梁文潔，李金超，舒 佳，舒志明，張躍進(jìn)，梁宗鎖，郭宏波，3*

(1.逆境生物學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，西北農(nóng)林科技大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，陜西楊凌 712100；2.北京大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，北京100080；3.大不列顛哥倫比亞大學(xué)生物系，加拿大基隆拿，v1v 1v7)

?

擬南芥主動去甲基化研究進(jìn)展

梁文潔1，李金超2，舒 佳1，舒志明1，張躍進(jìn)1，梁宗鎖1，郭宏波1，3*

(1.逆境生物學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，西北農(nóng)林科技大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，陜西楊凌 712100；2.北京大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，北京100080；3.大不列顛哥倫比亞大學(xué)生物系，加拿大基隆拿，v1v 1v7)

摘要介紹了模式植物擬南芥主動去甲基化的最新進(jìn)展，包括酶學(xué)過程、調(diào)控機(jī)制、去甲基化與甲基化平衡機(jī)制、研究方法及其生物學(xué)意義。這些進(jìn)展對其他植物而言，除對調(diào)控機(jī)制可進(jìn)行補(bǔ)充研究外，還對作物的重要經(jīng)濟(jì)性狀，如育性調(diào)控、種子形成和抗逆基因篩選等的深入研究具有重要參考價值。

關(guān)鍵詞擬南芥；DNA甲基化；去甲基化；作物性狀

Advances on Active Demethylation of Arabidopsis

LIANG Wen-jie1, LI Jin-chao2, SHU Jia1, GUO Hong-bo1,3*et al(1. State Key Laboratory of Stress Biology in Arid Areas, College of Life Sciences, Northwest A&F University, Yangling, Shaanxi 712100; 2. College of Life Sciences, Peking University, Beijing 100080; 3. Department of Biology, The University of British Columbia, Canada, Kolowna v1v 1v7)

AbstractThe advances of active demethylation onArabidopsiswere introduced, including enzymatic process, modulation mechanism, balance between demethylation and methylation mechanism, research methods and biological significance. For other plants, these advances could be used as references to carry out supplement researches on mechanism. This research is of great reference significance to the in-depth research on important economic characteristics of crops, such as fertility regulation, seed formation, and screening of stress genes.

Key wordsArabidopsis; DNA methylation; Demethylation; Economic characteristics

植物的遺傳信息被編碼在基因組4種核苷酸排列順序中，其中胞嘧啶可以發(fā)生甲基共價修飾，形成甲基胞嘧啶(5-mC)[1-3]?；虮患谆揎椇蟊磉_(dá)活性會受抑制，但也有少數(shù)促進(jìn)的情況[4-5]。植物常通過動態(tài)調(diào)控甲基化修飾來調(diào)控基因的時空表達(dá)?；蚪MDNA的甲基化修飾、組蛋白的翻譯后修飾以及其他表觀遺傳修飾可使一個基因組衍生出上百個轉(zhuǎn)錄組[6]。因此，DNA甲基化的調(diào)控機(jī)制是多年來遺傳學(xué)領(lǐng)域研究的熱點(diǎn)。

擬南芥因具有基因組小、遺傳操作簡單、生長周期短等優(yōu)勢，已成為研究植物甲基化調(diào)控的首選材料[7]。隨著各種遺傳篩選體系的不斷發(fā)掘以及DNA甲基化測序技術(shù)的成熟，大量參與甲基化調(diào)控的基因被發(fā)現(xiàn)。截至目前，擬南芥基因組甲基化調(diào)控網(wǎng)絡(luò)已基本清楚，但對調(diào)控DNA去甲基化機(jī)制了解很少。目前已知的DNA去甲基化有2種方式：被動和主動的去甲基化。被動去甲基化是DNA在復(fù)制過程中，與甲基化維持有關(guān)的酶功能喪失，造成新合成的DNA鏈被動丟失了甲基化信息[8-9]。而主動的DNA去甲基化是植物響應(yīng)刺激(如外界逆境)主動地改變基因組甲基化修飾的模式，調(diào)節(jié)基因、轉(zhuǎn)座元件等的表達(dá)活性。筆者綜述了擬南芥中DNA主動去甲基化的研究進(jìn)展，包括主動去甲基化的酶學(xué)過程、調(diào)控機(jī)制，主動去甲基化機(jī)制與RdDM(RNA dependent DNA methylation)機(jī)制的平衡，DNA去甲基化的研究方法及其生物學(xué)意義等，旨在為農(nóng)作物的相關(guān)研究提供參考。

1DNA主動去甲基化的酶學(xué)過程

擬南芥DNA主動去甲基化采用堿基切除后再修復(fù)策略，即把原來甲基化的胞嘧啶切除，換成一個新的未被甲基化修飾的胞嘧啶。甲基化的胞嘧啶能被ROS1家族蛋白識別并切割。目前已知的ROS1家族蛋白包括ROS1、DME、DML2和DML3，體外生化試驗(yàn)表明它們是一類雙功能糖苷酶[10-12]。它們首先切割堿基與糖基之間的C-N鍵釋放甲基胞嘧啶，然后進(jìn)一步切割DNA骨架。切割方式有β切割和β，δ切割2種，形成3′-PUA 或3′-P 2種產(chǎn)物[13]。3′-PUA產(chǎn)物優(yōu)先生成，隨后進(jìn)一步轉(zhuǎn)化為3′-P。3′端的PUA和磷酸基團(tuán)會被APE1L和ZDP分別清除，形成3′-OH，后續(xù)DNA聚合酶和連接酶才能催化一個新的未被甲基化的胞嘧啶連接到切口處，從而完成DNA鏈的修復(fù)[14-15](圖1)。承接最后修復(fù)任務(wù)的連接酶主要是AtLIG1，而聚合酶目前尚未被發(fā)現(xiàn)[16]。動物中的DNA主動去甲基化也以類似的過程進(jìn)行，不同的是動物中胞嘧啶上的甲基要先被氧化成羧基，然后才能執(zhí)行堿基的切除和修復(fù)[17]。

圖1　擬南芥主動去甲基化的酶學(xué)過程Fig.1　Enzymatic process of active demethylation of Arabidopsis

2DNA主動去甲基化的調(diào)控機(jī)制

盡管擬南芥DNA主動去甲基化的酶學(xué)過程已較清楚，但植物是如何引導(dǎo)這些酶至需要去除甲基靶點(diǎn)的機(jī)制尚不清楚。近年來，一些新的去甲基化成員已被發(fā)現(xiàn)，組蛋白乙?；窱DM1被發(fā)現(xiàn)能識別去甲基化目標(biāo)靶點(diǎn)的甲基，使H3K18和H3K23發(fā)生乙?；瑺I造出一種寬松的染色質(zhì)結(jié)構(gòu)，方便ROS1執(zhí)行去甲基化功能[18]；IDM2和IDM3是一類具有α晶體結(jié)構(gòu)域的小熱激蛋白，能與IDM1相互作用，起到維持IDM1正常功能的作用。以上3種蛋白構(gòu)成一個復(fù)合體(IDM1復(fù)合體)，它們各自的突變會造成基因組上千個位點(diǎn)發(fā)生甲基化修飾的升高，且這些升高位點(diǎn)與ros1突變植株的甲基化升高位點(diǎn)有較高的重合。近年來研究發(fā)現(xiàn)CpG島結(jié)合蛋白MBD7能與IDM1、IDM2和IDM3相互作用，是IDM1復(fù)合體的一個新成員。MBD7偏好與高度甲基化的、CG序列集中的DNA區(qū)域結(jié)合，因此推測MBD7可以牽引IDM1復(fù)合體到去甲基化靶點(diǎn)，進(jìn)而創(chuàng)造寬松的染色質(zhì)環(huán)境促使ROS1執(zhí)行去甲基化功能[19-22]。IDM1復(fù)合體的發(fā)現(xiàn)使得人們意識到，特定基因組位點(diǎn)的表觀修飾特征(包括DNA甲基化修飾和組蛋白的修飾)可能為去甲基化酶系統(tǒng)的到來提供了原始信號。

指引去甲基化酶系統(tǒng)到需要去除甲基特定位點(diǎn)的另一個可能機(jī)制被認(rèn)為像RdDM通路一樣，由非編碼RNA進(jìn)行介導(dǎo)。一種小RNA結(jié)合蛋白ROS3 的突變能導(dǎo)致基因組數(shù)千個甲基化位點(diǎn)發(fā)生變化，猜想ROS3可能結(jié)合去甲基化目標(biāo)位點(diǎn)轉(zhuǎn)錄的小RNA，通過小RNA與目標(biāo)位點(diǎn)的同源結(jié)合錨定在該位點(diǎn)上，并招募去甲基化酶系統(tǒng)到來[23]。

截至目前，尚未發(fā)現(xiàn)去甲基化關(guān)鍵酶ROS1與ROS3或IDM1復(fù)合體有直接的互作作用，也不能確定ROS1究竟是怎樣被招募到去甲基化靶點(diǎn)上的[18，23]。體外生化試驗(yàn)表明，ROS1在切割完C-N鍵和DNA骨架后，會緊緊地結(jié)合在生成的底物上，這大大限制了ROS1作用的連續(xù)性[14-15](圖2)。作用于ROS1下游的酶ZDP和APE1L均不能增加ROS1作用的連續(xù)性。ROS1不能長時間結(jié)合在DNA鏈上，這會嚴(yán)重干擾DNA的其他代謝活動。而且面對基因組繁重的去甲基化任務(wù)，ROS1在植物體內(nèi)應(yīng)該是連續(xù)性的。因此，是什么機(jī)制能確保ROS1作用的連續(xù)性需要繼續(xù)探索。

圖2　擬南芥DNA主動去甲基化的調(diào)控機(jī)制Fig.2　The regulatory mechanism of active demethylation in Arabidopsis

3主動去甲基化機(jī)制和RdDM 甲基化機(jī)制的平衡

植物主動去甲基化機(jī)制和RdDM甲基化機(jī)制作為相互對立的2種機(jī)制，它們是如何互相協(xié)作維持基因甲基化修飾的動態(tài)平衡尚不明確。研究發(fā)現(xiàn)，在RdDM突變植株中去甲基化關(guān)鍵酶ROS1的表達(dá)量被下調(diào)，這說明RdDM機(jī)制和主動去甲基化機(jī)制之間可能存在某種關(guān)聯(lián)，協(xié)作維持基因甲基化修飾的動態(tài)平衡[24]。最新研究表明，ROS1基因啟動子含有一個短TE序列，該TE序列甲基化程度可正向調(diào)控ROS1表達(dá)。與此同時，該TE序列也是RdDM機(jī)制和主動去甲基化機(jī)制作用的位點(diǎn)。染色質(zhì)免疫共沉淀試驗(yàn)表明，RdDM機(jī)制的關(guān)鍵成員如NRPE1、AGO4在這段序列處均有富集，且這個位點(diǎn)是PollV轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物sRNAs的結(jié)合位點(diǎn)，這2個證據(jù)直接表明該段TE序列是RdDM機(jī)制的一個活躍靶標(biāo)。另一方面，ROS1突變也會導(dǎo)致該TE序列甲基化修飾上升，說明它是ROS1的一個靶標(biāo)。綜上所述，該段TE序列可以使RdDM機(jī)制和主動去甲基化機(jī)制相互“感知”對方的活躍程度[25-26]。當(dāng)RdDM機(jī)制過度活躍時，該TE序列的甲基化修飾上升，促進(jìn)了ROS1的表達(dá)，主動去甲基化機(jī)制也變得活躍起來，從而拮抗了RdDM機(jī)制。

4擬南芥DNA主動去甲基化的研究方法

擬南芥去甲基化調(diào)控相關(guān)的基因多數(shù)是通過各種遺傳篩選方法發(fā)現(xiàn)的。去甲基化通路有幾個很成功的遺傳篩選體系，如RD29A-LUC體系：將一個內(nèi)源啟動子RD29A驅(qū)動的熒光素酶基因LUC轉(zhuǎn)入擬南芥中，在低溫、高鹽等逆境下RD29A啟動子被激活，轉(zhuǎn)錄出熒光素酶，當(dāng)表達(dá)了熒光素酶的植株遇到熒光底物后就會發(fā)出熒光。將這一轉(zhuǎn)基因植株進(jìn)行EMS誘變，篩選出逆境刺激不再發(fā)出熒光的個體，并通過圖位克隆找出相應(yīng)的突變基因[27]。該篩選體系原本是用來篩選抗逆相關(guān)基因，然而卻意外篩選到了植物中的第一個DNA去甲基化酶ROS1，隨后還發(fā)現(xiàn)了ROS3和ROS5/IDM2。這些基因的突變都會導(dǎo)致啟動子RD29A被高度甲基化，這種啟動子的甲基化抑制了熒光素酶基因LUC的表達(dá)[11，22-23]。另一個成功的篩選體系是35S-SUCII體系：病毒來源的35S強(qiáng)啟動子驅(qū)動一個蔗糖轉(zhuǎn)運(yùn)酶基因SUCII，攜帶這個轉(zhuǎn)基因的擬南芥植株在蔗糖培養(yǎng)基中生長受到抑制，表現(xiàn)為根系不能伸長。利用這一轉(zhuǎn)基因體系進(jìn)行遺傳篩選，篩選到了幾乎全部的RdDM通路成員及很多的去甲基化新成員。這些成員的功能缺失均導(dǎo)致35S啟動子的高度甲基化而引發(fā)了SUCII基因的轉(zhuǎn)錄沉默[25，28]。

去甲基化調(diào)控成員的功能缺失會導(dǎo)致基因組某些位點(diǎn)的甲基化修飾上升?；诖耍藗儼l(fā)展了一種基于PCR的CHOP-PCR技術(shù)。該技術(shù)在基因組上尋找一些甲基化敏感的內(nèi)切酶的酶切位點(diǎn)，并在該位點(diǎn)兩側(cè)設(shè)計PCR引物。當(dāng)該位點(diǎn)因?yàn)槿ゼ谆{(diào)控成員的突變而引起甲基化修飾上升時，內(nèi)切酶將不能切割該位點(diǎn)，進(jìn)行PCR反應(yīng)時將會擴(kuò)增出條帶。利用該方法可以在各種突變體庫中篩選可能參與去甲基化的新成員基因，IDM1和IDM2就是用這種方法篩選出來的[18，21]。近年來，基于第2代基因測序技術(shù)的全基因組甲基化測序技術(shù)被應(yīng)用于甲基化調(diào)控研究。與CHOP-PCR只能分析個別基因組位點(diǎn)甲基化修飾變化情況相比，全基因組甲基化測序能觀察到整個基因組的甲基化變化，但全基因組甲基化測序成本昂貴，且后續(xù)數(shù)據(jù)分析過程相對復(fù)雜。

酵母雙雜交、煙草瞬時表達(dá)、IP-MS等方法常被用于研究去甲基化蛋白間的相互作用。擬南芥作為模式植物，已經(jīng)構(gòu)建出全部基因的單基因突變體庫[29]。擬南芥還可以方便地進(jìn)行雜交，能夠把不同突變背景整合在一起。這些均為研究去甲基化基因間的互作提供了便利。

5DNA主動去甲基化的生物學(xué)意義

5.1去甲基化與轉(zhuǎn)座元件活性研究表明，擬南芥基因組甲基化修飾主要發(fā)生在異染色質(zhì)區(qū)域，包括著絲粒、端粒、重復(fù)序列和轉(zhuǎn)座元件等[30-31]。擬南芥中的轉(zhuǎn)座元件大多數(shù)是高度甲基化的，已有很多證據(jù)表明，當(dāng)轉(zhuǎn)座元件的甲基化修飾程度下降后，轉(zhuǎn)座元件活性就會被激活。因此，擬南芥DNA主動去甲基化的一個重要生物學(xué)功能就是調(diào)控轉(zhuǎn)座元件的活性。擬南芥的雌配子在形成過程中，中心細(xì)胞以及雌配子營養(yǎng)核的基因組會發(fā)生一輪全基因組范圍內(nèi)的去甲基化，這個過程會引起一些轉(zhuǎn)座元件的激活[32-33]。

5.2去甲基化與基因印記擬南芥基因組中有少數(shù)成員，它們來自父本和母本的2個等位基因具有不同的表達(dá)活性，甚至有一方可能完全不表達(dá)[34]。這類印記基因的產(chǎn)生被認(rèn)為是因?yàn)槭芫珪r父母本基因組具有不同的表觀修飾狀態(tài)，如甲基化修飾，因而造成受精后代中2個等位基因的表達(dá)活性不同[35]。在擬南芥等開花植物中，基因印記只出現(xiàn)在胚乳中[36]。因雌配子體中心細(xì)胞在成熟過程中要經(jīng)歷一輪全基因組范圍的去甲基化，因此胚乳中父母本基因組的甲基化狀態(tài)差異較大(父本高甲基化，母本低甲基化)，這是印記基因產(chǎn)生的遺傳學(xué)原因[33]。研究發(fā)現(xiàn)，雌配子體中心細(xì)胞基因組甲基化下調(diào)程度很大的位點(diǎn)富含重復(fù)序列和轉(zhuǎn)座元件，且很多是位于功能基因的側(cè)翼。因此，認(rèn)為基因印記產(chǎn)生可能是抑制轉(zhuǎn)座元件時產(chǎn)生的副效應(yīng)，即由于轉(zhuǎn)座元件無意地插入某基因的調(diào)控區(qū)域而導(dǎo)致該基因的轉(zhuǎn)錄被抑制[37]?；诖耍腥藢⒅行募?xì)胞基因組甲基化修飾下調(diào)程度很大的區(qū)域進(jìn)行了鑒定，成功發(fā)現(xiàn)了4個新的印記基因和約50個候選印記基因[38]。

研究發(fā)現(xiàn)，去甲基化酶DME是調(diào)控印記基因表達(dá)的重要分子，并只在雌配子體中心細(xì)胞中表達(dá)。直接參與中心細(xì)胞基因組的去甲基化，當(dāng)精子和中心細(xì)胞結(jié)合后，DME終止表達(dá)。DME突變株是“母系致死”的，即種子中若來自母本的DME基因是有缺陷的，無論父本中的DME基因是否正常，種子均不能正常發(fā)育。這是因?yàn)槟副綝ME缺陷使得中心細(xì)胞不能正常去甲基化，影響了印記基因的表達(dá)，中心細(xì)胞即使與正常的父本精子受精后也不能發(fā)育成正常的胚乳，種胚會因?yàn)榈貌坏脚呷闋I養(yǎng)供給而死亡[10，39]。最新研究發(fā)現(xiàn)，去甲基化酶系統(tǒng)中除DME外，下游的ZDP和APE1L雙突變，以及AtLIG1也能影響印記基因表達(dá)而出現(xiàn)母系致死現(xiàn)象[15-16]。

5.3去甲基化與植物抗逆研究發(fā)現(xiàn)，去甲基化酶ROS1、DML1和DML2三突變植株(rdd植株)對真菌感染的抵抗力下降。與野生型相比，rdd植株中大量基因表達(dá)量下調(diào)，表達(dá)量下調(diào)的基因中大部分與抗病性有關(guān)。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，表達(dá)量下調(diào)明顯與抗病性有關(guān)的基因，它們在調(diào)控區(qū)域常含有一個短的重復(fù)序列或轉(zhuǎn)座元件。這些短的重復(fù)序列或轉(zhuǎn)座元件在rdd植株中其甲基化修飾被明顯下調(diào)。因此，去甲基化的一個重要生物學(xué)功能被認(rèn)為是通過調(diào)節(jié)抗逆基因調(diào)控區(qū)域的重復(fù)序列和轉(zhuǎn)座元件的甲基化修飾來調(diào)控抗逆基因的表達(dá)[40]。

5.4去甲基化與果實(shí)成熟研究發(fā)現(xiàn)，DNA去甲基化與果實(shí)成熟進(jìn)程有直接關(guān)聯(lián)。在番茄中，一些促進(jìn)果實(shí)成熟有關(guān)的基因如葉綠素降解基因、番茄紅素基因等在果實(shí)成熟時其啟動子要進(jìn)行去甲基化，才能激活轉(zhuǎn)錄。當(dāng)編碼番茄DNA去甲基化糖苷酶的基因SlDMLs突變后，這些基因的啟動子不能按時進(jìn)行去甲基化，果實(shí)出現(xiàn)遲熟的表型[41-43]。類似的機(jī)制在蘋果、梨等水果中也有所發(fā)現(xiàn)[44-45]。

6展望

作為遺傳學(xué)領(lǐng)域最新研究熱點(diǎn)，DNA主動去甲基化的研究在擬南芥上已取得一定進(jìn)展，但仍有很多未知，如擬南芥如何響應(yīng)內(nèi)外環(huán)境刺激對基因組特定位點(diǎn)/基因進(jìn)行去甲基化，以調(diào)節(jié)基因的表達(dá)活性；去甲基化與其他表觀修飾之間的聯(lián)系和協(xié)作，如DNA甲基化、組蛋白H3K9三甲基化、組蛋白變體H2A.Z 和H2A.W等都富集在異染色質(zhì)區(qū)，但它們之間的聯(lián)系和協(xié)助尚不清楚[6，46-47]。在性狀應(yīng)用上，利用DNA主動去甲基化等表觀遺傳手段進(jìn)行作物改良的前景亟待開發(fā)。研究表明，番茄、蘋果等果實(shí)的成熟依賴于果實(shí)成熟有關(guān)基因的去甲基化，應(yīng)用表觀修飾調(diào)控手段可能達(dá)到操縱果實(shí)成熟進(jìn)程的目的[41]。另外，在植物抗逆方面，植物響應(yīng)環(huán)境脅迫會大量地改變基因組的轉(zhuǎn)錄水平，這種改變一定程度上依賴于基因表觀修飾狀態(tài)的改變，如抗性基因啟動子的去甲基化。近期研究表明，植物在逆境條件下獲得的一部分表觀遺傳信息可以順利傳遞給子代，使子代維持抗性。傳統(tǒng)抗病作物的分子育種主要集中在通過抗性基因轉(zhuǎn)錄水平激活單基因功能，造成過多依賴于單基因功能，增強(qiáng)某種作物抗性品質(zhì)同時破壞了對其他脅迫的抗性，并以降低作物的產(chǎn)量和品質(zhì)為代價。而結(jié)合表觀遺傳學(xué)特性的新型育種則可能將親代植物獲得的系統(tǒng)性抗性穩(wěn)定傳遞給子代，有效避免傳統(tǒng)育種的缺陷。

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收稿日期2015-12-28

作者簡介梁文潔(1990- )，女，山東威海人，碩士研究生，研究方向：植物甲基化和去甲基化功能。*通訊作者，副教授，博士，從事丹參雄性不育的分子機(jī)制研究。

基金項(xiàng)目國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(81373908)；陜西省自然科學(xué)基金項(xiàng)目(2015JM3092)；教育部高等學(xué)校博士學(xué)科點(diǎn)專項(xiàng)基金項(xiàng)目(20100204120027)。

中圖分類號S 188

文獻(xiàn)標(biāo)識碼A

文章編號0517-6611(2016)03-115-04