(diào)控，因此不能排除有其他miRNAs協(xié)同影響IMPC的耐藥。另外，由于IMPC發(fā)生率低，我們收集的樣本例數(shù)有限，后續(xù)需要繼續(xù)擴大樣本量證實。同時，我們也需要在體內(nèi)、體外實驗中進一步的證實miR-744-5p與其靶基因的相互關系。

總之，本研究首次發(fā)現(xiàn)miR-744-5p與IMPC紫杉醇耐藥的相關性，并找出了其潛在的3個靶基因，即CPFS4，Upf1和PP2A。miR-744-5p可能成為IMPC耐藥的分子標志物，并可能通過抑制其表達逆轉耐藥。但本研究局限于樣本例數(shù)和生物學分析，因此能否將實驗結論應用于臨床有待進一步研究，尤其需要通過開展大規(guī)模、多中心的前瞻性臨床研究來證實。

[1] B?CKER W. WHO classification of breast tumors and tumors of the female genital organs: pathology and genetics[J]. Verh Dtsch Ges Pathol, 2002, 86:116-119.

[2] FU L, IKUO M, FU X Y, et.al. Relationship between biologic behavior and morphologic features of invasive micropapillary carcinoma of the breast[J]. Zhonghua Bing Li Xue Za Zhi, 2004, 33(1):21-25.

[3] BARTEL D P. MicroRNAs: target recognition and regulatory functions [J]. Cell, 2009, 136(2):215-233.

[4] CHEN X, ZHONG S L, LU P, et al. miR-4443 Participates in the Malignancy of Breast Cancer[J]. PloS one,2016, 11(8):e0160780.

[5] WANG D D, LI J, SHA H H, et al. miR-222 confers the resistance of breast cancer cells to Adriamycin through suppression of p27kip1 expression [J]. Gene, 2016, 590(1):44-50.

[6] ZHONG S, CHEN X, WANG D, et al. MicroRNA expression profiles of drug-resistance breast cancer cells and their exosomes [J]. Oncotarget, 2016, 7(15):19601-19609.

[7] TORRE L A, BRAY F, SIEGEL R L, et al.Global cancer statistics,2012[J].CA Cancer J Clin,2015,65(2):87-108.

[8] LOCATELLI M A, AFTIMOS P, DEES E C, et al. Phase I study of the gamma secretase inhibitor PF-03084014 in combination with docetaxel in patients with advanced triple-negative breast cancer[J]. Oncotarget, 2016, doi:10.18632/oncotarget.13727.

[9] ZENG L P,HU Z M,LI K, et al.miR-222 attenuates cisplatin-induced cell death by targeting the PPP2R2A/Akt/mTOR Axis in bladder cancer cells[J].J Cell Mol Med,2016, 20(3):559-567.

[10] SOHN W, KIM J, KANG S H, et al.Serum exosomal microRNAs as novel biomarkers for hepatocellular carcinoma[J]. Exp Mol Med,2015, 47: e184.doi: 10.1038/emm.2015.68.

[11] YU Q, ZHANG F, DU Z, et al.Up-regulation of serum miR-744 predicts poor prognosis in patients with nasopharyngeal carcinoma[J]. Int J Clin Exp Med, 2015, 8(8):13296-13302.

[12] MIYAMAE M,KOMATSU S,ICHIKAWA D,et al.Plasma microRNA profiles: identification of miR-744 as a novel diagnostic and prognostic biomarker in pancreatic cancer[J]. Br J Cancer,2015, 113(10):1467-1476.

[13] TANG Z, YU W, ZHANG C, et al. CREB-binding protein regulates lung cancer growth by targeting MAPK and CPSF4 signaling pathway[J]. Mol Oncol, 2016, 10(2):317-329.

[14] SAUL M J,STEIN S,GREZ M,et al. UPF1 regulates myeloid cell functions and S100A9 expression by the hnRNP E2/miRNA-328 balance[J].Sci Rep, 2016, 6:31995.

[15] KAUR A, WESTERMARCK J. Regulation of protein phosphatase 2A (PP2A) tumor suppressor function by PME-1[J]. Biochem Soc Trans,2016, 44(6):1683-1693.

The mechanism of drug resistance in invasive papillary carcinoma of the breast

WANGDandan1,CHENXiu1,YANGSujin1，F(xiàn)ULi2,TANGJinhai1.

(1.DepartmentofGeneralSurgery,TheFirstAffiliatedHospital,NanjingMedicalUniversity,Nanjing, 210029,China; 2.DepartmentofBreastCancerPathologyandResearchLaboratory,NationalClinicalResearchCenterforCancer,TianjinMedicalUniversityCancerInstituteandHospital,Tianjin300041,China)

TANGJinhai,E-mail:jinhaitangjsch@163.com;FULi,E-mail:fulijyb@hotmail.com

Objective To investigate the effect of miRNAs on chemosensitivity of invasive papillary carcinoma (IMPC). Methods 11 IMPC examples were got from Tianjin Cancer Hospital from 2011 to 2014. The expressions of miRNAs were tested by real time fluorescence quantitative PCR (RT-qPCR) and target genes were predicted with TargetScan and mi RDB databases. Results According to our previous study, we selected 13 miRNAs related to chemoresistance, and found that miR-744-5p was significantly upregulated in IMPC with paclitaxel resistance (t=-2.650, p=0.029). After bioinfomatic analysis, CPFS4，Upf1 and PP2A were detected to be potential target genes of miR-744-5p. Conclusion miR-744-5p may participate in regulation of paclitaxel resistance in IMPC, furthermore, it would be the promising biomarker of IMPC chemoresistance.

miRNAs； IMPC； Docetaxel； Resistance

國家高技術研究發(fā)展計劃(2014AA020604)；國家自然科學基金(81272358)

210029 江蘇 南京，南京醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院 普外科(王丹丹，陳 秀，楊蘇晉，唐金海)；300041 天津，天津醫(yī)科大學附屬天津市腫瘤醫(yī)院 乳腺病理科(付 麗)

王丹丹，女，碩士研究生在讀，研究方向：乳腺癌的分子機制研究，E-mail：dandanw92@163.com

共同第一作者： 陳 秀，女，碩士研究生在讀，研究方向：乳腺癌的分子機制研究，E-mail：xiuchen92@163.com

唐金海，男，主任醫(yī)師，教授，研究方向：乳腺腫瘤的綜合治療，E-mail：jinhaitangjsch@163.com

共同通訊作者： 付 麗，女，主任醫(yī)師，教授，研究方向：乳腺腫瘤病理與精準醫(yī)療，E-mail：fulijyb@hotmail.com

10.3969/j.issn.1674-4136.2016.06.002

1674-4136(2016)06-0353-04

2016-12-02][本文編輯：李筱蕾]