王雁南，張 珣

(1.清華大學(xué)附屬實(shí)驗(yàn)學(xué)校，北京 100084；2.中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院植物病理學(xué)系，北京 100193)

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北京紅地球葡萄內(nèi)生菌的種群多樣性分析

王雁南1，張 珣2*

(1.清華大學(xué)附屬實(shí)驗(yàn)學(xué)校，北京 100084；2.中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院植物病理學(xué)系，北京 100193)

摘要[目的]探究北京紅地球葡萄不同部位內(nèi)生菌的種類(lèi)及多樣性。[方法]對(duì)北京市葡萄主產(chǎn)區(qū)種植的紅地球葡萄葉片、果梗、果肉、果皮各部位進(jìn)行內(nèi)生菌的分離、鑒定和多樣性分析。[結(jié)果]紅地球葡萄不同部位的內(nèi)生菌數(shù)量存在差異，果梗中內(nèi)生細(xì)菌數(shù)量最多，果肉中內(nèi)生真菌數(shù)量最多；共分離獲得內(nèi)生細(xì)菌11株，16S rDNA序列鑒定結(jié)果表明果肉中內(nèi)生細(xì)菌種類(lèi)多樣性高于果梗、果皮和葉片，芽孢桿菌屬(Bacillus sp.)在各組織中均有分布；變性梯度凝膠電泳(DGGE)結(jié)果表明不同部位內(nèi)生細(xì)菌菌群存在差異性。[結(jié)論]試驗(yàn)結(jié)果為葡萄內(nèi)生微生態(tài)系統(tǒng)多樣性的深入研究提供了理論依據(jù)。

關(guān)鍵詞葡萄；內(nèi)生菌；多樣性分析

Diversity Analysis of Endophytic Microorganisms of Red Globe Grape in Beijing

WANG Yan-nan1, ZHANG Xun2*(1. The Experimental School Affiliated to Tsinghua University, Beijing 100084; 2. Department of Plant Pathology, Institute of Plant Protection, China Agricultural University, Beijing 100193)

Abstract[Objective] To research the diversity analysis of endophytic microorganisms of red globe grape in Beijing. [Method] We isolated endophytic microorganisms from grape leaves, stems, pulps and peels which were collected from a vineyard in Beijing. Further identification and diversity analysis were carried out. [Result] There were differences in the endophyte number of different parts of red globe grape. Endophytic bacteria were the maximum in stems; and endophytic fungi were the maximum in pulp. A total of 11 endophytic bacteria strains were isolated. Based on the 16S rDNA gene sequence aligment, the species diversity of endophytic bacteria in pulps were higher than that in leaves, stems and peels.Bacillussp. was the dominant genus existed in all the tissues. DGGE profiles further proved the diversity of endophytic microorganisms in different tissues of red globe grape. [Conclusion] This research provides theoretical foundation for the in-depth research on diversity of grape endophytic microorganisms.

Key wordsGrape; Endophyte; Diversity

植物內(nèi)生菌是指能定殖在健康植物體內(nèi)，通常被宿主細(xì)胞膜包圍或是細(xì)胞基質(zhì)包圍，與宿主植物互惠共生的植物體內(nèi)所有腐生、寄生和共生微生物的統(tǒng)稱(chēng)，包括真菌、細(xì)菌和放線(xiàn)菌[1]。植物內(nèi)生菌是植物微生態(tài)系統(tǒng)中一個(gè)重要的組成部分，具有一定的特異性、區(qū)域性和層次性。內(nèi)生菌由于具有在植物體內(nèi)獨(dú)立自主的分裂繁殖和傳遞的特性，可能成為生物防治中有潛力的微生物農(nóng)藥和增產(chǎn)菌。目前，植物微生態(tài)系統(tǒng)多樣性的研究已有很多報(bào)道，但多半集中在植物根際(圍)和葉圍微生物系統(tǒng)的研究上，對(duì)植株體內(nèi)微生物多樣性的研究較少，特別是葡萄內(nèi)生微生物系統(tǒng)的研究尚未見(jiàn)報(bào)道。

變性梯度凝膠電泳(DGGE)是Fischer等于1983年提出的用于檢測(cè)點(diǎn)突變的一種電泳技術(shù)，Muyzer等于1993年首次將其應(yīng)用于微生物群落結(jié)構(gòu)研究[2]。目前，該技術(shù)已被廣泛用于多種環(huán)境介質(zhì)的微生物生態(tài)學(xué)研究，成為研究微生物群落結(jié)構(gòu)的主要分子生物學(xué)方法之一。國(guó)內(nèi)對(duì)微生物種群結(jié)構(gòu)的研究以DGGE、T-RFLP為主[3]。鑒于此，筆者采用DGGE技術(shù)研究了北京紅地球葡萄不同部位內(nèi)生菌的種類(lèi)及多樣性，旨在為葡萄內(nèi)生微生態(tài)系統(tǒng)多樣性的深入研究提供理論依據(jù)。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1供試材料。紅地球葡萄健康植株的葉片和果實(shí)采自北京市昌平區(qū)乃干屯紅地球葡萄園。

1.1.2培養(yǎng)基。TSA培養(yǎng)基(胰蛋白胨15 g，大豆蛋白胨5 g，NaCl 10 g，瓊脂粉15 g，水1 L)用于內(nèi)生細(xì)菌的分離；PDA培養(yǎng)基(馬鈴薯200 g，葡萄糖20 g，瓊脂粉15 g，水1 L)用于內(nèi)生真菌的分離。

1.2方法

1.2.1分離材料的表面消毒。分別選取成熟期紅地球葡萄健康植株的葉片、果實(shí)和果梗，各組織經(jīng)流水沖洗后用70%乙醇浸30 s，再分別用2%次氯酸鈉溶液處理5 min，無(wú)菌水沖洗4次，最后一次沖洗液涂TSA、PDA平板，28 ℃培養(yǎng)3 d，檢測(cè)表面消毒效果。所有樣品采集后立即帶回實(shí)驗(yàn)室處理，在6 h內(nèi)完成分離試驗(yàn)。

1.2.2內(nèi)生菌的分離與純化。取表面消毒徹底的材料，用無(wú)菌的鑷子分離果實(shí)的果皮和果肉，分別稱(chēng)量葉片、果梗、果肉、果皮2.0 g于無(wú)菌研缽中，加18 mL無(wú)菌水和少許無(wú)菌石英砂，研磨成勻漿。取上清液100 μL涂TSA和PDA平板，每個(gè)處理3次重復(fù)，置于28 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)5 d后，計(jì)菌落數(shù)，并挑取菌落形態(tài)不同的具有代表性的單菌落進(jìn)行純化，保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3內(nèi)生細(xì)菌的鑒定。分別提取分離獲得的內(nèi)生細(xì)菌基因組，使用細(xì)菌16S rDNA通用引物63F/1387R擴(kuò)增16S rDNA基因進(jìn)行鑒定[4]，引物序列、擴(kuò)增程序見(jiàn)表1。擴(kuò)增產(chǎn)物由北京博邁德生物有限公司進(jìn)行序列測(cè)定，測(cè)序結(jié)果用NCBI的Blast軟件與GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì)。

1.2.4紅地球葡萄不同部位內(nèi)生總基因組提取。用改良CTAB法提取各組織基因組[5-6]。稱(chēng)取表面消毒的各組織2.0 g，加液氮研磨成粉末狀，加500 μL CTAB提取液和100 μL 20% PVP，充分混勻，65 ℃水浴45 min，每隔10 min顛倒混勻1次，加入等體積(600 μL)氯仿-異戊醇混合液(24∶1，V/V)，充分混勻，室溫12 000 r/min離心20 min，吸取上清液，加等體積-20 ℃預(yù)冷的異丙醇，輕輕顛倒析出DNA，用70%乙醇溶液清洗2次，室溫干燥后，用50 μL ddH2O溶解DNA，置于-20 ℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.5DGGE。采用引物27F/1530R擴(kuò)增細(xì)菌16S rDNA V1~V10區(qū)基因片段，膠回收后，再用引物341F-GC/534R擴(kuò)增16S rDNA的 V3區(qū)基因片段[7]，引物序列見(jiàn)表1，擴(kuò)增產(chǎn)物用試劑盒純化濃縮。DGGE采用聚丙烯酰胺凝膠，變性梯度為35%~65%，每泳道上樣30 μL的V3區(qū)PCR純化產(chǎn)物，電泳條件為：60 ℃，120 V，7 h。

表1　PCR引物序列及擴(kuò)增程序

2結(jié)果與分析

2.1紅地球葡萄不同組織部位內(nèi)生菌數(shù)量差異紅地球葡萄葉片、果梗、果肉、果皮組織中內(nèi)生菌的分離結(jié)果表明，不同組織部位的內(nèi)生菌數(shù)量不同(表2)。同一組織部位分離獲得的內(nèi)生細(xì)菌數(shù)量大于內(nèi)生真菌，果梗中內(nèi)生細(xì)菌數(shù)量最多，為11.90×103cfu/g，其次為果肉(10.33×103cfu/g)，葉片和果皮中數(shù)量較少，分別為2.00×103、1.67×103cfu/g。內(nèi)生真菌以果皮中含菌量最多，為2.33×103cfu/g，其次為果梗(1.33×103cfu/g)，葉片和果肉中內(nèi)生真菌數(shù)量最少。

表2紅地球葡萄不同組織部位內(nèi)生菌數(shù)量

Table 2Population density of endophyte isolated from different tissues of red globe grape

×103 cfu/g

2.2紅地球葡萄不同組織部位內(nèi)生細(xì)菌種類(lèi)差異從北京紅地球葡萄健康植株的葉片、果梗、果肉、果皮中共分離獲得內(nèi)生細(xì)菌11株，16S rDNA序列比對(duì)分析將其鑒定為芽孢桿菌屬、泛菌屬、葡萄球菌屬、微球菌屬4個(gè)細(xì)菌菌群(表3)。不同分離部位內(nèi)生細(xì)菌種類(lèi)存在差異(表4)，果肉中內(nèi)生細(xì)菌種類(lèi)最豐富，其次為果皮，葉片和果梗中種類(lèi)較少。芽孢桿菌屬在各部位均能分離獲得，說(shuō)明芽孢桿菌廣泛存在于成熟期紅地球葡萄健康植株中。

2.3紅地球葡萄不同組織部位內(nèi)生細(xì)菌PCR-DGGE多樣性分析

2.3.1不同組織部位內(nèi)生細(xì)菌16S rDNA基因片段V1~V10區(qū)PCR擴(kuò)增。用改良的CTAB法提取紅地球葡萄各組織總 DNA，以此為模板，采用細(xì)菌16S rDNA V1~V10區(qū)通用引物 27F 和 1530R 擴(kuò)增產(chǎn)物，目的片段大小為1 500 bp(圖1)。

表3紅地球葡萄不同組織部位內(nèi)生細(xì)菌序列16S rDNA鑒定結(jié)果

Table 3Identification of endophytic bacteria isolated from different tissues of red globe grape by 16S rDNA sequence

菌株編號(hào)Strainscode分離部位Isolatedtissue內(nèi)生菌種類(lèi)SpeciesY-1葉片分散泛菌(Pantoeadispersa)Y-2葉片特基拉芽孢桿菌(Bacillustequilensis)G-1果梗泛菌屬(Pantoeasp.)G-3果梗芽孢桿菌屬(Bacillussp.)R-1果肉芽孢桿菌屬(Bacillussp.)R-4果肉葡萄球菌屬(Staphylococcussp.)R-6果肉枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)R-7果肉微球菌屬(Micrococcussp.)P-1果皮解淀粉芽孢桿菌(Bacillusamyloliquefaciens)P-3果皮微球菌屬(Micrococcussp.)P-4果皮枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)

表4紅地球葡萄不同部位內(nèi)生細(xì)菌種類(lèi)數(shù)量

Table 4Species number of endophytic bacteria in different tissues of red globe grape

個(gè)

2.3.2不同組織部位內(nèi)生細(xì)菌16S rDNA基因片段V3區(qū)PCR擴(kuò)增?；厥铡?.3.1”產(chǎn)物并以此為模板，采用細(xì)菌16S rRNA V3區(qū)通用引物341F-GC 和 534R 擴(kuò)增產(chǎn)物，在瓊脂糖凝膠200 bp 處有1條明亮單一的條帶，純度高，可用于下一步試驗(yàn)(圖2)。

2.3.3PCR產(chǎn)物的DGGE分析。由圖3可知，每個(gè)樣品經(jīng)變性梯度凝膠電泳后都分離出數(shù)目不等的電泳條帶，并且各條帶的強(qiáng)度和遷移率各不相同，部分條帶染色強(qiáng)度較高，也有一些弱帶，各樣品之間有共有條帶，也有一些特有條帶。根據(jù)DGGE的分離原理，不同條帶代表不同的細(xì)菌類(lèi)型，說(shuō)明各樣品間存在一些共有的細(xì)菌類(lèi)型，也具有各自特有的細(xì)菌類(lèi)型。由此可見(jiàn)，成熟期紅地球葡萄內(nèi)生細(xì)菌具有較豐富的種群多樣性。

注：1.葉片；2.果梗；3.果肉；4.果皮；5.陰性對(duì)照?！　　ote：1.Leaf；2.Stem；3.Pulp；4.Peel；5.Negative control. 圖1　引物27F/1530R擴(kuò)增紅地球葡萄不同組織部位內(nèi)生細(xì)菌16S rDNA基因片段Fig.1　Segment of 16S rDNA PCR amplification of endophytic bacteria from different tissues of red globe grape by primer 27F/1530R

注：1、2.葉片；3.果梗；4.果肉；5.果皮；6.陰性對(duì)照?！　　ote：1，2.Leaf；3.Stem；4.Pulp；5.Peel；6.Negative control.圖2　引物341F-GC/534R擴(kuò)增紅地球葡萄不同組織部位內(nèi)生細(xì)菌16S rDNA基因片段Fig.2　Segment of 16S rDNA PCR amplification of endophytic bacteria from different tissues of red globe grape by primer 341F-GC/534R

注：P.果皮；R.果肉；G.果梗；Y：葉片?！　　　ote：P.Leaf；R.Pulp；G.Stem；Y.Leaf.圖3　紅地球葡萄不同組織部位內(nèi)生細(xì)菌群落DGGE分離圖譜Fig.3　DGGE separation map of endophytic bacteria from different tissues of red globe grape

3結(jié)論與討論

該研究表明，成熟期北京紅地球葡萄健康植株葉片、果梗、果肉、果皮不同組織部位內(nèi)生細(xì)菌具有多樣性。上述結(jié)果為葡萄內(nèi)生微生態(tài)系統(tǒng)多樣性的深入研究提供了理論依據(jù)。

植物內(nèi)生細(xì)菌數(shù)量與植物的種類(lèi)、基因型、器官、生長(zhǎng)階段和環(huán)境條件等有關(guān)。該研究對(duì)成熟期紅地球葡萄健康植株葉片、果梗、果肉、果皮不同組織內(nèi)生菌的分離結(jié)果顯示，不同組織部位的內(nèi)生菌數(shù)量存在差異，且內(nèi)生細(xì)菌數(shù)量大于內(nèi)生真菌，這與史應(yīng)武等[8-9]對(duì)其他種類(lèi)植物中內(nèi)生菌的研究報(bào)道一致。

對(duì)內(nèi)生細(xì)菌的鑒定結(jié)果表明，芽孢桿菌屬存在于各組織部位的分離樣品中，包括枯草芽孢桿菌、解淀粉芽孢桿菌等，說(shuō)明芽孢桿菌可能是成熟期紅地球葡萄健康植株中廣泛存在的優(yōu)勢(shì)菌屬。植物內(nèi)生菌種類(lèi)不僅受宿主植物自身的影響，植株外部生長(zhǎng)環(huán)境如土壤、溫度、光照、雨水、空氣濕度等，也會(huì)間接影響內(nèi)生菌的分布。目前，研究者認(rèn)為植株內(nèi)生菌的來(lái)源主要有2條途徑：一是來(lái)自根際土壤微生物，經(jīng)根系運(yùn)輸進(jìn)入植株體內(nèi)；一是來(lái)自大氣中微生物，經(jīng)氣孔進(jìn)入植株體內(nèi)[10]。

在微生物群落多樣性的研究中，非培養(yǎng)法獲得的群落結(jié)構(gòu)更接近實(shí)際，其包含了可培養(yǎng)的內(nèi)生細(xì)菌和大量不可培養(yǎng)細(xì)菌的信息，PCR-DGGE技術(shù)是一種較理想的方法。該研究結(jié)果表明，成熟期紅地球葡萄健康植株中不同部位內(nèi)生細(xì)菌具有多樣性，但具體哪些菌群是優(yōu)勢(shì)菌群及不同部位間內(nèi)生細(xì)菌菌群結(jié)構(gòu)的相互關(guān)系還需深入研究。

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收稿日期2016-01-06

作者簡(jiǎn)介王雁南(1998-)，男，北京人，清華大學(xué)附屬實(shí)驗(yàn)學(xué)校高中生。*通訊作者，博士研究生，研究方向：植物病害生物防治。

基金項(xiàng)目農(nóng)業(yè)公益性行業(yè)科研專(zhuān)項(xiàng)(201203035)。

中圖分類(lèi)號(hào)S 432.4+4

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼A

文章編號(hào)0517-6611(2016)03-013-03