孫 倩， 馬 佺， 劉建軍， 楊細(xì)飛，*

(1.深圳大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，廣東深圳 518060；2.深圳市疾病預(yù)防控制中心，深圳市現(xiàn)代毒理學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東深圳 518055)

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銅暴露對小鼠銅代謝相關(guān)酶表達(dá)及氧化應(yīng)激的影響

孫 倩1， 馬 佺2， 劉建軍2， 楊細(xì)飛1，2*

(1.深圳大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，廣東深圳 518060；2.深圳市疾病預(yù)防控制中心，深圳市現(xiàn)代毒理學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東深圳 518055)

摘要[目的] 研究長期低劑量銅暴露對小鼠海馬組織銅含量、銅代謝相關(guān)酶及氧化應(yīng)激的影響,為深入研究低劑量銅暴露的神經(jīng)毒性作用提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。[方法]選擇野生型小鼠，隨機(jī)分為對照組和試驗(yàn)組對照組小鼠飲用蒸餾水，試驗(yàn)組在飲用水中添加0.13 mg/L氯化銅,連續(xù)飲用3個(gè)月,研究長期低劑量銅暴露對小鼠海馬組織中銅含量、銅代謝相關(guān)酶表達(dá)及氧化應(yīng)激的影響。[結(jié)果]與對照組相比,試驗(yàn)組小鼠海馬中的自由銅及結(jié)合銅含量均顯著升高，而鐵、鋅、鈣離子含量在海馬中均無顯著差異；與對照組相比，試驗(yàn)組小鼠海馬組織中銅藍(lán)結(jié)合蛋白表達(dá)顯著降低，蛋白硝基酪氨酸水平顯著升高，8-羥基脫氧鳥嘌呤熒光表達(dá)水平顯著升高。[結(jié)論]長期超低劑量銅暴露可導(dǎo)致銅在腦組織中聚集，但不影響鐵、鋅、鈣和鎂的含量；長期低劑量銅暴露可導(dǎo)致氧化應(yīng)激。

關(guān)鍵詞銅；低劑量；海馬組織；氧化應(yīng)激

Effects of Copper Exposure on Copper Metabolism-related Enzyme Expression and Oxidative Stress of Mice

SUN Qian1,MA Quan2,LIU Jian-jun2,YANG Xi-fei1,2*(1.College of Life Science,Shenzhen University,Shenzhen,Guangdong 518086; 2.Key Laboratory of Modern Toxicology of Shenzhen,Shenzhen Center for Disease Control and Prevention,Shenzhen,Guangdong 518055)

Abstract[Objective] To explore the effects of long-term low level copper exposure on copper concentration,copper metabolism-related enzyme expression and oxidative stress in mice,and to provide basic data for further exploring neurotoxicity of low level copper exposure.[Method] Wide-type (WT) mice were randomly divided into the control group and test group.The mice in control group were provided with drinking water,while mice in test group were given drinking water containing 0.13 mg/L copper chloride for a period of three months.Effects of long-term copper exposure at low level on the copper concentration,oxidative stress and copper metabolism related enzymes were researched.[Result] Compared with control group,free copper and protein binding copper were significantly increased in hippocampus of mice in test group; but the contents of iron,zinc and calcium showed no significant differences.Long-term low levels of copper exposure significantly decreased the expression level of blue copper-binding protein,but increased the levels of nitrotyrosine and 8-OHdG in hippocampus of mice.[Conclusion] Long-term copper exposure at low levels can lead to accumulation of copper but do not affect the content of iron,zinc,calcium and magnesium in the brain,and can cause oxidative stress.

Key wordsCopper; Low level; Hippocampus; Oxidative stress

銅是維持人體正常生理功能至關(guān)重要的微量元素，對嬰兒生長、機(jī)體免疫功能形成、腦組織發(fā)育等都具有重要作用。正常成人每天從食物中攝取的銅約2～4 mg/d,吸收部位主要在胃部和小腸上部。銅離子進(jìn)入血液后先與白蛋白疏松結(jié)合,其中90%～98%被運(yùn)送至骨髓、肝臟、腦等部位,用以合成血漿銅藍(lán)蛋白及細(xì)胞色素氧化酶、超氧化物歧化酶、酪氨酸酶等[1]；僅有約5%與白蛋白或組氨酸和多肽疏松結(jié)合,其中大部分經(jīng)膽道系統(tǒng)排泄,極少數(shù)由尿中排出。正常人血漿銅濃度約為15 μmol/L，血漿游離銅(非銅藍(lán)蛋白結(jié)合銅)濃度過高會使銅代謝失衡[2-3]，導(dǎo)致器官受到損害(如神經(jīng)系統(tǒng)損傷)。

銅在腦中主要分布在海馬、基底核、小腦和突觸膜等區(qū)域，并與許多中樞神經(jīng)系統(tǒng)酶的功能相關(guān)。通過銅蓄積可以導(dǎo)致銅中毒，如肝豆?fàn)詈俗冃?Wilson病)、印度兒童肝硬化和原發(fā)性銅中毒[4]；此外，血清游離銅的升高[5]和銅藍(lán)結(jié)合蛋白(Cp)合成的減少[6]也與神經(jīng)退行性疾病相關(guān)。通過流行病學(xué)調(diào)查和動物試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，銅代謝失衡還直接或間接地參與一些神經(jīng)退行性疾病的發(fā)病機(jī)理，如帕金森病、阿爾茨海默氏癥、血漿銅藍(lán)蛋白缺乏癥、亨廷頓病等。Morris等[7]發(fā)現(xiàn)飲食中富含飽和脂肪、反式脂肪以及較高的銅攝入會加快認(rèn)知能力的下降。臨床上應(yīng)用氯碘羥喹和D-青霉胺等各種銅鰲合劑促進(jìn)銅的排出，發(fā)現(xiàn)銅鰲合劑可以顯著改善老年癡呆患者認(rèn)知功能的下降[8]。

近年來，國內(nèi)外對銅毒性的研究大多集中在高劑量銅暴露后引起的毒性效應(yīng)。然而，實(shí)際生活中如此高劑量的銅暴露很少發(fā)生，而關(guān)于低劑量的銅暴露(相當(dāng)于人類日常銅攝入劑量的銅暴露)對神經(jīng)系統(tǒng)的潛在毒性作用尚未見報(bào)道。筆者研究了長期低劑量銅暴露對小鼠海馬組織中銅含量、銅代謝相關(guān)酶表達(dá)和氧化應(yīng)激的影響，以期為長期低劑量銅暴露導(dǎo)致的神經(jīng)毒性研究提供基礎(chǔ)性資料。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1實(shí)驗(yàn)動物。野生型小鼠(B6129SF2/J)，購自美國 Jackson實(shí)驗(yàn)室。試驗(yàn)所用小鼠在SPF級環(huán)境飼養(yǎng)，每籠飼養(yǎng)4只小鼠，食物及飲用水充足，環(huán)境溫度穩(wěn)定，12 h晝夜交替。動物試驗(yàn)及飼養(yǎng)均符合實(shí)驗(yàn)動物飼養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)。

1.1.2試劑與儀器。

1.1.2.1試劑。氯化銅(SIGMA公司)、Tris-鹽酸緩沖液(pH 7.4)；銅藍(lán)結(jié)合蛋白抗體(Abcam,美國)、蛋白硝基酪氨酸(Nitrotyrosine)(Santa Cruz,美國)、8-羥基脫氧鳥嘌呤(8-OHdG)(Abcam,美國)、兔抗鼠二抗(Thermo,美國)、熒光二抗(Thermo,美國)、辣根過氧化物酶(Horseradish peroxidase,HRP);DAPI和抗熒光淬滅劑，均購自北京中杉金橋生物科技公司。

1.1.2.2耗材與儀器。超濾管(EMD Millipore，美國)、ICP-MS(Agilent Technologies 7700 Series，美國)、激光共聚焦顯微鏡(Leica，德國)。

1.2方法

1.2.1小鼠分組及染毒。選擇3月齡野生型小鼠,將小鼠隨機(jī)分為2組:對照組及試驗(yàn)組(低劑量銅暴露組),每組各8只小鼠。試驗(yàn)組小鼠以自由飲水的方式飲用含銅水,對照組小鼠飲用蒸餾水,處理時(shí)間為3個(gè)月。

1.2.2海馬組織中銅含量的測定。經(jīng)銅暴露后處死小鼠，分離小鼠海馬組織并收集于EP管中備用。然后，加入50 mmol/L的Tris-鹽酸緩沖液(pH 7.4)，將混合液移置超濾管中并以100 000 g離心60 min。將適量氯化銅溶于蒸餾水中配制成濃度為0.13 mg/L的水溶液,且每周新鮮配制。分子量大于3 ku的蛋白結(jié)合銅留在超濾管中，分子量小于3 ku的自由銅及其他金屬離子則在收集管中。樣品檢測前需進(jìn)行消解，預(yù)處理后采用ICP-MS進(jìn)行檢測，質(zhì)譜儀根據(jù)離子的質(zhì)荷比進(jìn)行分離并進(jìn)行定性與定量分析。

1.2.3免疫印跡法檢測蛋白表達(dá)量的變化。部分小鼠海馬組織在銅暴露處理后被摘取，并提取其總蛋白進(jìn)行定量。利用10%SDS-PAGE凝膠電泳，將蛋白轉(zhuǎn)至聚偏氟乙烯(PVDF)膜，室溫下以5%脫脂奶粉搖床封閉2 h；然后，加入相應(yīng)比例的一抗Cp(1∶1 000)和蛋白硝基酪氨酸(1∶200)，以β-actin(1∶500)作為內(nèi)參于4 ℃條件下過夜；用TBST漂洗PVDF 膜3次，每次10 min，取出PVDF膜后加入辣根過氧化物酶(Horseradish peroxidase,HRP)標(biāo)記兔抗鼠二抗(1∶3 000)；37 ℃下孵育1 h，TBST 洗膜后化學(xué)發(fā)光顯影曝光。使用Image Quant TL軟件分析各條帶灰度值。

1.2.4免疫熒光檢測小鼠海馬組織CA1和CA3區(qū)8-OHdG。處理時(shí)間結(jié)束后，部分小鼠用4%多聚甲醛心臟灌注固定，摘取大腦并置于固定液中36~48 h。常規(guī)石蠟包埋，行冠狀位連續(xù)切片(4 μm)，石蠟切片常規(guī)脫蠟后切片于0.3%TritonX-100室溫孵育促滲15 min，然后進(jìn)行抗原修復(fù)處理并用3% BSA封閉30 min，完成后滴加8-羥基脫氧鳥嘌呤(8-OHdG)兔抗鼠一抗(1∶1 000)，4 ℃條件下過夜，TBST漂洗3 次，每次5 min，滴加熒光二抗(1∶1 000)室溫避光孵育2 h。洗去抗體后，再用DAPI復(fù)染。最后，用抗熒光淬滅劑封片后，使用激光共聚焦顯微鏡進(jìn)行觀察。

1.2.5數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析。使用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件對試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)與分析，結(jié)果均以平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤表示。組間比較采用t檢驗(yàn)，P< 0.05表示差異顯著。

2結(jié)果與分析

2.1低劑量銅暴露對海馬自由銅、結(jié)合銅及相關(guān)金屬含量的影響從表1可以看出，與對照組相比，低劑量銅暴露處理的試驗(yàn)組小鼠海馬組織中自由銅和結(jié)合銅含量均顯著上升(P<0.05)，而低劑量銅暴露處理的試驗(yàn)組小鼠海馬中鐵、鋅、鈣、鎂離子含量與對照組均無顯著差異。

表1　銅暴露對小鼠海馬組織中自由銅、結(jié)合銅及相關(guān)金屬含量的影響

注：*表示與對照組差異顯著(P<0.05)。

Note:* indicated significant differences with control group (P<0.05).

2.2銅暴露對銅代謝相關(guān)酶表達(dá)的影響從圖1可以看出，在內(nèi)參蛋白表達(dá)量一致的前提下，與對照組相比，低劑量銅暴露處理試驗(yàn)組的Cp表達(dá)顯著降低(P<0.05)。

注：*表示與對照組差異顯著(P<0.05)。Note:Compared with control group,* indicated significant differences (P<0.05).圖1　銅暴露對銅代謝相關(guān)酶表達(dá)的影響Fig.1　Effects of copper exposure on the expression of metabolism related enzymes

2.3銅暴露對氧化應(yīng)激指標(biāo)的影響從圖2可以看出，低劑量銅暴露試驗(yàn)組小鼠蛋白硝基酪氨酸水平顯著增加(P<0.05)。從圖3可以看出，與對照組相比，低劑量銅暴露處理的試驗(yàn)組小鼠8-OHdG熒光強(qiáng)度顯著增強(qiáng) (P<0.05)，說明8-OHdG的水平顯著升高。這些結(jié)果表明長期低劑量銅暴導(dǎo)致小鼠海馬組織氧化應(yīng)激增強(qiáng)。

注：*表示與對照組差異顯著(P<0.05)。Note:Compared with control group,* indicated significant differences (P<0.05).圖2　銅暴露對氧化應(yīng)激指標(biāo)的影響Fig.2　Effects of copper exposure on the index of oxidative stress

注：A.CA1區(qū)；B.CA3區(qū)?！　　ote:A.CA1 region; B.CA3 region.圖3　各組小鼠海馬組織CA1和CA3區(qū)8-OHdG的免疫熒光檢測Fig.3　Immunofluorescence analysis of 8-OHdG in CA1 and CA3 regions of mice hippocampus

3討論與結(jié)論

銅可引起神經(jīng)退行性變，導(dǎo)致學(xué)習(xí)和記憶損傷等多種神經(jīng)毒性作用[9]。當(dāng)銅代謝失衡時(shí)可以造成活性氧、活性氮的生成，從而造成持續(xù)的氧化應(yīng)激反應(yīng)，從而導(dǎo)致神經(jīng)元凋亡等神經(jīng)退行性病變[10]。

近年來，低劑量的銅暴露引起的毒性作用越來越受到關(guān)注。Sparks等[11]研究發(fā)現(xiàn)低劑量銅暴露能增加高膽固醇飲食的兔子腦中β淀粉樣蛋白增多。隨后，又在自發(fā)血膽固醇升高的兔子模型、高膽固醇飼養(yǎng)的比格犬以及PS1-APP轉(zhuǎn)基因小鼠模型中得到了驗(yàn)證[5]。Singh等[12]研究發(fā)現(xiàn)低劑量銅暴露后銅能通過低密度脂蛋白相關(guān)蛋白1來調(diào)節(jié)正常健康小鼠腦中Aβ穿過血腦屏障，從而大量積累形成淀粉斑，最終產(chǎn)生神經(jīng)毒性。

然而，這些研究仍未對低劑量的銅暴露后是否會引起腦組織中不同形態(tài)的銅含量的變化以及是否會導(dǎo)致銅代謝相關(guān)酶的變化等基礎(chǔ)性問題進(jìn)行探討。該研究表明長期低劑量銅暴露的小鼠海馬組織中自由銅和結(jié)合銅水平均顯著高于對照組，說明非常低劑量的長期銅暴露亦可引起銅在小鼠海馬組織中的聚集。通過檢測海馬中Cp的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)Cp表達(dá)顯著降低，說明長期低劑量銅暴露可以顯著影響銅代謝的變化，銅代謝相關(guān)酶的表達(dá)變化可能解釋了銅暴露后腦中非蛋白結(jié)合銅，即游離銅含量顯著升高的原因。筆者還通過檢測氧化應(yīng)激損傷的敏感標(biāo)志物(即蛋白硝基酪氨酸和8-OHdG)，發(fā)現(xiàn)二者的水平均均顯著提高，說明非常低劑量的銅暴露亦可導(dǎo)致小鼠腦組織發(fā)生氧化應(yīng)激反應(yīng)，引起神經(jīng)毒性作用。研究發(fā)現(xiàn)長期低劑量銅暴露可導(dǎo)致銅在腦組織中聚集，自由銅和結(jié)合銅的水平均顯著升高，并導(dǎo)致氧化應(yīng)激。該研究結(jié)果可為深入研究低劑量銅暴露引起的神經(jīng)毒性提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

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收稿日期2015-12-24

作者簡介孫倩(1991-)，女，廣東深圳人，碩士研究生，研究方向：生態(tài)毒理學(xué)。*通訊作者，研究員，博士，從事現(xiàn)代毒理學(xué)研究。

基金項(xiàng)目廣東省自然科學(xué)基金項(xiàng)目(2014A030313715)；深圳市科技研發(fā)基金基礎(chǔ)研究項(xiàng)目(JCYJ20130329103949650)。

中圖分類號S 865.1+3

文獻(xiàn)標(biāo)識碼A

文章編號0517-6611(2016)03-022-03