劉豐銘， 李金澤， 梁啟冰*， 藺勝娟

(1.山東省日照第一中學(xué)，山東日照 276826; 2.山東省日照青島路中學(xué)，山東日照 276826)

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日照海蟬DNA條形碼及其分子系統(tǒng)進(jìn)化分析

劉豐銘1， 李金澤1， 梁啟冰1*， 藺勝娟2*

(1.山東省日照第一中學(xué)，山東日照 276826; 2.山東省日照青島路中學(xué)，山東日照 276826)

摘要[目的]研究COI基因區(qū)段作為DNA條形碼在識別日照海蟬地理群體的可行性和有效性。[方法]以日照海蟬為研究對象，用引物L(fēng)CO1490和HCO2198擴(kuò)增線粒體COI基因片段序列，產(chǎn)物雙向測序，用Clustal W進(jìn)行DNA序列比對,用MEGA 6.0軟件采用鄰接法(Neighbor-Joing, NJ)和最大簡約法(maximum parsimony, MP)構(gòu)建分子系統(tǒng)發(fā)育樹。[結(jié)果]獲得大小為658 bp的COI基因，A、T、C、G的平均含量分別為30.24%、36.63%、16.41%、16.72%，其中A+T平均含量(66.87%)明顯高于G+C平均含量(33.13%)，NJ和MP系統(tǒng)發(fā)育樹均表明日照海蟬屬于蟬蟹總科(Hippoidea)眉足蟹科(Blepharipoda)，與形態(tài)學(xué)的分屬結(jié)果一致。[結(jié)論]采用COI基因序列作為DNA條形碼進(jìn)行海蟬分類鑒定具有一定的可行性。

關(guān)鍵詞日照海蟬；DNA條形碼；COI基因；系統(tǒng)進(jìn)化

DNA Barcoding and Molecular Evolution of Rizhao Haichan

LIU Feng-ming1, LI Jin-ze1, LIANG Qi-bing1*, LIN Sheng-juan2*(1.Rizhao No.1 Middle School of Shandong, Rizhao, Shandong 276826; 2.Rizhao Qingdao Road Middle School, Rizhao, Shandong 276826)

Abstract [Objective] The aim was to study the feasibility and effectiveness of usingCOIparticular gene segment as the DNA barcoding in identifying Rizhao Haichan geographical group.[Method] With Rizhao Haichan as research object, the mitochondrial cytochrome C oxidase subunit I (COI) gene fragment was amplified by primers LCO1490 and HCO2198, the product was sequenced and the DNA sequence alignment was carried out by ClustalX.The phylogenetic trees were constructed using Neighbor-Joining method and Maximum Parsimony (on MEGA6.0).[Result] TheCOIgene was found 658 bp in size, and among all the sites, the average proportion of base A, T, C and G were 30.24%, 36.63%, 16.41% and 16.72%, respectively.A+T base pair accounted for 66.87% of the mitochondrialCOIgene, which was significantly higher than that of G+C base pair(33.13%).The results of NJ and MP method indicated that the related species could gather in the same branch, and the Rizhao Haichan belongs to the family Blepharipoda in superfamily Hippoidea.[Conclusion] DNA barcoding based on mitochondrialCOIgene sequence is applicable in the classification and identification of Anomura.

Key words Rizhao Haichan; DNA barcoding;COIgene; Phylogeny

日照海蟬，學(xué)名為解放眉足蟹，又稱海蟬蟹，是一種介于蝦和蟹之間的海洋甲殼動(dòng)物。海蟬營養(yǎng)豐富，富含鈣磷鉀等礦物質(zhì)。近年來由于海蟬被作為海鮮特色菜端上餐桌，消費(fèi)者對其需求量大大增加，從而導(dǎo)致其采挖量隨之升高；加之沿海污染物的排放破壞了其生存環(huán)境，嚴(yán)重影響了海蟬的繁殖成活率，致使海蟬的生存數(shù)量一直處于下降趨勢。因此，對日照海蟬地方特有物種進(jìn)行搶救性收集、保護(hù)已刻不容緩。

DNA條形碼技術(shù)是通過對一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)目的基因的DNA序列進(jìn)行分析從而進(jìn)行物種鑒定的技術(shù)，對于發(fā)現(xiàn)新物種和隱存種、鑒定瀕危物種和鑒別外來入侵種具有重要意義。Hebert等[1-2]于2003年首次提出DNA條形碼的概念，對其物種分類和鑒定意義予以肯定，并建議利用COI的特定區(qū)段作為DNA條形碼的基礎(chǔ)。COI基因相對保守，有足夠的變異，序列長度合適，被廣泛應(yīng)用于動(dòng)物遺傳變異、系統(tǒng)發(fā)育分析及物種鑒定中[3]。研究表明，以COI基因?yàn)闃?biāo)記的DNA條形碼能夠準(zhǔn)確地對海洋生物進(jìn)行物種鑒定，可以選用COI基因作為各海洋生物條形碼數(shù)據(jù)庫的標(biāo)準(zhǔn)條形碼。筆者分析日照地方物種海蟬COI基因片段核苷酸序列，并探討該基因片段作為海蟬鑒定DNA條形碼的可行性，以期了解海蟬的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系，為地方物種資源保護(hù)和利用提供依據(jù)。

1材料與方法

1.1試驗(yàn)材料海蟬樣本采自山東日照，取其部分肌肉組織，用75%乙醇固定，4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2試驗(yàn)方法基因組提取采用王茜等[4]的方法。PCR體系：滅菌蒸餾水37.75 μL，10×ExTaqBuffer 5.00 μL,2.5 mmol/L dNTP Mixture 4.00 μL,10 μmol/L LCO1490 2.50 μL,10 μmol/L HCO2198 2.50 μL,DNA模板2.00 μL TaKaRa ExTaqHS (5 U/μL)0.25 μL。

PCR反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性5 min；95 ℃變性30 s，47 ℃退火30 s，72 ℃延伸45 s，35個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸7 min，PCR產(chǎn)物4 ℃保存。COI基因片段擴(kuò)增引物分別為LCO1490: 5′-GGT CAA CAA ATC ATA AAG ATA TTG G-3′和HCO2198: 5′-TAA ACT TCA GGG TGA CCA AAA AAT CA-3′[5]；PCR產(chǎn)物送上海生工生物工程技術(shù)有限公司純化并雙向測序。

1.3序列分析所得正反向序列利用SeqMan軟件(DNAStar 7.2.1軟件包)進(jìn)行拼接，如正反序列出現(xiàn)不配對時(shí)，則需要根據(jù)熒光圖譜進(jìn)行手工校正，以確保每一個(gè)位點(diǎn)上的堿基都準(zhǔn)確無誤。將拼接和校正后得到的序列通過內(nèi)置于Bioedit 7.0.9軟件的claustal W程序進(jìn)行排序，并去掉正反向引物序列。

將日照海蟬COI基因序列通過BLAST工具逐一與GenBank和BOLD數(shù)據(jù)庫中可用的條形碼序列進(jìn)行比對，基于最大匹配率對序列進(jìn)行確認(rèn)，以確保物種鑒定的準(zhǔn)確性。

利用MEGA 6.0軟件，采用鄰位相連法(NJ)和最大簡約性法(MP)構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹并重復(fù)抽樣分析(Replication=1 000)。

2結(jié)果與分析

2.1COI序列擴(kuò)增結(jié)果以LCOI490和HC02198為PCR引物，能夠成功擴(kuò)增日照海蟬的COI基因序列，片段長度為709 bp(圖1)。

圖1　COI基因片段PCR擴(kuò)增結(jié)果Fig.1　PCR amplification results of COI gene fragment

2.2序列特征與分析除掉正反方向引物序列，LCOI490和HC02198擴(kuò)增得到長度為658 bp的COI基因核苷酸片段(GenBank登錄號KJ700466)，且通過多重比較在序列中未發(fā)現(xiàn)插入和缺失位點(diǎn)。在COI基因中，A、T、C、G的平均含量分別為30.24%、36.63%、16.41%、16.72%，其中A+T平均含量(66.87%)明顯高于G+C平均含量(33.13%)，表現(xiàn)出堿基組成的偏倚性，這與無脊椎動(dòng)物線粒體基因堿基組成特點(diǎn)相符合。

表1　異尾下目DNA條形碼COI基因序列

圖2　基于COI基因構(gòu)建的鄰位相連法(NJ)系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.2　The phylogenetic tree of neighbor-joining(NJ) method based on COI gene

2.3分子進(jìn)化分析在NCBI中獲得異尾下目各科屬COI基因的序列(表1)，基于COI序列，分別應(yīng)用鄰位相連法(NJ)和最大簡約性法(MP)構(gòu)建NJ和MP系統(tǒng)發(fā)育樹(圖2和圖3)，由圖2、3可知，日照海蟬屬于蟬蟹總科(Hippoidea)眉足蟹科(Blepharipoda)，這說明分子系統(tǒng)學(xué)的結(jié)果與形態(tài)學(xué)的分屬結(jié)果一致。

3結(jié)論與討論

該研究表明，日照海蟬COI基因不存在堿基插入缺失現(xiàn)象，A+T含量偏高。A+T含量高的偏倚現(xiàn)象不僅存在于魚類、貝類和頭足類等水產(chǎn)動(dòng)物中，在己報(bào)道的蝦蟹類COI基因堿基組成中也普遍存在A+T含量偏倚現(xiàn)象，這也符合無脊椎動(dòng)物線粒體DNA堿基組成的特點(diǎn)。

由于動(dòng)物界線粒體(mt)DNA進(jìn)化速率快于細(xì)胞核DNA，包括細(xì)胞色素B(COB)和細(xì)胞色素氧化酶第一亞基(COI)基因在內(nèi)的mtDNA已被用于系統(tǒng)發(fā)育和系統(tǒng)地理學(xué)研究[6]。該研究采用COI的通用引物對日照海蟬進(jìn)行擴(kuò)增，可順利獲得相應(yīng)序列，表明COI的通用引物在蟬蟹總科物種中具有普遍適用性。在該研究中，利用COI基因序列，通過條形碼間隙和系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹都可以有效地進(jìn)行鑒別，表明采用基于COI基因的DNA條形碼技術(shù)進(jìn)行分類鑒定是可行的。通過DNA條形碼分子系統(tǒng)發(fā)育研究，明確了日照海蟬屬于蟬蟹總科(Hippoidea)眉足蟹科(Blepharipoda)，這與形態(tài)學(xué)分類鑒定結(jié)果一致[7]。

圖3　基于COI基因構(gòu)建的最大簡約性法(MP)系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.3　The phylogenetic tree of maximum parsimony(MP) based on COI gene

DNA條形碼技術(shù)獲得了很多學(xué)者的認(rèn)可并被廣泛應(yīng)用，可以彌補(bǔ)形態(tài)學(xué)物種鑒定的不足，快速對部分零散組織和形態(tài)特征不完整的樣品進(jìn)行鑒定，也不受生物生長發(fā)育時(shí)期的限制，是一種可以輔助形態(tài)學(xué)進(jìn)行物種識別和鑒定的新興技術(shù)，但DNA條形碼技術(shù)不能完全取代傳統(tǒng)的形態(tài)學(xué)鑒定方法。DNA條形碼技術(shù)并不是基于DNA條形碼序列而創(chuàng)建的一種新的分類系統(tǒng)，也不是部分學(xué)者認(rèn)為的可以取代林奈的分類系統(tǒng)，而是一種快速識別物種和輔助傳統(tǒng)分類法進(jìn)行物種鑒定和發(fā)現(xiàn)新種的分類技術(shù)。

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收稿日期2016-01-08

作者簡介劉豐銘(1998- )，男，山東日照人，高中生。*通訊作者，梁啟冰，高級教師，碩士，從事信息與科技創(chuàng)新教育工作。*通訊作者，藺勝娟，高級教師，從事數(shù)學(xué)與科技創(chuàng)新教育工作。

中圖分類號S 188

文獻(xiàn)標(biāo)識碼A

文章編號0517-6611(2016)03-133-03