嚴(yán) 帆，方平平，靳衛(wèi)亞

(安徽師范大學(xué)花津校區(qū)，安徽蕪湖 241000)

?

蔓越橘植物性化學(xué)物質(zhì)與亞鐵離子螯合作用對(duì)細(xì)菌生長(zhǎng)的影響

嚴(yán) 帆，方平平，靳衛(wèi)亞

(安徽師范大學(xué)花津校區(qū)，安徽蕪湖 241000)

摘要[目的]探討蔓越橘汁中植物性化學(xué)物質(zhì)與生長(zhǎng)環(huán)境中亞鐵離子的螯合作用是否為蔓越橘汁抑菌的主要因素。[方法]采用革蘭氏陽(yáng)性菌金黃色葡萄球菌和革蘭氏陰性菌大腸桿菌為對(duì)象，乙二胺四乙酸(EDTA)為參照物，利用平板涂布方法研究蔓越橘植物性化學(xué)物質(zhì)與亞鐵離子螯合作用對(duì)細(xì)菌生長(zhǎng)的影響。[結(jié)果]隨著亞鐵離子溶液濃度的提高，蔓越橘汁固相萃取物組金黃色葡萄球菌和大腸桿菌的生長(zhǎng)曲線相對(duì)低于EDTA組，甚至出現(xiàn)過(guò)量亞鐵離子抑制細(xì)菌生長(zhǎng)的現(xiàn)象。[結(jié)論]蔓越橘汁的抑菌原理主要來(lái)源于植物性多酚物質(zhì)對(duì)細(xì)菌的作用，而非間接的與亞鐵離子螯合作用。

關(guān)鍵詞蔓越橘；金黃色葡萄球菌；大腸桿菌；EDTA

Effects of Sequestration of Cranberry Phytochemicals and Iron Ion on the Growth of Bacteria

YAN Fan, FANG Ping-ping, JIN Wei-ya( Huajin Campus of Anhui Normal University, Wuhu, Anhui 241000)

Abstract[Objective] To determine whether sequestration of cranberry phytochemicals and iron ion was the main factor affecting the bacteriostasis of cranberry juice. [Method] With Gram-positive bacteriaStaphylococcusaureusand Gram-negative bacteriaEscherichiacolias the research materials and EDTA as reference substance, effects of sequestration of cranberry phytochemicals and iron ion on bacteria growth were researched by spread-plate method. [Result] With the increase of iron ion concentration, the growth speeds ofS.aureusandE.coliin solid phase extraction (SPE) of cranberry juice was lower than those in EDTA group; excessive iron ion even inhibited the growth of bacteria. [Conclusion] The main bacteriostasis mechanism of cranberry juice is the effects of plant polyphenols on bacteria, but not the sequestration with iron ion.

Key wordsCranberry;S.aureus;E.coli; EDTA

蔓越橘(Vacciniummacrocarpon)為杜鵑花科越橘屬常綠灌木，主要生長(zhǎng)在北半球暖溫帶且土質(zhì)為酸性泥炭土的山丘或平原中[1]。蔓越橘的營(yíng)養(yǎng)成分種類(lèi)多、含量高，并且果實(shí)中含有多種生物活性成分，具有多種保健功能。蔓越橘在保護(hù)視力、控制尿路感染、預(yù)防血栓和動(dòng)脈硬化、維持正常血壓等方面具有較好效果[2]。關(guān)于蔓越橘能夠有效抑制細(xì)菌生長(zhǎng)的研究常有報(bào)道[3-6]，但關(guān)于其抑菌機(jī)理的研究鮮有報(bào)道。為此，筆者以革蘭氏陽(yáng)性菌金黃色葡萄球菌和革蘭氏陰性菌大腸桿菌為研究對(duì)象，探究了蔓越橘植物性化學(xué)物質(zhì)與亞鐵離子螯合作用對(duì)細(xì)菌生長(zhǎng)的影響，以期為蔓越橘汁的抑菌機(jī)理研究提供理論依據(jù)。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1研究對(duì)象。 蔓越橘汁(Ocean Spray，美國(guó))于2014年3月通過(guò)郵寄方式從澳大利亞墨爾本當(dāng)?shù)爻匈?gòu)買(mǎi)。革蘭氏陽(yáng)性菌金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)純菌種(ATCC 25923)和革蘭氏陰性菌大腸桿菌(Escherichiacoli)純菌種(ATCC 25922)均取自安徽師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院菌種保藏實(shí)驗(yàn)室。

1.1.2主要試劑。營(yíng)養(yǎng)肉湯(NB)、貝爾德帕克瓊脂(BPA)和胰蛋白胨大豆瓊脂培養(yǎng)基(TSA)等均購(gòu)自浙江杭州天和微生物試劑有限公司；C18固相萃取(SPE)柱購(gòu)自愛(ài)爾蘭Waters公司。

1.1.3主要儀器。XFS-280A手提式壓力蒸汽滅菌鍋由浙江新豐醫(yī)療器械有限公司生產(chǎn)； SF-CJ-2B超凈工作臺(tái)由上海三發(fā)科學(xué)儀器有限公司生產(chǎn)； LHP-250恒溫培養(yǎng)箱由上海三發(fā)科學(xué)儀器有限公司生產(chǎn)；RE型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀由上海亞榮生化儀器廠生產(chǎn)。

1.2方法

1.2.1蔓越橘汁的濃縮。量取50.0 mL甲醇和100.0 mL蒸餾水潤(rùn)洗SPE柱，過(guò)濾300.0 mL蔓越橘汁。過(guò)濾時(shí)，蔓越橘汁有機(jī)物質(zhì)和糖分與酚類(lèi)物質(zhì)分離，酚類(lèi)物質(zhì)回收在100.0 mL甲醇溶液中，形成酚類(lèi)物質(zhì)甲醇洗脫液。酚類(lèi)物質(zhì)甲醇洗脫液用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀在55 ℃下蒸發(fā)至回收裝置中至不再有甲醇滴下為止，在室溫下用100.0 mL滅菌水溶解殘留物，得到總酚含量3倍濃縮的樣液。該樣液用10%氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH至中性，采用0.2 μm一次性針頭濾器膜過(guò)濾，4 ℃儲(chǔ)存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2線性關(guān)系的考察。稱(chēng)取(0.110±0.001) g沒(méi)食子酸(GA，相對(duì)分子質(zhì)量188.14)，于100.0 mL容量瓶中溶解并定容，搖勻。用移液管分別移取1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0 mL沒(méi)食子酸標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液于100.0 mL容量瓶中，用水定容，搖勻，濃度分別為10、20、30、40、50、60 μg/mL。用移液管分別移取沒(méi)食子酸工作液、水及測(cè)試液各1.0 mL于刻度試管中，在每個(gè)試管中分別加入5.0 mL福林酚試劑，搖勻。反應(yīng)5 min后，加入4.0 mL 7.5%碳酸鈉溶液，加水定容，搖勻。置于25 ℃恒溫水浴鍋中60 min，顯色后于765 nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度，繪制濃度與吸光度的標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.3培養(yǎng)基的配制。稱(chēng)取NB干粉22.000 g，加入蒸餾水1 000.0 mL溶解，分裝8.0 mL NB溶液至透明試劑小瓶中，121 ℃高壓滅菌30 min，常溫冷卻后，4 ℃儲(chǔ)存?zhèn)溆?。稱(chēng)取BPA干粉58.000 g，加熱攪拌溶解于1 000.0 mL 蒸餾水中，121 ℃高壓滅菌15 min，冷卻至50 ℃左右，于培養(yǎng)基中加入常溫解凍的卵黃亞碲酸鉀增菌劑50.0 mL 搖勻后傾入無(wú)菌平皿。使用前在冰箱貯存不超過(guò)48 h。稱(chēng)取TSA干粉40.000 g，加熱攪拌溶解于1 000.0 mL蒸餾水中，121 ℃高壓滅菌15 min，常溫冷卻后，4 ℃儲(chǔ)存?zhèn)溆?。稱(chēng)取氯化鈉9.000 g溶于1 000.0 mL蒸餾水中，分裝9.0 mL 生理鹽水溶液至透明試劑小瓶中，121 ℃高壓滅菌30 min，常溫冷卻后，4 ℃儲(chǔ)存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.4細(xì)菌活化。分別挑取金黃色葡萄球菌和大腸桿菌放入滅菌后的NB小瓶中，搖勻，37 ℃恒溫培養(yǎng)24 h。對(duì)活化后的金黃色葡萄球菌和大腸桿菌進(jìn)行梯度稀釋?zhuān)?jì)算原菌液濃度，再配制濃度為6 log cfu/mL的菌懸液備用。

1.2.5對(duì)照試驗(yàn)。根據(jù)表1設(shè)置不同的對(duì)照試驗(yàn)，包括：蔓越橘汁SPE和不同濃度的亞鐵離子(Fe2+)溶液對(duì)金黃色葡萄球菌生長(zhǎng)的影響；蔓越橘汁SPE和不同濃度的亞鐵離子溶液對(duì)大腸桿菌生長(zhǎng)的影響；EDTA和不同濃度的亞鐵離子溶液對(duì)金黃色葡萄球菌生長(zhǎng)的影響；EDTA和不同濃度的亞鐵離子溶液對(duì)大腸桿菌生長(zhǎng)的影響。每組分別在0、3.5、7、24 h進(jìn)行細(xì)菌平板涂布試驗(yàn)，37 ℃恒溫培養(yǎng)24~48 h。每個(gè)梯度做3個(gè)平行試驗(yàn)。結(jié)果均以log cfu/mL為單位基數(shù)表示。

表1　蔓越橘汁與亞鐵離子濃度對(duì)金黃色葡萄球菌和大腸桿菌生長(zhǎng)影響的試驗(yàn)設(shè)計(jì)

注：*10 μL在10 mL的體系中只占1/1 000，對(duì)體積的影響可忽略不計(jì)。

Note：* 10 μL was only 1/1 000 of the 10 mL system，the impacts of which could be neglected.

1.2.6數(shù)據(jù)處理。結(jié)果計(jì)為平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差。運(yùn)用SPSS16.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析(ANOVA)，計(jì)算LSD，分析樣品間差異顯著性。

2結(jié)果與分析

圖1　沒(méi)食子酸標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1　Standard curve of garlic acid

2.1蔓越橘汁植物性總多酚含量測(cè)定結(jié)果經(jīng)過(guò)SPE柱洗脫后，蔓越橘汁中糖、VC等極性分子被移除，經(jīng)氫氧化鈉調(diào)節(jié)至pH中性后，蔓越橘汁SPE主要成分為植物性多酚。由圖1可知，沒(méi)食子酸濃度為1~6 μg/mL時(shí)，與吸光度成良好的線性關(guān)系，線性回歸方程為：y=0.167 7x+0.125 5，相關(guān)系數(shù)R2=0.999 4。采用福林酚法測(cè)得濃縮3倍后的蔓越橘汁SPE植物多酚含量為(967±1)μg GAE/mL，原蔓越橘汁植物總多酚含量為(293±1)μg GAE/mL，植物性總多酚回收率高達(dá)91%，測(cè)量結(jié)果與前人研究[7]相符合。

2.2蔓越橘汁SPE抑制細(xì)菌生長(zhǎng)測(cè)定結(jié)果由圖2可知，與相應(yīng)對(duì)照組對(duì)比，蔓越橘SPE抑制金黃色葡萄球菌和大腸桿菌的生長(zhǎng)分別達(dá)0.847和1.087 log cfu/mL(P<0.05)。隨著亞鐵離子溶液濃度的增加，金黃色葡萄球菌的生長(zhǎng)所有增加，但無(wú)顯著差異。CE2、CE3和CE4組中大腸桿菌生長(zhǎng)曲線與金黃色葡萄球菌走勢(shì)趨同(P> 0.05)，但CE5并未達(dá)到預(yù)期增加大腸桿菌增長(zhǎng)的效果，培養(yǎng)24 h后反而比CE4降低了0.430 log cfu/mL。

2.3EDTA抑制細(xì)菌生長(zhǎng)測(cè)定結(jié)果與相應(yīng)對(duì)照組對(duì)比，10 mmol/L EDTA 溶液抑制金黃色葡萄球菌和大腸桿菌生長(zhǎng)分別達(dá)1.403和1.229 log cfu/mL(P<0.05)。金黃色葡萄球菌和大腸桿菌活菌數(shù)隨著亞鐵離子溶液濃度的增加而顯著增加，1 mmol/L 亞鐵離子處理組與對(duì)照組菌落數(shù)接近(P>0.05)，2 mmol/L 亞鐵離子處理組比對(duì)照組分別增加了0.211和0.169 log cfu/mL(圖3)。

注：A.金黃色葡萄球菌；B.大腸桿菌。Note：A.S.aureus; B.E.coli.圖2　蔓越橘SPE和不同濃度亞鐵離子溶液對(duì)細(xì)菌金黃色葡萄球菌和大腸桿菌生長(zhǎng)的影響Fig.2　Effects of cranberry SPE and Fe2+ concentration on the growth of S.aureus and E.coli

注：A.金黃色葡萄球菌；B.大腸桿菌。Note：A.S.aureus; B.E.coli.圖3　EDTA和不同濃度亞鐵離子溶液對(duì)細(xì)菌金黃色葡萄球菌和大腸桿菌生長(zhǎng)的影響Fig.3　Effects of EDTA and Fe2+ concentration on the growth of S.aureus and E.coli

3結(jié)論與討論

3.1結(jié)論蔓越橘汁的抑菌原理主要來(lái)源于植物性多酚物質(zhì)對(duì)細(xì)菌的作用，而非間接的與亞鐵離子螯合作用。

3.2討論在有氧生長(zhǎng)條件下，鐵離子在多數(shù)細(xì)菌生長(zhǎng)過(guò)程中起重要作用[8]，也是滅菌過(guò)程中的一種重要限制營(yíng)養(yǎng)素[9]。蔓越橘汁中植物性總多酚物質(zhì)包含黃酮類(lèi)、原花青素和花青素，它們都含有1個(gè)或多個(gè)能夠和亞鐵離子發(fā)生強(qiáng)烈螯合作用的鄰位雙羥基多酚氫氧化基團(tuán)[8，10]。因此，多酚物質(zhì)與亞鐵離子的螯合作用可能是抑制細(xì)菌生長(zhǎng)的原理被假設(shè)[10-12]。蔓越橘汁中有的多酚物質(zhì)含有不止1個(gè)可以與鐵離子發(fā)生螯合作用的基團(tuán)，這些基團(tuán)可能與鐵離子發(fā)生螯合作用從而導(dǎo)致細(xì)菌生長(zhǎng)過(guò)程中鐵離子不足，發(fā)生抑制細(xì)菌生長(zhǎng)的現(xiàn)象。該研究表明，蔓越橘汁植物性多酚物質(zhì)可有效抑制革蘭氏陽(yáng)性金黃色葡萄球菌和革蘭氏陰性大腸桿菌，與其他文獻(xiàn)數(shù)據(jù)類(lèi)似[3，7-8]。

鐵離子缺乏情況下，細(xì)菌可產(chǎn)生4種在周?chē)h(huán)境中尋找鐵離子的鐵載體。然而，強(qiáng)效的鐵離子螯合劑EDTA加入細(xì)菌的生長(zhǎng)環(huán)境中，迅速吸收亞鐵離子，從而導(dǎo)致細(xì)菌生長(zhǎng)環(huán)境鐵離子缺乏產(chǎn)生抑菌現(xiàn)象[7]。該研究表明，加入過(guò)量亞鐵離子后，細(xì)菌菌落數(shù)有回升跡象，表明EDTA與亞鐵離子螯合作用是抑制細(xì)菌生長(zhǎng)的主要機(jī)理。

該研究還發(fā)現(xiàn)，隨著亞鐵離子溶液濃度的提高，加入蔓越橘汁SPE組的金黃色葡萄球菌和大腸桿菌的生長(zhǎng)曲線并不如EDTA組中生長(zhǎng)迅速，甚至出現(xiàn)過(guò)量亞鐵離子抑制細(xì)菌生長(zhǎng)的現(xiàn)象。已有文獻(xiàn)證明，多酚物質(zhì)可以引起革蘭氏陰性細(xì)菌外細(xì)胞膜局部瓦解，導(dǎo)致細(xì)胞質(zhì)外滲死亡[9，13]；多酚物質(zhì)進(jìn)入細(xì)菌菌體內(nèi)，與DNA物質(zhì)相互作用導(dǎo)致細(xì)菌死亡等[14]。因此，蔓越橘汁的抑菌原理主要來(lái)源于植物性多酚物質(zhì)對(duì)細(xì)菌的作用，而非間接的與亞鐵離子螯合作用。

參考文獻(xiàn)

[1] 楊靜慧，李建科，楊恩芹，等.蔓越莓栽培歷史、現(xiàn)狀及發(fā)展趨勢(shì)[J].天津農(nóng)學(xué)院學(xué)報(bào)，2009，16(3)：44-46.

[2] 衣曉峰.天然抗癌物——蔓越橘[J].抗癌之窗，2010(9)：74.

[3] 王波，連奔，周琦，等.蔓越莓制劑抑制P菌毛陽(yáng)性大腸埃希菌對(duì)紅細(xì)胞黏附作用的研究[J].天津醫(yī)藥，2009，37(9)：743-746.

[4] SHMUELY H，OFEK I，WEISS E I，et al.Cranberry components for the therapy of infectious disease[J].Current opinion in biotechnology，2012，23(2)：148-152.

[6] GUPTA A，DWIVEDI M，MAHDI A A，et al.Inhibition of adherence of multi-drug resistantE.coliby proanthocyanidin[J].Urological research，2012，40(2)：143-150.

[7] HOWELL K，YAN F，TOKICH A，et al.Iron sequestration is not the main mechanism in the inhibition ofStaphylococcusaureusgrowth by cranberry phytochemicals[J].Integrative food，nutrition and metabolism，2015，2(3)：184-188.

[8] LIN B，JOHNSON B J，RUBIN R A，et al.Iron chelation by cranberry juice and its impact onEscherichiacoligrowth[J].Biofactors，2011，37(2)：121-130.

[9] LACOMBE A，WU V C H，TYLER S，et al.Antimicrobial action of the American cranberry constituents; phenolics，anthocyanins and organic acids，againstEscherichiacoliO157：H7[J].International journal of food microbial，2010，139(1/2)：102-107.

[10] GUO M，PEREZ C，WEI Y，et al.Iron-binding properties of plant phenolics and cranberry’s bio-effects[J].Dalton transactions，2007，43(43)：4951-4961.

[12] CHUNG K T，LU Z，CHOU M W.Mechanism of inhibition of tannic acid and related compounds on the growth of intestinal bacteria[J].Food chemistry toxicology，1998，36(12)：1053-1060.

[13] WU V C H，QIU X，BUSHWAY A，et al.Antibacterial effects of American cranberry(Vacciniummacrocarpon) concentrate on foodborne pathogens[J].Food science and technology，2008，41(10)：1834-1841.

[14] PUUPPONEN-PIMIR，NOHYNEK L，MEIER C，et al.Antimicrobial properties of phenolic compounds from berries[J].Journal of applied microbiology，2001，90(4)：494-507.

收稿日期2015-12-24

作者簡(jiǎn)介嚴(yán)帆(1988- )，女，安徽蕪湖人，講師，碩士，從事食品微生物、食品化學(xué)研究。

基金項(xiàng)目安徽師范大學(xué)青年教師科研專(zhuān)項(xiàng)(721355)。

中圖分類(lèi)號(hào)S 666.2

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼A

文章編號(hào)0517-6611(2016)03-019-03