劉　雪濟(jì)南市食品藥品檢驗(yàn)檢測(cè)中心，山東濟(jì)南　250000

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豆豉纖溶酶研究進(jìn)展

劉雪
濟(jì)南市食品藥品檢驗(yàn)檢測(cè)中心，山東濟(jì)南250000

摘要豆豉纖溶酶（Douchi Fibrinolytic Enzyme，DFE）是豆豉中的發(fā)現(xiàn)的一種新型纖溶酶，在體外具有良好的溶栓作用。本文綜述了豆豉纖溶酶的溶栓機(jī)理、產(chǎn)生菌的篩選、酶學(xué)特性及基因的克隆表達(dá)等方面的進(jìn)展，為進(jìn)一步研究指明了方向。

關(guān)鍵詞豆豉纖溶酶；酶學(xué)性質(zhì)；克隆表達(dá)

近年來(lái)血栓性疾病日益成為高發(fā)態(tài)勢(shì)，為人類健康帶來(lái)嚴(yán)重威脅，據(jù)統(tǒng)計(jì)，我國(guó)心臟病及腦中風(fēng)的死亡率超過60%，而藥物溶栓是目前臨床最有效、應(yīng)用最廣的治療手段。

日本學(xué)者須見洋行最早從納豆中提取到能溶解纖維蛋白的納豆激酶（NK），我國(guó)豆豉與日本納豆生產(chǎn)工藝相似，近年我國(guó)學(xué)者從豆豉中分離出產(chǎn)纖溶酶的枯草桿菌，將其所產(chǎn)纖溶酶命名為豆豉纖溶酶[1]（DFE），并對(duì)DFE的生產(chǎn)菌株、酶學(xué)性質(zhì)、溶栓機(jī)制以及分子克隆表達(dá)等進(jìn)行了研究[2]。

1　豆豉纖溶酶來(lái)源

豆豉纖溶酶主要來(lái)源于豆類發(fā)酵制品中的細(xì)菌，目前篩選出產(chǎn)DFE的菌株，主要有枯草芽孢桿菌、解淀粉芽孢桿菌、凝結(jié)芽孢桿菌。1997年傅莉最早篩選到產(chǎn)纖溶酶活達(dá)200U/mL的枯草芽孢桿菌；之后多位學(xué)者篩選出產(chǎn)DFE活力較高的菌株，董明盛從豆豉中分離到DFE活性達(dá)683.3U/mL的枯草芽孢桿菌，魏靜分離到產(chǎn)纖溶酶活達(dá)452U/mL的凝結(jié)芽孢桿菌，彭勇等從豆豉中篩選到具有較高纖溶酶活的解淀粉芽孢桿菌，發(fā)酵液纖溶酶活力可達(dá)820U/mL。

2　豆豉纖溶酶溶栓機(jī)制

對(duì)DFE溶栓機(jī)制的研究，由于菌株來(lái)源不同，目前研究結(jié)果不盡相同，還有待進(jìn)一步研究。研究方法為：同時(shí)在未處理和80℃熱處理過的纖維蛋白板上滴加酶液，檢測(cè)纖溶情況。若未加熱的板與加熱板的纖溶程度相同，顯示的僅是纖溶活性的作用，若未加熱的板纖溶程度高于加熱板，顯示存在纖溶活性和纖溶酶原激活活性兩種作用。王金英等研究了豆豉粗酶液，發(fā)現(xiàn)其同時(shí)存在直接纖溶和間接激活纖溶酶原活性兩種作用；彭勇等對(duì)解淀粉芽孢桿菌DC-4、劉柱對(duì)Bacillus sp. Nov及牛術(shù)敏等對(duì)枯草芽孢桿菌BS-26產(chǎn)的DFE的研究結(jié)果基本一致，在兩種纖維蛋白平板上的纖溶結(jié)果無(wú)明顯差異，顯示其僅是直接溶解纖維蛋白；通過動(dòng)物血栓模型王成濤[3]對(duì)枯草桿菌 DC12-33發(fā)酵液中純化的纖溶酶的纖溶機(jī)制進(jìn)行研究，結(jié)果酶對(duì)80℃加熱處理血凝塊的水解明顯慢于未經(jīng)加熱組，說明它同時(shí)存在直接水解和激活纖溶酶原兩種纖溶機(jī)制。

3　豆豉纖溶酶性質(zhì)

豆豉纖溶酶常通過磷酸鈣吸附、離子交換分離、丙酮沉淀、超濾脫鹽和凝膠過濾等方式進(jìn)行純化和性質(zhì)檢測(cè)。研究發(fā)現(xiàn)DFE是一種絲氨酸蛋白酶，pI為8～9，酶蛋白分子量為27kD～36kD，豆豉來(lái)源不同分子量有一定差異。彭勇通過SDS-PAGE檢測(cè)解淀粉芽孢桿菌DC-4產(chǎn)生的纖溶酶，發(fā)現(xiàn)無(wú)論上樣緩沖液中是否存在β-巰基乙醇，均呈現(xiàn)一條電泳條帶，證明豆豉纖溶酶為單鏈蛋白。

豆豉纖溶酶的熱穩(wěn)定性和酸穩(wěn)定性較弱，閻家麒等發(fā)現(xiàn)DFE在pH7～11范圍內(nèi)穩(wěn)定，而pH＜5時(shí)很快失活，但凍融對(duì)酶活性影響較小，-18℃反復(fù)凍融5次，酶活性損失小于5%。米坤研究了地衣芽孢桿菌產(chǎn)生的纖溶酶，分別在人工胃液和人工腸液中37℃放置3h，結(jié)果在人工胃液中殘余酶活約僅為17.6%，而在人工腸液中殘余酶活高于70%，應(yīng)用中宜將其制成腸溶劑以保持其較高活力。為提高穩(wěn)定性張嬋等采用硫酸銨梯度法制備了DFE納米脂質(zhì)體，減少了在胃腸內(nèi)的降解，為解決DFE口服生物利用度低等問題提供了新途徑。

4　豆豉纖溶酶基因工程改造

目前產(chǎn)纖溶酶的天然菌株普遍產(chǎn)酶量較低，為提高其產(chǎn)量，近年我國(guó)學(xué)者利用基因工程菌生產(chǎn)DFE，目前初步表達(dá)出活性DFE。最早彭勇[4]從解淀粉芽孢桿菌DC-4基因組中克隆到DFE成熟肽基因，將其構(gòu)建成融合型表達(dá)載體pET-Nde，轉(zhuǎn)化大腸桿菌，誘導(dǎo)表達(dá)出無(wú)活性的包涵體融合蛋白。羅文華研究了基因自身啟動(dòng)子的作用，擴(kuò)增獲得DFE啟動(dòng)子至3p非翻譯區(qū)的全長(zhǎng)1400bp基因，通過大腸桿菌-枯草桿菌穿梭載體pBE3，轉(zhuǎn)化到枯草桿菌WB800，加入自身啟動(dòng)子后，重組菌獲得了高活性分泌表達(dá)，酶活高達(dá)690U/mL。王開敏等[5]對(duì)從豆豉的強(qiáng)纖溶活性的菌株擴(kuò)增DFE基因，構(gòu)建pYES2-DFE重組質(zhì)粒，導(dǎo)入到釀酒酵母感受態(tài)細(xì)胞中，誘導(dǎo)表達(dá)后DFE活性達(dá)222.49U/mL，使DFE基因在真核生物中高活力的分泌表達(dá)。崔堂兵等采用定向進(jìn)化技術(shù)對(duì)DFE基因進(jìn)行定點(diǎn)突變，將第156位的谷氨酸、第166位的甘氨酸分別替換為絲氨酸和丙氨酸，第169位甘氨酸殘基替換為丙氨酸，并利用枯草芽孢桿菌WB800構(gòu)建了表達(dá)菌株，3種表達(dá)菌株發(fā)酵上清液中纖溶酶的

活力性分別是原菌株活力的70%、115%和136%，為提高酶活力提供了一個(gè)新的有效途徑。

5　結(jié)論

依據(jù)目前研究成果，纖溶酶的活力產(chǎn)量難以應(yīng)用與實(shí)際生產(chǎn)需要，通過誘變育種、優(yōu)化發(fā)酵條件、基因工程技術(shù)等多種方式進(jìn)一步提高酶活及產(chǎn)量變得非常關(guān)鍵。雖纖溶酶體外溶栓效果得到證實(shí)，但在體內(nèi)的溶栓效果、毒副作用、最佳給藥方式等，還需要更進(jìn)一步研究，也是DFE真正投入到臨床及市場(chǎng)前必須進(jìn)行研究的重點(diǎn)。

參考文獻(xiàn)

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[2]Shi H.Wang，Cheng Zhang， etal. Screening of a high fibrinolytic enzyme producing strain and characterization of the fibrinolytic enzyme produced from Bacillus subtilis LD-8547[J]. World J Microbiol Biotechnol ，2008，24:475–482.

[3]王成濤，鄭杰，籍保平，等.豆豉纖溶酶Subtilisin FS33的溶栓作用及其機(jī)制的研究[J].營(yíng)養(yǎng)學(xué)報(bào)，2007，29 （6）：600-604.

[4]彭勇，黃慶，張義正.枯草桿菌DC-2納豆激酶基因的克隆及其融合蛋白在E.coli中的表達(dá)[J].中國(guó)生物化學(xué)與分子生物學(xué)報(bào)，2002，18（5）：559-563.

[5]王開敏，趙敏.產(chǎn)纖溶酶菌株的分離和鑒定及纖溶酶基因在釀酒酵母中的表達(dá)[J].中國(guó)食品學(xué)報(bào)，2009，9（2）：23-28.

中圖分類號(hào)TS201.2

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼A

文章編號(hào)1674-6708（2016）155-0143-01