張 奇，闞紅莉*，劉鐵成

（1.吉林省腫瘤醫(yī)院麻醉科，長(zhǎng)春 130012；2.吉林大學(xué)第二醫(yī)院麻醉科，長(zhǎng)春 130041）

右美托咪定是一種新型的α2-腎上腺受體激動(dòng)劑，它在麻醉鎮(zhèn)靜和鎮(zhèn)痛方面的輔助作用已經(jīng)得到廣泛的肯定，同時(shí)它對(duì)血流動(dòng)力學(xué)影響比較小也是優(yōu)點(diǎn)之一。許多報(bào)道證實(shí)α2-腎上腺受體與免疫細(xì)胞增殖和功能調(diào)節(jié)有關(guān)，因此本文主要圍繞NF-κB 信號(hào)通路闡述α2-腎上腺受體激動(dòng)劑右美托咪定能否影響免疫因子的調(diào)節(jié)和表達(dá)。

1 材料和方法

1.1 材料 HEK293T 細(xì)胞株，Raw cell 264.7 細(xì)胞株，IKbα 多克隆抗體（santa），RT-pcr 試劑盒（takara）等。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) HEK293T使用DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)，加10% FBS 和1%抗生素，每24 h 換液，48 h 使用胰酶消化傳代，保證細(xì)胞有規(guī)律的傳代生長(zhǎng)和健康的狀態(tài)。

1.2.2 reporter assay 使用磷酸鈣轉(zhuǎn)染方法對(duì)HEK293T進(jìn)行瞬時(shí)轉(zhuǎn)染，24 孔每孔轉(zhuǎn)染NF-κB reporter 質(zhì)粒50 ng，2 M cacl2 2.5 μL，2*HBS 20 μL，充分混合后均勻加入每孔內(nèi)。

1.2.3 RT-pcr TRIZOL 試劑進(jìn)行總RNA 提取，使用biorad 公司的逆轉(zhuǎn)錄試劑盒進(jìn)行cDNA 合成，最后使用TAKARA 公司的SYBR 試劑進(jìn)行基因檢測(cè)。

1.2.4 western bloting Raw cell 264.7 細(xì)胞經(jīng)50 nM 右美托咪定處理以后檢測(cè)IKbα 的表達(dá)水平。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1 不同濃度的藥物對(duì)HEK293T 細(xì)胞的影響 12 孔培養(yǎng)板，每孔1×105，過(guò)夜培養(yǎng)18 h 后，用磷酸鈣法瞬時(shí)轉(zhuǎn)染細(xì)胞，24 h 后分析基因表達(dá)的結(jié)果。實(shí)驗(yàn)結(jié)果說(shuō)明隨著藥物劑量的增加HEK293T 細(xì)胞內(nèi)Nf-κB 基因表達(dá)出現(xiàn)激活現(xiàn)象，可以間接促進(jìn)下游的免疫分子的表達(dá)和增加。見(jiàn)圖1。

2.2 右美托咪定對(duì)Nf-κB 基因mRNA 水平的影響 6孔培養(yǎng)板，每孔3*105，培養(yǎng)14 h 后藥物處理10 h，更換培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)48 h，每孔細(xì)胞使用1ml trizol裂解，總rna 提取，進(jìn)行rt-pcr 分析，實(shí)驗(yàn)結(jié)果說(shuō)明高濃度的右美托咪定可以增強(qiáng)Nf-κB 基因mRNA 水平的表達(dá)。見(jiàn)圖2。

2.3 右美托咪定對(duì)IKBα 表達(dá)的影響 Raw cell 264.7細(xì)胞在6 孔培養(yǎng)板中培養(yǎng)18 h 后使用不同濃度的Dex 處理10 h，繼續(xù)培養(yǎng)24 h 后裂解細(xì)胞，去上清做western bloting 分析，結(jié)果說(shuō)明藥物濃度增加促進(jìn)ikbα的降解，從而間接促進(jìn)Nf-κB 的活化和入核，激活下游基因的表達(dá)。見(jiàn)圖3。

圖1 Nf-κB 基因表達(dá)與右美托咪定藥物劑量的相關(guān)性

圖2 不同濃度藥物對(duì)Nf-κB 基因mRNA 水平的影響

圖3 藥物濃度對(duì)Raw cell 264.7 細(xì)胞IKBα 表達(dá)的影響

3 討論

近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)α2-腎上腺受體激動(dòng)劑在淋巴細(xì)胞酸右美托咪定近年來(lái)作為臨床麻醉中廣泛應(yīng)用的α2-表面廣泛分布，可以參與調(diào)節(jié)淋巴細(xì)胞的功能。鹽腎上腺受體激動(dòng)劑，其鎮(zhèn)靜和鎮(zhèn)痛效果以及穩(wěn)定性已經(jīng)得到證實(shí)。右美托咪定作用于腦和脊髓的α2腎上腺素能受體（α2-AR），與美托咪定相比，本品對(duì)中樞α2-腎上腺素受體激動(dòng)的選擇性更強(qiáng)，對(duì)α2-腎上腺素受體的親和力是可樂(lè)定的8 倍[1]。通過(guò)激動(dòng)中樞神經(jīng)系統(tǒng)α2受體最密集的區(qū)域：腦干藍(lán)斑核（其主要作用是負(fù)責(zé)調(diào)解覺(jué)醒與睡眠），進(jìn)而引發(fā)并維持自然非動(dòng)眼睡眠（NREM）狀態(tài)[2]，產(chǎn)生鎮(zhèn)靜、催眠作用，α2c 受體在這一過(guò)程中被激動(dòng)并參與抗焦慮作用。作用機(jī)理可能為：1）由百日咳毒素敏感的G 蛋白介導(dǎo)，使神經(jīng)元細(xì)胞超極化來(lái)抑制神經(jīng)元放電，激活K+通道，同時(shí)抑制電壓門控式Ca2+通道[1,3]；2）作用于中樞神經(jīng)突觸前與突觸后α2-AR，抑制去甲腎上腺素（NE）釋放，降低突觸后膜的興奮性[4-6]；3）通過(guò)抑制腺苷酸環(huán)化酶活性，減少細(xì)胞內(nèi)環(huán)磷酸腺苷的生成[7-8]。右美托咪定的鎮(zhèn)痛作用主要是作用于脊髓后角突觸前和中間神經(jīng)元突觸后膜α2腎上腺素能受體，使細(xì)胞膜超極化[9-10]，抑制疼痛信號(hào)向腦的傳導(dǎo)。

一些經(jīng)典的NF-κB 激活因子，如tumor necrosis factor α（TNFα） 、interleukin 1 （IL-1）、lipopolysaccharide （LPS），然而還存在一些非經(jīng)典的激活因子，如UV-C 和一些化療藥物。經(jīng)典的激活因子激活NF-κB 非常迅速，1 h 可達(dá)高峰，而非經(jīng)典的激活因子激活NF-κB 則相對(duì)較慢。已發(fā)現(xiàn)[11]多種可被NF-κB上調(diào)的抗凋亡基因，如Bcl-xL、 X-IAP、IAP1、 IAP2、IEX-1L、Bfl-1。

本研究中發(fā)現(xiàn)α2-腎上腺受體激動(dòng)劑右美托咪定可以增強(qiáng)Nf-κB 基因的表達(dá)水平，在轉(zhuǎn)錄水平上我們通過(guò)reporter assay 實(shí)驗(yàn)和rt-pcr 實(shí)驗(yàn)證實(shí)Nf-κB 基因的表達(dá)與右美托咪定的藥物劑量密切相關(guān)，在一定范圍內(nèi)隨著藥物濃度的升高基因表達(dá)增強(qiáng)。同時(shí)我們?cè)诘鞍姿缴弦沧C實(shí)了Nf-κB 的抑制因子ikbα 隨著藥物濃度的升高降解加速，這也直接證實(shí)了藥物濃度升高激活了Nf-κB 和入核，從而進(jìn)一步激活下游靶分子的表達(dá)和影響免疫分子和炎癥因子的水平。當(dāng)然我們還可以深入研究動(dòng)物模型中的分子機(jī)制，為指導(dǎo)臨床合理選擇藥物打下堅(jiān)實(shí)的理論基礎(chǔ)。