高 華，紀(jì)紅燕，鄧　寧，杜　偉，費(fèi)平霞，孫維紅，黨宏萬，文友民(寧夏醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院藥劑科，銀川750004)

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HPLC法測定大鼠血漿中槐定堿

高 華，紀(jì)紅燕，鄧寧，杜偉，費(fèi)平霞，孫維紅，黨宏萬，文友民*(寧夏醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院藥劑科，銀川750004)

摘要：目的建立HPLC法測定大鼠血漿中槐定堿的體內(nèi)分析方法，并用于其藥動學(xué)研究。方法以苦參堿為內(nèi)標(biāo)，血漿樣品在1.0 mol·L-1氫氧化鈉堿性條件下加入1.0 mL三氯甲烷液-液萃取，采用Synergi 4 μHydro-RP 80A(150 mm×4.6 mm，4.0 μm)色譜柱分離，流動相為乙腈-磷酸鹽緩沖溶液(0.01 mol·L-1KH2PO4，磷酸調(diào)pH 3.00)=5∶95，流速為1.0 mL·min-1，柱溫30 ℃，檢測波長210 nm，在此條件下測定。采用DAS 2.0軟件進(jìn)行藥動學(xué)參數(shù)估算。結(jié)果槐定堿在0.25～25 μg·mL-1內(nèi)線性良好(r=0.999 7)，提取回收率為76.6%~90.4%，日內(nèi)、日間精密度符合要求?；倍▔A主要藥動學(xué)參數(shù)t1/2、AUC、Cmax分別為1.75± 0.66 h、10.80± 2.69 mg·h·L-1和5.56± 0.78 mg·L-1。結(jié)論該方法快速、靈敏、 專屬性強(qiáng)，可用于槐定堿藥的代動力學(xué)分析。

關(guān)鍵詞：槐定堿；高效液相色譜法；藥代動力學(xué)

槐定堿(sophoridine)是從寧夏特色藥材苦豆子中分離出的單體生物堿，具有抗腫瘤、抗心律失常、抗炎、鎮(zhèn)痛、抗病毒和免疫抑制等作用[1-3]。研究發(fā)現(xiàn)，

槐定堿對白血病細(xì)胞株、表皮癌株有抑制作用，而且抑瘤作用具有較強(qiáng)的選擇性。此外，臨床上也發(fā)現(xiàn)槐定堿能夠單獨(dú)治療一些惡性腫瘤，如惡性淋巴瘤、消化道腫瘤和惡性滋養(yǎng)細(xì)胞腫瘤等，是一種高效低毒的抗癌生物堿[4]，具有重要的臨床開發(fā)應(yīng)用價值。本研究旨在建立簡單、快速的HPLC法，以探討槐定堿在大鼠體內(nèi)的藥代動力學(xué)過程，期望通過本實(shí)驗(yàn)為槐定堿的進(jìn)一步研究以及臨床應(yīng)用和后續(xù)制劑研發(fā)提供方法參考和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1儀器與材料

1.1儀器1200型高效液相色譜儀(美國Agilent公司)，包括G1322A型脫氣機(jī)，G1311A型泵，G1329A型自動進(jìn)樣器，G1316A型柱溫箱和G1314B型紫外檢測器；HPD-25無油隔膜真空泵(天津市達(dá)因儀器廠)；5804R臺式低溫冷凍離心機(jī)(美國eppendorf公司)；SI-0246渦旋混合儀(美國SI公司)；OS-SYS氮吹儀(美國Organomation公司)。

1.2試藥槐定堿(質(zhì)量分?jǐn)?shù)>99.5%，寧夏紫荊花制藥有限公司，批號 121080)；苦參堿(質(zhì)量分?jǐn)?shù)為100.0%，中國藥品生物制品檢定所，批號 110805-200508)；甲醇、乙腈為色譜純(Fish Scientific 公司)；KH2PO4、NaOH、CCl4均為分析純；實(shí)驗(yàn)用水為雙蒸水。

1.3動物 健康SD大鼠，雌雄各半，鼠齡11～12周，體質(zhì)量為300±20 g，購買于寧夏醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心，動物生產(chǎn)許可證號：SCXK(寧)2014-0003。SPF級環(huán)境飼養(yǎng)，飼養(yǎng)條件為相對濕度40%～70%，室溫22～28 ℃。預(yù)養(yǎng)1周后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)動物的使用通過了寧夏醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院倫理委員會的論證。

2方法與結(jié)果

2.1溶液的配制

2.1.1槐定堿標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制 精密稱取10.27 mg槐定堿對照品，置于10 mL量瓶中，用純水溶解，定容至刻度，搖勻，得到1 mg·mL-1的儲備液Ⅰ。以流動相為稀釋溶液，逐步將儲備液Ⅰ稀釋成100 μg·mL-1的儲備液Ⅱ。置于4 ℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

2.1.2內(nèi)標(biāo)溶液苦參堿溶液的配制 稱取1.01 mg苦參堿對照品，置于10 mL量瓶中，用甲醇溶解，定容至刻度，搖勻，得到100 μg·mL-1的苦參堿溶液。以甲醇為稀釋液，逐步稀釋得到質(zhì)量濃度為1.00 μg·mL-1的苦參堿溶液，置于4 ℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

2.2色譜條件 色譜柱：Synergi 4 μHydro-RP 80A(150 mm×4.6 mm，4.0 μm)；保護(hù)柱：ZORBAX SB-C18(4 mm×2.0 mm，5 μm)；乙腈-0.01 mol·L-1磷酸鹽緩沖溶液=5∶95(磷酸調(diào)節(jié)pH至3.0)；流速為1.0 mL·min-1；檢測波長為210 nm；柱溫為30 ℃；進(jìn)樣量為10 μL。

2.3血漿樣品的預(yù)處理精密吸取血漿100 μL，置于2 mL EP管中，精密加入苦參堿溶液(1.0 μg·mL-1)100 μL，渦旋混勻后加入1.0 moL·L-1氫氧化鈉溶液20 μL，渦旋震蕩1 min，加入三氯甲烷1.0 mL，渦旋震蕩1 min，以4 000 r·min-1離心5 min，取下清溶液，55 ℃空氣流，吹干。100 μL流動相將殘?jiān)芙?，渦旋混勻30 s后，以14 000 r·min-1高速離心10 min，取10 μL上清液進(jìn)樣分析。

2.4 方法學(xué)考察

2.4.1 方法專屬性 取大鼠空白血漿、含槐定堿+內(nèi)標(biāo)苦參堿溶液的血漿、大鼠靜脈注射給藥后的血漿樣品，按照2.3項(xiàng)下方法處理，考察血漿中有無干擾物的存在，并考察該方法的專屬性。各組樣品的HPLC色譜圖見圖1。從圖1中可以看出樣品的測定不會受血漿中內(nèi)源性物質(zhì)的干擾，在當(dāng)前色譜條件下，槐定堿和內(nèi)標(biāo)苦參堿的峰形良好，保留時間分別為5.5和6.4 min，峰形對稱，專屬性良好。

圖1HPLC圖

a.空白血漿；B. 苦參堿+槐定堿；C.大鼠給藥后的血漿樣品；1.苦參堿；2.槐定堿

Fig.1 HPLCchromatograms

a. blank plasma；B. matrine + sophoridine；C. plasma sample 1. matrine 2. sophoridine

2.4.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線及檢測限 取槐定堿對照品溶液以大鼠空白血漿為稀釋溶液，配成質(zhì)量濃度為0.25，0.5，1.25，2.5，5.0，12.5和25.0 μg·mL-1的槐定堿血漿樣品，按照2.3項(xiàng)下方法處理，進(jìn)樣10 μL。以槐定堿與內(nèi)標(biāo)物峰面積比(Y)對槐定堿的藥物質(zhì)量濃度(X)進(jìn)行線性回歸?；倍▔A血漿標(biāo)準(zhǔn)曲線為：Y=0.584 5X- 0.029 1(r=0.999 7，權(quán)重系數(shù)=1/X)，其線性范圍為0.25~25.0 μg·mL-1，0.25 μg·mL-1為槐定堿的最低檢測質(zhì)量濃度。

2.4.3 精密度及相對回收率取100 μL大鼠空白血漿，配制成質(zhì)量濃度為0.5，2.5和20.0μg·mL-1的槐定堿血漿樣品，每個質(zhì)量濃度6個樣品，按照2.3項(xiàng)下方法操作，每個濃度樣品測定3 d。計(jì)算其日間、日內(nèi)精密度與相對回收率，結(jié)果見表1。

2.4.4絕對回收率 取100 μL大鼠空白血漿，配制成質(zhì)量濃度為0.5，2.5和20.0 μg·mL-1的槐定堿血漿樣品，每個濃度6個樣品，按照2.3項(xiàng)下方法操作，另用流動相配制相同濃度的槐定堿對照品，各6份，按照2.2項(xiàng)下操作，取10 μL進(jìn)樣分析，以血漿樣品測定的峰面積與同質(zhì)量濃度的對照溶液峰面積的比值，計(jì)算絕對回收率，結(jié)果見表1。

表1槐定堿的日內(nèi)、日間精密度與回收率

Tab.1 Intra-day and inter-day precision and recovery of sophoridine

(n=6)

2.4.5穩(wěn)定性采用大鼠空白血漿配制質(zhì)量濃度為0.5，2.5和20.0 μg·mL-1的槐定堿標(biāo)準(zhǔn)血漿樣品，各6份，按照2.3項(xiàng)下方法操作，考察血漿樣品室溫放置4 和12 h，置于-70 ℃保存12 d以及樣品經(jīng)歷3次凍融后的穩(wěn)定性。結(jié)果表明，在不同的存放條件下，RSD值均小于15.0%。

2.5 槐定堿大鼠體內(nèi)藥動學(xué)考察 SD大鼠，雌雄各半，禁食12 h，自由飲水。取5只大鼠尾靜脈注射給予槐定堿溶液10 mg·kg-1，在給藥后0.08，0.17，0.25，0.5，0.75，1.0，1.5，2.0，3.0，4.0，6.0和8.0 h分別從大鼠眼眶后靜脈叢取血500 μL，置于含肝素的離心管中，以14 000 r·min-1離心10 min，取200 μL，按照2.3項(xiàng)下方法操作并測定其血藥質(zhì)量濃度，繪制血藥質(zhì)量濃度-時間曲線，結(jié)果見圖2。采用DAS 2.0軟件對所有數(shù)據(jù)進(jìn)行處理并計(jì)算其藥代動力學(xué)參數(shù)，結(jié)果見表2。

圖2 槐定堿平均血藥質(zhì)量濃度-時間曲線

Fig.2 Mean plasma concentration-time profiles of sophoridine

表2槐定堿的主要藥動學(xué)參數(shù)

Tab.2 The main pharmacokinetics pharameters of sophoridine

參數(shù)x±sAUC(0～t)/mg·h·L-110．80±2．69AUC(0～∞)/mg·h·L-112．80±2．77MRT(0～t)/h1．62±0．43MRT(0～∞)/h1．56±0．71t1/2z/h1．75±0．66tmax/h1．97±0．63CLz/L·h-1·mg-10．81±0．19Cmax/mg·L-15．56±0．78

3 討論

本實(shí)驗(yàn)以大鼠作為研究對象，采用HPLC法建立測定大鼠體內(nèi)槐定堿血藥濃度的方法。大鼠尾靜脈注射給予槐定堿后，血藥濃度下降很快，隨后下降速度變慢，體內(nèi)過程符合二室模型，動力學(xué)行為符合線性動力學(xué)過程[5]。實(shí)驗(yàn)結(jié)果與王羚酈等[6]在小鼠體內(nèi)藥物代謝動力學(xué)研究的結(jié)果相符合。

在血漿樣品的預(yù)處理中，弱堿性藥物在堿性條件下，采用有機(jī)溶劑進(jìn)行提取，可以使血漿樣品中的內(nèi)源性雜質(zhì)較少，干擾小。故本實(shí)驗(yàn)在堿性條件下，選用氯仿溶液進(jìn)行液-液萃取，其提取回收率較高,符合實(shí)驗(yàn)的測定需要。該測定方法取樣量少、操作簡單、專屬性強(qiáng)，能夠滿足槐定堿藥動學(xué)研究的要求。

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Determination of the concentration of sophoridinein rat plasma by HPLC

GAO Hua，JI Hongyan，DENG Ning，DU Wei，F(xiàn)EI Pingxia，SUN Weihong，DANG Hongwan，WEN Youmin*(Department of Pharmacy，General Hospital of Ningxia Medical University，Yinchuan 750004,China)

Abstract:ObjectiveTo establish a method for the determination of sophoridinein rat plasma by HPLC and to study its characteristics of pharmacokinetics. Method Sophoridine and internal standard matrine were extracted from rat plasma with liquid-liquid extraction，then were separated on a Synergi 4 μ Hydro-RP 80A(150 mm×4.6 mm，4.0 μm) column with a mobile phase consisted of acetonitrile and phosphate buffer(pH 3.00) (5∶95) at a flow rate of 1.0 mL·min-1.The detection wavelength was 210 nm，and the column temperature was 30 ℃. The pharmacokinetic parameters were calculated with DAS 2.0 practical pharmacokinetics program. Results The assay was linear in the range of 0.25～25 μg·mL-1( r=0. 999 7) with recoveries ranged from76.6% to 90.4% and satisfied inter- and intra- day precision. The parameters of t1/2，AUC，Cmaxfor sophoridine were 1.75±0.66 h，10.80±2.69 mg·h·L-1and 5.56±0.78 mg·L-1，respectively. Conclusion The developed method was specific, rapid and sensitive, and can be used for the determination of sophoridine inpharmacokinetic study.

Key words:sophoridine；HPLC；pharmacokinetics

(收稿日期：2015-07-02)

*通信作者：文友民，男，主任藥師

作者簡介：高華，男，主管藥師，碩士研究生

基金項(xiàng)目：寧夏醫(yī)科大學(xué)青年基金項(xiàng)目(編號：XQ2012012)

中圖分類號：945

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號：1004-2407(2016)02-0183-03

doi:10.3969/j.issn.1004-2407.2016.02.021