劉文強(qiáng)，黃露義，李國(guó)菠 (四川大學(xué)生物治療國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，成都 610041)

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·化學(xué)·

采用藥效團(tuán)模型和分子對(duì)接方法篩選新型的組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶G9a抑制劑

劉文強(qiáng)，黃露義，李國(guó)菠 (四川大學(xué)生物治療國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，成都 610041)

摘要：目的利用藥效團(tuán)模型和分子對(duì)接方法對(duì)商業(yè)化合物庫(kù)ChemDiv 中的G9a focused-libraries進(jìn)行篩選，希望發(fā)現(xiàn)新骨架結(jié)構(gòu)的G9a抑制劑。方法首先，使用Discovery studio 3.1軟件分別構(gòu)建基于配體的藥效團(tuán)模型和基于配體-受體復(fù)合物的藥效團(tuán)模型，并根據(jù)構(gòu)建的2個(gè)模型再重新定義2個(gè)新的藥效團(tuán)模型。然后，構(gòu)建測(cè)試集并測(cè)試藥效團(tuán)模型的預(yù)測(cè)能力。最后，選取最優(yōu)藥效團(tuán)模型對(duì)G9a focused-libraries進(jìn)行篩選，對(duì)篩選出的化合物使用CDOCKER分子對(duì)接進(jìn)行分析與評(píng)價(jià)。結(jié)果測(cè)試結(jié)果顯示，所構(gòu)建的藥效團(tuán)模型具有一定的預(yù)測(cè)能力，通過(guò)該藥效團(tuán)篩選得到了2個(gè)結(jié)構(gòu)新穎的潛在的G9a抑制劑。結(jié)論所構(gòu)建的藥效團(tuán)模型具有一定的可靠性，虛擬篩選發(fā)現(xiàn)的G9a抑制劑還需進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)證明。

關(guān)鍵詞：G9a；藥效團(tuán)；分子對(duì)接；抑制劑

表觀遺傳(epigenetic)是指DNA序列不發(fā)生變化，但基因表達(dá)卻發(fā)生了可遺傳的改變。這種改變是細(xì)胞內(nèi)除了遺傳信息以外的其他可遺傳物質(zhì)發(fā)生的改變，且這種改變?cè)诎l(fā)育和細(xì)胞增殖過(guò)程中能穩(wěn)定傳遞。表觀遺傳現(xiàn)象包括DNA甲基化、組蛋白修飾、核小體定位、RANA干擾等。

組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶G9a，又稱(chēng)常染色質(zhì)賴(lài)氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶2(EHMT2)，是常染色質(zhì)主要的甲基轉(zhuǎn)移酶之一。G9a主要通過(guò)甲基化組蛋白H3第9位賴(lài)氨酸(H3K9)調(diào)節(jié)基因轉(zhuǎn)錄，也可以甲基化一些非組蛋白，如抑癌因子P53[1]。G9a功能紊亂可導(dǎo)致胚胎發(fā)育異常、免疫系統(tǒng)及神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育障礙[2-5]。同時(shí)，G9a 也與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)，它在白血病、前列腺癌、肝癌、肺癌等多種腫瘤中都有高表達(dá)[6-7]。因此，G9a被認(rèn)為是治療這些疾病的重要潛在靶標(biāo)，其抑制劑的研發(fā)已成為當(dāng)前的研究熱點(diǎn)。

現(xiàn)有的G9a抑制劑分為兩類(lèi)：SAM(S-腺苷甲硫氨酸)競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑和底物競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑。常見(jiàn)的SAM競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑包括BIX-01338、天然產(chǎn)物毛殼素、BRD4770[8]等，這些抑制劑能占據(jù) SAM 結(jié)合位點(diǎn)，阻止SAM與之結(jié)合，從而抑制G9a 活性。最早發(fā)現(xiàn)的底物競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑BIX01294(圖1)，也是第一個(gè)報(bào)道的組蛋白賴(lài)氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶抑制劑，是由 Stefan K等篩選了約 125 000種化合物后發(fā)現(xiàn)的[9]。緊接著，一系列2，4-二氨基-7-氨烷氧基喹唑啉化合物由Liu F所在實(shí)驗(yàn)室發(fā)現(xiàn)[10-14]。2014年1種新型結(jié)構(gòu)化合物A-366由Sweis R F等發(fā)現(xiàn)[15]。

目前，對(duì)G9a生物功能的研究尚不全面，G9a抑制劑作為重要的分子探針，在研究G9a的生物功能和相關(guān)的疾病治療方面具有十分重要的意義?，F(xiàn)有的底物抑制劑結(jié)構(gòu)類(lèi)型只有2種，均處于臨床前研究階段，有的選擇性不高，有的藥動(dòng)學(xué)性質(zhì)較差，需要尋找新型結(jié)構(gòu)的抑制劑。本文旨在利用虛擬篩選去發(fā)現(xiàn)新型潛在的G9a抑制劑，為靶向G9a的藥物研發(fā)提供參考。

1材料與方法

1.1材料本文所用晶體結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)來(lái)源于PDB蛋白質(zhì)晶體結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)庫(kù)。藥效團(tuán)構(gòu)建、模型優(yōu)化、藥效團(tuán)篩選、分子對(duì)接計(jì)算均在普通計(jì)算機(jī)上完成，所用程序?yàn)镈iscovery Studio(DS)3.1分子設(shè)計(jì)軟件包，除特別說(shuō)明，均使用默認(rèn)參數(shù)。小分子化合物庫(kù)選用商業(yè)化合物庫(kù)ChemDiv。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1多個(gè)藥效團(tuán)模型的構(gòu)建從PDB數(shù)據(jù)庫(kù)中下載目前已知的3個(gè)G9a晶體復(fù)合物(PDB ID：3K5K，3WJQ，4NVQ)，把3個(gè)配體(圖1)剪切、粘貼于DS 3.1同一分子窗口中。點(diǎn)擊Common Feature Pharmacophore Generation模塊，設(shè)置相應(yīng)參數(shù)。Principal：2，MaxOmitFeat：0，由于晶體結(jié)構(gòu)中的配體已經(jīng)是活性構(gòu)象，所以Conformation Generation設(shè)置為None。采用以下化學(xué)特征進(jìn)行藥效團(tuán)模型構(gòu)建：氫鍵供體(D)、氫鍵受體(A)、疏水中心(H)、芳環(huán)中心(R)以及正電中心(P)。從PDB數(shù)據(jù)庫(kù)中下載編號(hào)為3K5K的晶體結(jié)構(gòu)，先對(duì)蛋白分子進(jìn)行加氫去水等預(yù)處理，然后利用 DS 的 Receptor-ligand pharmacophore generation 模塊產(chǎn)生藥效團(tuán)模型。綜合前面2個(gè)藥效團(tuán)模型，結(jié)合文獻(xiàn)報(bào)道的受體-配體相互作用，使用Pharmacophore generation manually模塊，再手動(dòng)構(gòu)建2個(gè)藥效團(tuán)模型。

圖1G9a抑制劑分子結(jié)構(gòu)

Fig.1Chemical structures of G9a inhibitors

1.2.2藥效團(tuán)模型的優(yōu)劣評(píng)價(jià)通過(guò)用已知的活性化合物和非活性化合物建立Decoy set 來(lái)驗(yàn)證模型區(qū)分活性化合物和非活性化合物的能力。從相關(guān)文獻(xiàn)中收集28個(gè)活性小分子[10-16]。按照Yang L L等介紹的方法收集非活性分子[17]。首先從Zinc數(shù)據(jù)庫(kù)中選取與活性分子集Tanimoto相似系數(shù)不超過(guò)0.6的分子，然后從中選取與活性分子集分子屬性(6個(gè)屬性：相對(duì)分子質(zhì)量、氫鍵供體數(shù)量、氫鍵受體數(shù)量、可旋轉(zhuǎn)鍵數(shù)量、分子極性表面積和AlogP)最相似的924個(gè)分子。用建好的4個(gè)藥效團(tuán)模型對(duì)Decoy set數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行篩選，各項(xiàng)指標(biāo)如下：D代表Decoy set中所有化合物的數(shù)目，A代表數(shù)據(jù)庫(kù)中活性化合物的數(shù)目，Ha代表藥效團(tuán)模型命中的活性化合物數(shù)，Ht代表藥效團(tuán)模型命中的所有化合物數(shù)，產(chǎn)率Y(Yield) =Ha/A，命中率Hr(Hit rate)=Ha/Ht，富集因子E(Enrichment factor)=Hr/(A/D)，綜合評(píng)價(jià)指數(shù)[18](CAI)=Y×E。選擇綜合評(píng)價(jià)指數(shù)最高的模型作為最優(yōu)藥效團(tuán)模型,用于下一步的篩選。

1.2.3虛擬篩選用最優(yōu)模型作為提問(wèn)結(jié)構(gòu)對(duì)G9a focused_libraries進(jìn)行篩選,對(duì)篩選出的化合物用DS 3.1中的CDOCKER模塊進(jìn)行分子對(duì)接分析與評(píng)估。在對(duì)接前，為選擇合適的受體分子，我們重新對(duì)接了3個(gè)晶體結(jié)構(gòu)中的受體和相應(yīng)配體，計(jì)算配體對(duì)接構(gòu)象與晶體構(gòu)象的均方根偏差(RMSD),我們選擇RMSD值最小(0.33 A)的4NVQ中的受體作為對(duì)接受體。CDOCKER主要計(jì)算受體和配體總能量CE(CDOCKER_ENERGY)和受體-配體相互作用能CIE(CDOCKER_INTERACTION_ENERGY)2種能量，以此作為打分函數(shù)。CDOCKER_ENERGY越低，說(shuō)明受體和配體總能量越低，對(duì)接體系越穩(wěn)定。CDOCKER_INTERACTION_ENERGY越低表示對(duì)接過(guò)程中相互作用越小，配體與受體結(jié)合得越好。DS 3.1軟件對(duì)這2個(gè)值取負(fù)數(shù)，即-CDOCKER_ENERGY越大，對(duì)接體系越穩(wěn)定， -CDOCKER_INTERACTION_ENERGY越大，受體與配體結(jié)合得越好。

2結(jié)果與討論

2.1多個(gè)藥效團(tuán)模型的構(gòu)建DS 3.1基于配體的藥效團(tuán)模型共產(chǎn)生10個(gè)，我們選取Rank值排名第1的模型Hypo1(圖2-A)，它包括4個(gè)藥效團(tuán)特征，2個(gè)疏水中心(H1，H2)，1個(gè)芳環(huán)中心(R)，1個(gè)正電中心(P)。基于受體-配體復(fù)合物的算法只產(chǎn)生1個(gè)藥效團(tuán)模型Hypo2(圖2-B)，與文獻(xiàn)報(bào)道的G9a配體受體相互作用進(jìn)行比較[13]，2個(gè)重要的相互作用(UNC0224喹唑啉環(huán)上7位N的正電中心、喹唑啉環(huán)上4位NH上的氫鍵供體)沒(méi)有識(shí)別出來(lái)。所以，我們綜合前面2個(gè)藥效團(tuán)模型，手動(dòng)構(gòu)建第3個(gè)藥效團(tuán)模型Hypo3(圖2-C)，該模型包括4個(gè)藥效團(tuán)特征(來(lái)源于基于配體的藥效團(tuán)模型)和一些排除體積(來(lái)源于基于受體-配體復(fù)合物的藥效團(tuán)模型)。文獻(xiàn)[16]表明,甲氧基團(tuán)上的疏水中心對(duì)活性無(wú)影響；文獻(xiàn)[13]表明，喹唑啉環(huán)上4位NH與受體形成的氫鍵對(duì)活性非常重要，因此，我們刪除Hypo3甲氧基上的疏水中心H2，在4位NH上添加一個(gè)氫鍵供體，構(gòu)建了第4個(gè)藥效團(tuán)模型(圖2-D)。

圖2A.基于配體產(chǎn)生的藥效團(tuán)模型Hypo1；

B.基于配體-受體復(fù)合物的藥效團(tuán)模型Hypo2；

C.綜合Hypo1和Hypo2得到藥效團(tuán)模型Hypo3；

D.修改Hypo3得到藥效團(tuán)模型Hypo4

Fig.2 A. Ligand-based pharmacophore model Hypo1;B. Receptor-ligand complex-based pharmacophore model Hypo2;C. Pharmacophore model Hypo3 synthesized from Hypo1 and Hypo2;D. Pharmacophore model Hypo4 generated by modifying Hypo3

2.2藥效團(tuán)模型評(píng)價(jià)結(jié)果用構(gòu)建的4個(gè)藥效團(tuán)模型對(duì)decoy set 進(jìn)行篩選，結(jié)果見(jiàn)表1。我們選擇綜合評(píng)價(jià)指數(shù)最高的Hypo4作為最優(yōu)藥效團(tuán)模型。

表14個(gè)藥效團(tuán)模型對(duì)Decoy set的篩選結(jié)果

Tab.1Comparison of the performance of four pharmacophore models in virtual

HypoHtHaHr/%Y/%EHr/(A/D)CAIY×EHypo11852714．5996．434．964．78Hypo2181794．4460．7132．1119．49Hypo31112421．6285．717．356．30Hypo4342573．5389．2925．0022．32

2.3基于藥效團(tuán)模型和分子對(duì)接的虛擬篩選本次虛擬篩選選用商業(yè)庫(kù)ChemDiv中的G9a focused_libraries，由4 379個(gè)分子組成。首先以Hypo4為提問(wèn)結(jié)構(gòu)，對(duì)數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行搜索，得到 233個(gè)化合物，采用DS中的CDOCKER將上述233個(gè)化合物與G9a受體進(jìn)行分子對(duì)接。所挑選的候選化合物符合以下幾個(gè)標(biāo)準(zhǔn)：(1)它們能與G9a形成較好的相互作用，結(jié)合模式與現(xiàn)有晶體結(jié)構(gòu)中的結(jié)合模式相似。(2)-CE和-CIE都必須為正。(3)這些化合物與現(xiàn)有的G9a抑制劑有不同的骨架結(jié)構(gòu)。最后，我們挑選了2個(gè)符合標(biāo)準(zhǔn)的化合物，F(xiàn)911-1358和E941-0103，如圖3。

圖3化合物F911-1358和E941-0103的分子結(jié)構(gòu)

Fig.3Chemical structures of compound F911-1358 and compound E941-0103

在F911-1358的10個(gè)對(duì)接構(gòu)象中，我們選擇-CIE值最大的構(gòu)象作為最優(yōu)構(gòu)象(-CIE:59.844 4,-CE:26.866 4)，如圖4-A。F911-1358吡啶環(huán)側(cè)鏈上的NH與ASP1083形成氫鍵，吡啶環(huán)和呋喃環(huán)與ARG1157形成陽(yáng)離子-π相互作用，酰胺側(cè)鏈占據(jù)G9a賴(lài)氨酸通道，其結(jié)合模式類(lèi)似于3K5K。同樣，在E941-0103的10個(gè)對(duì)接構(gòu)象中，我們選擇-CIE值最大的構(gòu)象作為最優(yōu)構(gòu)象(-CIE:54.046 1，-CE:15.049 7)，如圖4-B。E941-0103中吡啶環(huán)與ARG1157形成陽(yáng)離子-π相互作用，吡咯環(huán)上的NH和酰胺上的氧分別與ASP1088形成氫鍵，酰胺側(cè)鏈占據(jù)賴(lài)氨酸通道，其結(jié)合模式類(lèi)似于4NVQ。圖4中賴(lài)氨酸通道上的氨基酸殘基未列出。

圖4A.化合物F911-1358與G9a的相互作用；

B.化合物E941-0103與G9a的相互作用

Fig.4 A.Interactions between compound F911-1358 and G9a;

B. Interactions between compound E941-0103 and G9a

3結(jié)論

現(xiàn)有的G9a底物競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑只有2種結(jié)構(gòu)，在構(gòu)建藥效團(tuán)模型時(shí)，單獨(dú)使用基于配體的方法或基于復(fù)合物的方法，效果都不太好。本文綜合這2種方法，構(gòu)建了1個(gè)最優(yōu)藥效團(tuán)模型并應(yīng)用該模型和分子對(duì)接方法篩選出了2個(gè)潛在的G9a抑制劑。這2個(gè)化合物都能很好的與G9a受體相互作用，結(jié)合模式類(lèi)似于現(xiàn)有的配體-受體復(fù)合物，其活性還需實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證明。

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·藥物與臨床·

Virtual screening of novel histone methyltransferase G9a inhibitors by using pharmacophore modeling and molecular docking

LIU Wenqiang,HUANG Luyi,LI Guobo (State Key Laboratory of Biotherapy and Cancer Center,Sichuan University,Chengdu 610041,China)

Abstract:Objective To discover novel G9a inhibitors with new chemical scaffolds by screening G9a focused-libraries of the commercial chemical library ChemDiv using pharmacophore modeling and molecular docking. Methods Firstly, a ligand-based pharmacophore model and a receptor-ligand complex-based pharmacophore model were generated using Discovery Studio 3.1.According to these two models， we constructed two new pharmacophore hypotheses. Then，a test set was constructed and used to evaluate the four established models. Finally, the optimal model was selected and used as 3D search query to screen G9a focused-libraries, and the hit compounds were subjected to be evaluated by using CDOCKER molecular docking program. Results Two compounds with novel scaffolds were obtained. Conclusion The established pharmacophore model is relatively reliable, and two potential G9a inhibitors were selected.

Key words:G9a；pharmacophore；molecular docking；inhibitors

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(收稿日期：2015-05-29)

中圖分類(lèi)號(hào)：R914

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號(hào)：1004-2407(2016)02-0186-04

doi:10.3969/j.issn.1004-2407.2016.02.022