朱 捷，葛奉娟，王欲曉

(徐州工程學(xué)院化學(xué)化工學(xué)院，江蘇徐州 221111)

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改進(jìn)的雙波長法測(cè)定二元混合體系中葡萄糖和木糖含量

朱 捷，葛奉娟，王欲曉

(徐州工程學(xué)院化學(xué)化工學(xué)院，江蘇徐州 221111)

摘要[目的]采用改進(jìn)的雙波長法測(cè)定混合糖液中葡萄糖和木糖含量。[方法]采用分光光度法(Douglas法)對(duì)標(biāo)準(zhǔn)糖溶液的糖含量進(jìn)行了測(cè)定，并對(duì)傳統(tǒng)的雙波長法的波長選擇和標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合進(jìn)行了改進(jìn)：通過誤差分析確定測(cè)定波長，對(duì)木糖顯色反應(yīng)在550 nm處的標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行二次方程擬合，使其更適于低濃度木糖的檢測(cè)。[結(jié)果]該方法可同時(shí)測(cè)定混合體系中葡萄糖和木糖的含量，總糖、木糖和葡萄糖測(cè)定的回收率均為94.00%~101.60%，準(zhǔn)確度較高。[結(jié)論]該方法能滿足植物纖維水解液中糖含量的常規(guī)分析要求。

關(guān)鍵詞總糖；葡萄糖；木糖；雙波長分光光度法

Detection of Glucose and Xylose in Duplex Mixture by Improved Dual-wavelength Spectrophotometry

ZHU Jie, GE Feng-juan, WANG Yu-xiao(School of Chemistry and Chemical Engineering, Xuzhou Institute of Technology, Xuzhou, Jiangsu 221111)

Abstract[Objective] To detect the accharide contents of glucose and xylose in duplex mixture by improved dual-wavelength spectrophotometry. [Method] Saccharide content in standard solution was detected by spectrophotometry (Douglas method). The wavelength selection and standard curve fitting were improved in traditional dual-wavelength method: Detection wavelength was detected by error analysis. Quadratic equation fitting of standard curve was carried out at 550 nm, which was more suitable for the detection of low-concentration xylose. [Result] This method could simultaneously detect the glucose and xylose contents in the mixed system. The recovery rates of total sugar, xylose and glucose were all between 94.00% and 101.60%, which had relatively high accuracy. [Conclusion] This method meets the demand of saccharide determination for plant fiber hydrolysis.

Key wordsTotal sugars; Glucose; Xylose; Dual-wavelength spectrophotometry

生化法生產(chǎn)纖維乙醇，也稱第2代燃料乙醇，主要是利用木質(zhì)纖維素原料中的各種糖組分經(jīng)微生物發(fā)酵生產(chǎn)[1-4]。木質(zhì)纖維素原料水解液中糖組分非常復(fù)雜，既含有戊糖(主要是木糖)又含有己糖(主要是葡萄糖)，它們的存在既有單體也有寡聚形式[5]。大多數(shù)天然發(fā)酵生產(chǎn)乙醇的微生物(如酵母菌和運(yùn)動(dòng)發(fā)酵細(xì)菌)只能利用葡萄糖單糖[6]。最近研發(fā)的基因工程菌可以利用戊糖(如木糖)和阿拉伯糖的單糖，有的可以利用纖維二糖發(fā)酵生產(chǎn)乙醇[7]。因此，對(duì)木質(zhì)纖維素原料水解液中葡萄糖和木糖含量的測(cè)定非常重要。

常見的研究定量分析方法有高效液相色譜法(HPLC)、氣相色譜法(GC)、分光光度法(比色法)、滴定法[8-14]。高效液相色譜法的優(yōu)點(diǎn)是水解液中的混合糖組分都能定量分析(主要是葡萄糖和木糖)，但是此方法所用設(shè)備昂貴，分析操作和維護(hù)的成本都較高。氣相色譜法也可以定量分析水解液中的混合糖組分，但需要衍生化，分析時(shí)間也較長。滴定法操作簡單，成本低，但該方法的選擇性較差，無法區(qū)分出混合組分中戊糖和己糖。

分光光度法是實(shí)驗(yàn)室分析糖組分的常用方法，而地衣酚-鹽酸法利用戊糖與濃鹽酸共熱時(shí)降解轉(zhuǎn)變?yōu)榭啡?，后者與3，5-二羥基甲苯(地衣酚)反應(yīng)呈鮮綠色，采用比色法測(cè)定，可用于測(cè)定戊糖含量[15]；苯酚硫酸法利用濃硫酸將糖迅速脫水生成糖醛衍生物，然后與苯酚生成橙黃色化合物，再采用比色法測(cè)定，可用于分析總糖含量[16]；DNS法，即二硝基水楊酸法，是利用堿性條件下二硝基水楊酸(DNS)與還原糖發(fā)生氧化還原反應(yīng)，生成3-氨基-5-硝基水楊酸，該產(chǎn)物在煮沸條件下顯現(xiàn)棕紅色，可以分析總還原糖含量[17]。但是，苯酚硫酸法和DNS法對(duì)己糖和戊糖的選擇性不高，不能分別測(cè)定二者的濃度。地衣酚-鹽酸法對(duì)己糖的響應(yīng)極弱，是一種測(cè)定戊糖濃度的好方法，但無法測(cè)定己糖的濃度。植物纖維水解液中，戊糖以木糖為主，而己糖以葡萄糖為主。筆者選擇Douglas法(間苯三酚-冰醋酸顯色法)，并采用改進(jìn)的雙波長法同時(shí)測(cè)定混合糖液中木糖和葡萄糖的含量。

1材料與方法

1.1儀器與試劑

1.1.1儀器。751型紫外-可見分光光度計(jì)(上海精密科學(xué)儀器有限公司)；水浴鍋；電子天平；磁力加熱攪拌器。

1.1.2試劑。間苯三酚；冰醋酸；無水乙醇；濃鹽酸；葡萄糖；木糖。

1.2標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制分別配制不同濃度的木糖和葡萄糖溶液，木糖濃度分別為1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mmol/L，葡萄糖濃度分別為1.0、3.0、5.0、7.0、9.0 mmol/L。

1.3顯色反應(yīng)按照陳鈞輝[17]的方法配制顯色液。移取1 mL 1 mmol/L或2 mmol/L的木糖或葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液于試管中，加入10 mL顯色液并搖勻，立即放入沸水浴中反應(yīng)，10 min后取出試管，用流水冷卻至室溫，5 min后在分光光度計(jì)上進(jìn)行全波長掃描。以空白樣進(jìn)行相同的顯色反應(yīng)，作為參比。確定測(cè)定波長后，移取1 mL標(biāo)準(zhǔn)溶液或待測(cè)溶液，按照上述步驟進(jìn)行顯色反應(yīng)，在測(cè)定波長下測(cè)定其吸光度。

1.4測(cè)定波長的選擇雙波長法即測(cè)定2個(gè)波長下的吸光度，同時(shí)測(cè)出葡萄糖和木糖的濃度。其中，第1個(gè)測(cè)定波長通常選擇木糖的最大吸收波長550 nm，而第2個(gè)測(cè)定波長的選擇的方法并不統(tǒng)一[18-19]。因此，雙波長法的本質(zhì)是求解以下的二元方程組：

ε1c1+ε1′c2=A1

(1)

ε2c1+ε2′c2=A2

(2)

式中，c1和c2分別為木糖和葡萄糖的摩爾濃度，ε1和ε1′分別為木糖和葡萄糖在波長1時(shí)的摩爾吸光系數(shù)，ε2和ε2′分別為木糖和葡萄糖在波長2時(shí)的摩爾吸光系數(shù)，A1和A2分別為樣品在波長1和波長2時(shí)的吸光度。這個(gè)方程組的求解并不復(fù)雜，因此對(duì)計(jì)算的簡化并不是考慮的主要因素，應(yīng)從誤差分析上來考慮波長的選擇。當(dāng)吸光度的測(cè)量值因系統(tǒng)誤差偏離了理論值ΔA(如0.001)時(shí)，測(cè)得的c1和c2的相對(duì)誤差應(yīng)盡可能小。

假定波長1為550 nm，假定葡萄糖在550 nm處的摩爾吸光系數(shù)ε1′近似為零(當(dāng)葡萄糖濃度不是遠(yuǎn)大于木糖濃度時(shí)，此種近似是合理的)，則A1、A2的測(cè)定誤差與c1的關(guān)系式為：

(3)

(4)

這說明木糖濃度的測(cè)定值與波長2的選擇無關(guān)，僅僅與波長1(550nm)下吸光度A1測(cè)定的準(zhǔn)確度有關(guān)。

A1、A2的測(cè)定誤差與c2的關(guān)系式為：

(5)

(6)

葡萄糖濃度的測(cè)定誤差除了與A1、A2的測(cè)定準(zhǔn)確度有關(guān)外，還與葡萄糖的濃度以及2種糖在波長2時(shí)的吸光系數(shù)有關(guān)。樣品中葡萄糖濃度越小，A1和A2對(duì)葡萄糖濃度測(cè)定結(jié)果的影響就越大，這由混糖樣品(或水解液)本身的性質(zhì)決定。然而，吸光系數(shù)則可以通過選擇波長來達(dá)到預(yù)期誤差最小的目的。最理想的波長選擇是使得ε2/ε2′和1/ε2′同時(shí)達(dá)到最小。因此,通對(duì)葡萄糖和木糖溶液在不同波長下顯色反應(yīng)的吸光度進(jìn)行了誤差分析，并選擇了最佳的第二波長。

1.5標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制以糖濃度為橫坐標(biāo)，以吸光度為縱坐標(biāo)，按直線或二次曲線規(guī)則擬合出標(biāo)準(zhǔn)曲線，并根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出待測(cè)樣品的糖濃度。

1.6回收率的計(jì)算分別測(cè)定3份混合糖樣品(樣品1：木糖5mmol/L，葡萄糖1mmol/L；樣品2：木糖1mmol/L，葡萄糖5mmol/L；樣品3：木糖0.5mmol/L，葡萄糖2.5mmol/L)的糖濃度，并按照以下公式計(jì)算回收率：回收率(%) = 實(shí)測(cè)糖濃度/理論糖濃度×100。

2結(jié)果與分析

2.1雙波長法第二波長的確定從圖1可以看出，在550nm處木糖的吸收達(dá)到最大值，同時(shí)在550nm處葡萄糖的吸收幾乎為零，因此選擇550nm作為雙波長法測(cè)定的第一波長。最理想的第二波長選擇使得ε2/ε2′和1/ε2′同時(shí)達(dá)到最小。因?yàn)棣?/ε1小于1，所以A2的誤差對(duì)葡萄糖濃度c2的影響更為明顯。由表1可知，在405nm處ε2/ε2′達(dá)到最小值，在400nm處1/ε2′達(dá)到最小值。因此，選擇400nm為雙波長法測(cè)定的第二波長。

注：1.木糖濃度為1 mmol/L；2.木糖濃度為2 mmol/L；3.葡萄糖濃度為1 mmol/L;4.葡萄糖濃度為2 mmol/L。　Note：1. 1 mmol/L xylose; 2. 2 mmol/L xylose; 3. 1 mmol/L glucose 1; 4. 2 mmol/L glucose. 圖1　不同濃度的葡萄糖和木糖溶液的顯色反應(yīng)光譜 Fig. 1　Spectra of glucose and xylose solutions at various concentrations

Table 1The values of ε2/ε2′ and 1/ε2′ within the wavelength of 390-420 nm

波長Wavelengthnmε2/ε2'濃度為1mmol/L濃度為2mmol/L1/ε2'濃度為1mmol/L濃度為2mmol/L3900.6670.57513.88912.5003950.6570.58214.28612.6584000.6450.58013.15812.3464050.6220.57113.51412.9874100.6380.59614.49313.6994150.7780.67718.51915.7484200.9360.88221.27721.505

此外，標(biāo)準(zhǔn)曲線的方程為A=εc+b，當(dāng)截距b較大時(shí)不可忽略，因此式(1)和(2)在更精確測(cè)定時(shí)應(yīng)更正為：

ε1c1+b1+ε1′c2+b1′=A1

(7)

ε2c1+b2+ε2′c2+b2′=A2

(8)

然而，這并不會(huì)影響波長選擇的結(jié)果。

2.2標(biāo)準(zhǔn)曲線木糖和葡萄糖在400和550 nm處的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程分別為：y=0.044 6x和y=0.211 4x+0.223 4；葡萄糖在400和550 nm處的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程分別為：y=0.068 4x-0.003 4和y=0.003 9x-0.003 5。

其中，木糖在400 nm處的標(biāo)準(zhǔn)曲線以及葡萄糖在400和550 nm處標(biāo)準(zhǔn)曲線的截距很小，可以忽略不計(jì)。但是，木糖在550 nm處的標(biāo)準(zhǔn)曲線有很大的截距。這也說明用式(7)替換式(1)是必要的。

當(dāng)擬合直線關(guān)系時(shí)，R2約為0.99。從圖2可以看出，標(biāo)準(zhǔn)曲線的截距較大，在測(cè)量低濃度的木糖樣品時(shí)(濃度小于 1 mmol/L)會(huì)造成很大的誤差。同時(shí)，高濃度時(shí)試驗(yàn)點(diǎn)向低值偏移。從圖3可以看出，用二次函數(shù)得到擬合曲線的R2達(dá)到0.999 5，且截距明顯減小。

2.3方法的精度和準(zhǔn)確率評(píng)價(jià)從表2可以看出，在木糖濃度不太低時(shí)，樣品濃度的測(cè)定結(jié)果令人滿意，回收率為94%~102%。但當(dāng)木糖的濃度低至0.5 mmol/L時(shí)，測(cè)定結(jié)果出現(xiàn)明顯偏差，說明該方法不適于低濃度木糖的測(cè)定(小于1 mmol/L)。

圖2　木糖的標(biāo)準(zhǔn)曲線(一次曲線)Fig.2　The standard curve of xylose (linear curve)

圖3　木糖的標(biāo)準(zhǔn)曲線(二次曲線)Fig.3　Standard curve of xylose (quadratic curve)

樣品編號(hào)Samplecode總糖Totalsaccharide理論濃度Theoreticalconcentrationmmol/L實(shí)測(cè)濃度Measuredconcentrationmmol/L回收率Recoveryrate∥%木糖Xylose理論濃度Theoreticalconcentrationmmol/L實(shí)測(cè)濃度Measuredconcentrationmmol/L回收率Recoveryrate∥%葡萄糖Glucose理論濃度Theoreticalconcentrationmmol/L實(shí)測(cè)濃度Measuredconcentrationmmol/L回收率Recoveryrate∥%16.006.04100.675.005.10102.001.000.9494.0026.005.9699.333.002.9698.673.003.00100.0033.002.8996.330.500.1428.002.502.75110.00

注： 木糖在550 nm處的顯色反應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)曲線選取一次標(biāo)準(zhǔn)曲線。

Note：Linear standard curve was selected for the standard curve of xylose chromogenic reaction at 550 nm.

用木糖在550 nm處的二次標(biāo)準(zhǔn)曲線，重新計(jì)算了3種混糖樣品的濃度。由表3可知，當(dāng)木糖濃度較大時(shí)，用一次標(biāo)準(zhǔn)曲線測(cè)定的回收率較好，而當(dāng)木糖濃度較低時(shí)二次標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)總糖、木糖和葡萄糖的回收率分別為96.7%、96.0%和96.8%，明顯好于一次標(biāo)準(zhǔn)曲線。

忽略葡萄糖顯色反應(yīng)在550 nm的吸光度，樣品1、2使用木糖的一次標(biāo)準(zhǔn)曲線，樣品3使用木糖的二次標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算回收率。由表4可知，即使在葡萄糖濃度為木糖5倍的情況下，對(duì)測(cè)定結(jié)果的影響依然是很小的。

用該方法測(cè)定了稻桿的硫酸和鹽酸的水解液，并進(jìn)行了加標(biāo)回收率試驗(yàn)。前者加入2 mmol/L的葡萄糖溶液，后者加入2 mmol/L的木糖溶液。由表5可知，該方法對(duì)加標(biāo)樣品的測(cè)定有較高的準(zhǔn)確度，可用于植物纖維水解液的糖含量測(cè)定。

表3　回收率的測(cè)定結(jié)果(2)

注：木糖在550 nm處的顯色反應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)曲線選取二次標(biāo)準(zhǔn)曲線。

Note：Quadratic standard curve was selected for the standard curve of xylose chromogenic reaction at 550 nm.

表4　回收率的測(cè)定結(jié)果(3)

注：測(cè)定中忽略葡萄糖顯色反應(yīng)在550 nm處的吸收。

Note：Absorption at 550 nm was neglected in glucose color reaction.

表5　樣品加標(biāo)回收率的測(cè)定結(jié)果

3結(jié)論

筆者采用改進(jìn)的雙波長法測(cè)定了混糖溶液中木糖和葡萄糖的含量，并對(duì)方法的回收率進(jìn)行了測(cè)定，得出以下結(jié)論：①選擇550和400 nm作為測(cè)定波長，可以使測(cè)定誤差盡可能小； ②對(duì)于木糖在550 nm處標(biāo)準(zhǔn)曲線的擬合，選擇二次方程擬合標(biāo)準(zhǔn)曲線有更寬的適用范圍，尤其適合測(cè)定木糖濃度較低的溶液；③葡萄糖顯色反應(yīng)在550 nm處的吸光度要遠(yuǎn)小于木糖，除非混糖溶液中葡萄糖的濃度遠(yuǎn)大于木糖，不必考慮葡萄糖在550 nm處的吸收；④在合適的木糖標(biāo)準(zhǔn)曲線選擇下，中配制的幾種混糖樣品的總糖、木糖和葡萄糖測(cè)定的回收率均為94.00%~101.60%，對(duì)加標(biāo)樣品的測(cè)定也有較高的準(zhǔn)確度，說明該方法可以實(shí)現(xiàn)對(duì)總糖、木糖和葡萄糖含量的準(zhǔn)確測(cè)定。

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收稿日期2015-12-07

作者簡介朱捷(1979- )，男，江蘇徐州人，講師，博士，從事農(nóng)作物廢棄物的有效利用方面研究。

基金項(xiàng)目江蘇省高校自然科學(xué)基金項(xiàng)目(12KJD530002)。

中圖分類號(hào)O 657.3

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼A

文章編號(hào)0517-6611(2016)03-009-04